Name: Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprenda a técnica de indução de escarro para coleta não invasiva de amostras respiratórias em pacientes com asma, DPOC e fibrose pulmonar. Este método permite análise celular e molecular detalhada das vias aéreas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Hospital da Universidade de Liège (Liège CHU). Reconhecemos "Produções de instantes" para a produção de vídeo. Também reconhecemos o Cedric François, o paciente que apareceu no filme.

Todos os métodos descritos nesta seção foram aprovados pelo Comitê de ética do Hospital da Universidade de Liège, e todos os indivíduos saudáveis deram consentimento escrito de participação.
1. indução de escarro
<ol>
	<li>Pré e pós-broncodilatador espirometria
	<ol>
		<li>Executar uma espirometria (volume expiratório forçado em 1 segundo [VEF1] e manobra de capacidade vital forçada [VT]) de acordo com a American Thoracic Society (ATS) / sociedade respiratória Europeia (ERS) critérios padrão12.</li>
		<li>Administre 400 µ g de salbutamol inalado em um inalador de dose calibrada (MDI) através de um dispositivo de espaçador. Nota: Em adultos, os efeitos adversos do salbutamol inalado incluem tremor e taquicardia13.</li>
		<li>Repita a espirometria (VEF1 e manobra de CVF) 15 min mais tarde, de acordo com os critérios ATS/ERS12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação do nebulizador ultra sonico Nota: O nebulizador deve ser cuidadosamente limpos e desinfectado antes de cada utilização, em conformidade com as instruções do fabricante.<ol>
		<li>Encha a câmara de nebulização com água destilada até o nível recomendado.</li>
		<li>Coloca uma xícara limpa na câmara de nebulização.</li>
		<li>Cubra a taça com a tampa adequada.</li>
		<li>Encha o copo com qualquer 50 mL de solução salina hipertônica (5%) para um paciente com pós-broncodilatador VEF1 &#62; 65% previsto ou 50 mL de solução salina isotônica (0,9%) para um paciente com pós-broncodilatador VEF1≤65% previsto.</li>
		<li>Adicione 1,75 mL da solução de sulfato de salbutamol (5 mg/mL) para a Copa.</li>
		<li>Conecte os tubos e válvulas de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleção de nebulização e escarro Nota: Execute a técnica sob supervisão médica.<ol>
		<li>Explica o procedimento ao paciente.</li>
		<li>Pedir ao paciente para usar um grampo do nariz.</li>
		<li>Ligue o nebulizador e selecionar o nível mais baixo das configurações de aerossol e ventilador.</li>
		<li>Pedir ao paciente para inalar o aerossol através da peça de boca com a respiração das marés por 5 min. Nota: Aerosol e fã de configurações podem ser aumentadas dependendo da tolerância do paciente.<ol>
			<li>Em caso de tosse insuportável ou náuseas, interrompa o procedimento e vá para a etapa 1.3.5.</li>
			<li>Em caso de aperto no peito ou desconforto respiratório, vá para a etapa 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Desligue o nebulizador.</li>
		<li>Pedir ao paciente para remover o grampo do nariz, enxágue a boca com água e bochechar duas vezes antes de descartá-lo na pia. Nota: Células de Saliva podem contaminar a amostra de escarro e levar a uma amostra inutilizável.</li>
		<li>Pedir ao paciente para tossir escarro em um recipiente plástico.</li>
		<li>Execute uma espirometria (manobra expiratória forçada) para medir VEF1.</li>
		<li>Avaliar a queda de1 FEV como segue: (VEF1 medido na etapa 3.8 [mL]) - (pós-broncodilatador VEF1 medido na etapa 1.3 [mL]) / (pós-broncodilatador VEF1 medido na etapa 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>Se o VEF1 cai em 20% ou mais do valor pós-broncodilatador, interrompa o procedimento. Medida VEF1 novamente 10 min mais tarde. Se o VEF1 cai 20% ou mais, pergunte o médico administrar o brometo de ipratrópio nebulização (0,25 mg/2 mL) e manter o paciente sob observação médica. Vá para a etapa 1.3.10.</li>
			<li>Se o VEF1 não cai em 20% ou mais do valor pós-broncodilatador, repita as etapas de 3,2 a 3,9 uma a três vezes para alcançar um tempo de nebulização total de 10 a 20 min. Nota: O tempo de nebulização total dependerá (presença de fichas ou peças viscosas) de qualidade e quantidade da amostra do escarro. Se a qualidade da amostra e/ou quantidade é pobre após 10min de nebulização, o procedimento deve ser ampliado para alcançar um tempo de nebulização total de 15 a 20 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Manter a amostra de escarro refrigerada até o processamento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. escarro processamento
Nota: Processe o escarro dentro de 3 horas de amostragem para viabilidade celular ideal.
Atenção: Use um jaleco, luvas e óculos de proteção.
<ol>
	<li>Preparativos preliminares
	<ol>
		<li>Fazer uma diluição de 10 vezes da solução concentrada de ditiotreitol (agente mucolítico) com água destilada estéril para obter 10 mL de uma solução de 6,5 mM, em conformidade com as instruções do fabricante. Nota: Para evitar a solução concentrada ditiotreitol, mistura com o ar ambiente, retire a solução do frasco com agulha e seringa estéril. Uma vez aberto, o frasco de solução concentrada deve ser mantido em temperatura e usado dentro de 5 dias. A solução diluída é preparada diariamente. Atenção: Por causa do perigo de irritação de olho e pele, utilize equipamento de protecção (vestuário, luvas e óculos de proteção).</li>
		<li>Fazer uma 5-fold diluição da solução de azul de trypan (0,4%) com de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) para obter uma solução de 0,08%. Manter esta solução diluída à temperatura ambiente e usar dentro de 2 semanas. Atenção: Por causa de riscos cancerígenos, utilize equipamento de protecção (vestuário, luvas e óculos de proteção).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coleta de escarro sobrenadante
	<ol>
		<li>Transferir o escarro todo em um tubo de plástico de fundo cónico de 50 mL e pesar a amostra.</li>
		<li>Adicione um peso 3 vezes da solução DPBS.</li>
		<li>Lentamente o vórtice a amostra por 30 s.</li>
		<li>Centrifugue a 800 x g e 4 ° C por 10 min.</li>
		<li>Filtrar a amostra através de 2 simples camadas de gaze estéril e recolher o sobrenadante em um tubo de plástico de fundo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Alíquota do sobrenadante em plástico 2 mL tubos e armazená-los a-80 ° C. Nota: Amostras de sobrenadante são úteis para ensaiar componentes de fase fluida do escarro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mucolysis expectoração
	<ol>
		<li>Se necessário, adicione DPBS para o centrifugado para alcançar um volume total de suspensão de células de 5 mL.</li>
		<li>Dilua a suspensão de células com 1 volume de ditiotreitol 6,5 mM. Use um balancim de banco para agitar a suspensão de eritrócitos por 20 min em temperatura ambiente.<ol>
			<li>Repita pelo menos 3 vezes com DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de células diluído em 550 x g e 4 ° C por 10 min.</li></ol></li></ol>Desprezar o sobrenadante.
		<li>Ressuspender as células em cerca de 1 mL de DPBS.</li>
	
	
	<li>Avaliação das propriedades qualitativas da amostra do escarro (concentração de célula, a contaminação de células escamosas e viabilidade pelo método de exclusão Trypan azul) pela contagem de hemocytometer
	<ol>
		<li>Avaliar e registrar o volume exato da suspensão celular.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de suspensão de células de 50 µ l da solução de azul de trypan 0,08% e homogeneizar.</li>
		<li>Colocar a amostra sob a lamela de um hemocytometer (câmara de Thoma) e colocá-la sob o microscópio ótico (400 X).</li>
		<li>Contar as células escamosas, as vida não-escamosas células (sem cor) e as células mortas não-Carcinoma de células (células de cor azul). Nota: Em caso de densidade celular muito baixo ou muito alto, se concentrar ou diluir a suspensão de eritrócitos e repita etapas 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Avalie a concentração de células da suspensão, a percentagem de células escamosas e o percentual de viabilidade de células não-escamosas. Nota: Calcular a contagem total não-escamosas/g de escarro: célula de concentração da suspensão (passo 5.4) * volume da suspensão de eritrócitos (etapa 4.8) * % das células não-escamosas / peso da amostra do escarro (etapa 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de um manchado cytospin deslize com a suspensão de células e armazenamento de células residuais, se necessário Nota: Se a suspensão de célula contém mais de 80% de carcinoma de células células, a amostra é considerada pobre qualidade e inadequado para um cytospin slide14. Nesse caso, descontinuar o tratamento e considerar este exemplo malsucedido.<ol>
		<li>Dilua uma alíquota da suspensão celular com DPBS para obter pelo menos 350 µ l de uma suspensão de células em 500.000 células/mL.</li>
		<li>Monte o concentrador de célula em conformidade com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Encha cada um dos 3 compartimentos do concentrador de célula com 100 µ l da suspensão celular.</li>
		<li>Em um cytocentrifuge, giram por 2 min em 150 x g e temperatura de quarto. Descarte os sobrenadantes.</li>
		<li>Desmonte o concentrador de célula em conformidade com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Permitir que o slide para o ar seco. Nota: Nesta fase, células residuais podem ser armazenadas em um buffer adequado se necessário para novas experiências.</li>
		<li>Mancha o slide com uma coloração comercial kit (veja a Tabela de materiais), em conformidade com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Monte o slide com um meio de montagem apropriado e uma lamínula.</li>
		<li>Coloque a lâmina ao microscópio óptico (600 X) com a imersão de óleo.</li>
		<li>Contar pelo menos 500 células não-escamosas: neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfócitos e células epiteliais. Nota: Contagem diferencial de células é geralmente realizada por apenas um ou dois dedicados e treinados observadores para limitar interobservador discrepâncias.</li>
		<li>Registro de valores absolutos e porcentagens de cada tipo de célula.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts%3A+their+usefulness+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li>
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<li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li>
<li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum%3A+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método de escarro induzido é uma ferramenta útil para estudar o compartimento das vias respiratórias. Há várias possíveis aplicações desta técnica. Primeiro, pode melhorar o conhecimento sobre as células imunes e mecanismos envolvidos em diversas doenças respiratórias. Por exemplo, essa técnica tem permitido a investigação da inflamação das vias respiratórias em grandes coortes de pacientes, e tem sido demonstrado que cerca de metade dos pacientes asmáticos são caracterizados por um anormal das vias de inflamação eosinofílica15, 16 , 17, enquanto doentes com DPOC geralmente exibem um neutrófilo escarro levantadas contar18. Esta técnica também tem contribuído para melhor caracterização da inflamação das vias aéreas em pacientes com fibrose pulmonar idiopática e mediadores de evidências que podem contribuir para esta doença19. Em segundo lugar, a técnica de escarro induzido pode ser útil para predizer a resposta ao tratamento. Por exemplo, a presença de uma porcentagem anormal de eosinófilos escarro tem demonstrada ser um marcador preditivo de corticosteroide responsividade11,18. Em asma e DPOC, adequar a dose de corticosteroides para normalizar a percentagem de eosinófilos do escarro foi mostrado para ser mais eficaz na diminuição do número de exacerbações que o ajuste do tratamento de acordo com as actuais directrizes clínicas11 ,20,21. Em terceiro lugar, a análise do escarro pode ajudar a desenvolver terapias alvo. Por exemplo, a presença de um número anormal de neutrófilos de escarro na DPOC e alguns pacientes asmáticos tem levado ao desenvolvimento de tratamentos antineutrophilic11. Em quarto lugar, a técnica pode desempenhar um papel no diagnóstico. Por exemplo, a presença de eosinofilia de escarro é necessária fazer um diagnóstico de bronquite eosinofílica não asmática11.
Além de obter uma contagem diferencial de células, a técnica de indução de escarro também permite que o desempenho de muitas análises adicionais, ao estudar células de expectoração ou escarro sobrenadante. A análise dos mediadores8,19,22 e a avaliação da atividade quimiotáctica da amostra para eosinófilos22são exemplos com expectoração sobrenadante. De células do escarro, RNA pode ser extraído e usado para microRNA ou expressão gênica analisa19,23 . As células do escarro também podem ser analisadas pelo fluxo cytometry9,23 , que permite, entre outros, immunophenotyping e classificação de células. Além disso, escarro células podem ser cultivadas10, e sua produção do mediador pode ser medida na vitro24. É interessante notar que, neste caso, o conteúdo do mediador é diferente do que pode ser encontrado na expectoração sobrenadante. Com efeito, mediadores na expectoração sobrenadante podem ser influenciados por secreções de células residentes das vias aéreas e por exsudação de plasma, contrariando o escarro cultura celular modelo24. Finalmente, imunocitoquímica e em situ hibridação também pode ser executada usando o escarro células7.
A escarro induzido a técnica tem algumas limitações. A indução deve ser realizada sob supervisão médica. Também é essencial para o operador dar instruções completa aos pacientes. Outras limitações incluem a cooperação e a condição médica dos pacientes, que são necessários esforços respiratórios. Sobre a viabilidade desta técnica em crianças, vários estudos têm relatado que foi bem sucedida e segura em crianças com mais de 6 anos de idade25. Dados sobre crianças de &#60; 6 anos de idade estão faltando25, mas é provável que a indução de escarro é difícil de executar essas crianças14. A técnica é atualmente restrita aos serviços e centros especializados de investigação porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado1. Outra limitação é que a técnica de indução de escarro e análise não é sempre bem sucedida, significando que um cytospin legível não é sempre obtido26. No entanto, a taxa de sucesso é geralmente cerca de 80% em diferentes coortes de pacientes4,26,,27,28,29. Finalmente, o cuidado deve ser tomado quando comparando diferentes coortes de pacientes em relação a correspondência da idade, como foi mostrado para o impacto do escarro célula contagem30,31. Da mesma forma, outros parâmetros como sexo e tabaco hábitos tem que ser correspondido como eles também podem interferir com o escarro célula contagem29,32. Quando o paciente correspondência não é possível, outra maneira de considerar idade, sexo ou status de fumar é para ajustar a análise estatística para estas características.
Em comparação com outras técnicas que permitem a coleta de células de vias aéreas, como biópsias e lavado broncoalveolar lavages, o método de escarro induzido tem as vantagens de ser simples, bem tolerado, seguro, reprodutível, cost-effective e não-invasiva. Estas vantagens permitem que a técnica de escarro induzido a ser executada em grande escala e repetidamente ao longo do tempo e torná-lo uma alternativa de escolha para a amostragem das vias respiratórias. Bronchosorption é outra técnica que permite a coleta do fluido mucosa para avaliar as vias aéreas mediadores33. Enquanto esta técnica (exigindo broncoscopia) é mais invasiva do que o escarro induzido, tem as vantagens de evitar qualquer contaminação com saliva e obtenção de altas concentrações de mediadores do que na de lavagem broncoalveolar33.
Passos críticos precisam de atenção no protocolo. Primeiro, cuidado deve ser tomado sobre a concentração salina e o tempo de indução, porque esses dois parâmetros podem influenciar os resultados e, portanto, precisa ser padronizada34,35. Em segundo lugar, o mucolysis com TDT é uma etapa importante do tratamento. Em comparação com PBS, TDT foi mostrado para melhor dispersar escarro células7, que melhora a qualidade de slide cytopsin e é essencial ter uma célula pode ser reproduzido de contagem2. No entanto, o agente mucolítico pode interferir com a medição dos componentes bioquímicos.Cravação de experiências então deve ser realizado quando um novo composto bioquímico36de medição. Finalmente, uma outra etapa crítica do processo é a célula contando passo, que deve ser realizado por um técnico treinado para garantir resultados confiáveis e interpretáveis.
Um método alternativo usando fichas de escarro (peças de lêmures ou mais densas), em vez de escarro todo, também é descrito na literatura7. Ambas as técnicas têm vantagens e desvantagens. A escarro toda técnica permite mais rápido processamento7, mas é frequentemente contaminada com saliva, o que dilui a amostra e pode reduzir a qualidade do cytospins2,7. Com a técnica de seleção de plug, a contaminação da saliva é reduzida, o que significa que as amostras são muitas vezes de melhor qualidade para a dosagem dos mediadores da fase fluida e cytospin slides7. O processamento é no entanto mais7 e plugues selecionadas podem não ser representativa da amostra inteira37. É também interessante notar que nem todas as amostras contêm plugues, que podem ser um fator limitante. Ambos os métodos são validados e podem ser reproduzidos, e atualmente não há nenhuma evidência de que a contagem de células diferenciais obtidas de ambos esses métodos é diferentes de14,38.
No futuro, escarro induzido pode ser usado como uma ferramenta clínica para fornecer biomarcadores para a investigação, diagnóstico e gerenciamento de todos os tipos de doenças respiratórias inflamatórias.

Vários métodos são usados para investigar a inflamação das vias aéreas: direto de medições (como biópsias brônquicas ou lavado broncoalveolar lavages) e métodos indirectos (como sintoma, avaliação, testes de função de análise e pulmão de amostra de sangue)1. As técnicas diretas têm a vantagem de avaliar confiantemente a inflamação das vias aéreas, mas são invasiva e não viável em grande escala por causa do desconforto do paciente e o risco incorrido1. Quanto os métodos indirectos, eles mal se correlacionar com a avaliação direta da inflamação de vias aéreas1.
Coleta de escarro é outra maneira de amostras de células das vias aéreas e permite a avaliação direta da inflamação das vias aéreas. No entanto, produzir expectoração espontânea pode levar a amostras de má qualidade e não é possível para todos os pacientes2. Esta questão foi superada com o uso de nebulização ultra-sônica solução salina hipertônica para induzir a produção de expectoração2. Esse método foi inicialmente usado em pacientes infectados com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) para o diagnóstico de pneumonia por Pneumocystis carinii pneumonia3 e foi adaptado para indivíduos saudáveis e asmáticos em 19924. Indução de escarro também é viável em pacientes mais graves com o uso de solução salina isotônica5. Embora geralmente bem tolerado, a inalação de solução salina pode causar broncoespasmo em pacientes com hyperresponsive vias aéreas5. Portanto, é aconselhável administrar um agonista beta de ação curta antes do procedimento1. Além disso, mostramos anteriormente que adicionar salbutamol para a solução salina no nebulizador ultra-sônico diminuiu ainda mais este risco6. As vantagens da indução de escarro é que é não-invasivo2 e seguro quando apropriado precauções5.
Para o processamento de amostras de escarro, dois métodos são atualmente usados na literatura: a técnica de escarro toda e a ficha de seleção7. Em nosso laboratório, é realizada a técnica de escarro de todo. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar o tipo de inflamação presente no lúmen das vias aéreas. No entanto, muitas análises adicionais também são possíveis investigar processos inflamatórios e mecanismos imunes, estudando mediadores no escarro sobrenadante8 ou por meio de investigação detalhada em células de escarro (por exemplo, , fluxo cytometry9, culturas de células10, genómica10, proteomics10, imunocitoquímica7, in situ da hibridação7, etc)
A técnica de indução de escarro e análise está atualmente limitada a Pesquisar serviços e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado1. Inflamação das vias respiratórias pode ser investigada com este método para várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou de fibrose pulmonar idiopática11.

<table><tbody><tr><td>Espirômetro - Spirobank</td><td>MIR France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>Veja o medicamento disponível no país</td></tr><tr><td>Nebulizador UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb Copos Descartáveis & Tampas</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Bacteriano DeVilbiss Para Nebulizadores UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas Unidirecionais</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas Unidirecionais</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol T-connector&nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>Circuito de ventilação monobranch corrugado</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&nbsp;</td><td>Produzido</td><td></td> <td>pela nossa farmácia hospitalar</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0,9%</td><td>B.Braun Medical&nbsp; Diegem Bélgica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de salbutamol 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>Ver medicamento disponível no país</td></tr><tr><td>Brometo de ipratrópio 0,25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Alemanha</td><td>CNK: 1543-305</td><td>Ver medicamento disponível no país</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>LONZA Bélgica</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de esputolisina</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4% solução 100 mL</td><td>Hemocitômetro LONZA Bio Whittaker Bélgica</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>- Câmara Thoma</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coloração Hemacolor</td><td>Merck Bélgica</td><td>1116610001</td><td>Produto alternativo: Conjunto de coloração Diff Quik &nbsp; Medion Diagnostic&nbsp;</td></tr><tr><td>Montagem média - Entellan</td><td>Merck Bélgica</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Bélgica</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

A técnica de indução de escarro e processamento é um método não-invasivo reconhecido, permitindo a coleta e a análise das células das vias aéreas, o que é interessante em várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou fibrose pulmonar idiopática. Esta técnica é bem tolerado, seguro e não invasivo, mas está atualmente limitada a serviços de pesquisa e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado. A taxa de sucesso de indução de escarro e análise é cerca de 80%.
Aqui, descrevemos a indução e laboratório de processamento de amostras de escarro. Expectoração é induzida por inalação de solução salina hipertônica ou isotônica com salbutamol. Para o processamento, nós usamos a técnica de escarro de todo. Ditiotreitol (DTT) é usado para permitir que o mucolysis de amostras de escarro. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar os tipos de células presentes no lúmen das vias aéreas. Análises adicionais podem ser efectuadas na expectoração sobrenadante e as células do escarro, que podem permitir a investigação sobre processos inflamatórios e mecanismos imunes. Exemplos incluem estudando mediadores na expectoração sobrenadante e realizando um amplo espectro de análise em células de escarro como citometria de fluxo, genômica ou proteômica.
Finalmente, apresentam-se resultados representativos de análise do escarro em doentes com DPOC, asmáticos e controles saudáveis.

Hemocytometer Uma imagem típica é mostrada na Figura 1 que é visualizado com o microscópio usando o hemocytometer. Células escamosas são facilmente identificadas, como eles são muito maiores do que as células não-escamosas. Estas células escamosas são células epiteliais, vindo da boca. Os dois tipos de células estão manchados pelo azul Trypan quando morto. Cuidado deve ser tomado para evitar a contagem de leveduras, bactérias e sucata.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
Figura 1 : Hemocytometer imagens mostrando (A) a vida não-escamosas, (B) um morto não-escamosas e (C) um carcinoma de células células. Barra de escala = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Cytospin slide: a Figura 2 mostra uma imagem representativa de um slide cytospin obtido após o processamento do escarro. Os diferentes tipos de células (neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfócitos e células epiteliais) podem ser diferenciados por meio de sua morfologia e coloração. Em alguns casos, a contaminação por células escamosas pode ser importante e, se a percentagem de células escamosas é superior a 80%, a amostra é considerada mal sucedida (Figura 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
Figura 2 : Imagens de slide Cytospin mostrando (A) um neutrófilo, (B) um macrófago, (C) um eosinófilo, (D) um linfócito e (E) uma célula epitelial. Barra de escala = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
Figura 3 : Exemplo de um slide de cytospin de má qualidade com &gt; 80% de células escamosas. Barra de escala = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Taxa de sucesso No nosso departamento, a taxa de sucesso do procedimento (combinando uma indução bem sucedida e um cytospin legível), com base em uma amostra de 1.129 pacientes (indivíduos saudáveis, asmáticos ou pacientes DPOC), é de 82% (924/1.129). Em uma análise de sub de acordo com o tipo de pacientes, a taxa de sucesso é de 75% (57/76) em indivíduos saudáveis, 82% (827/1.004) em asmáticos e 82% (40/49) em doentes com DPOC.
Resultados em indivíduos saudáveis Em uma análise retrospectiva de uma série de 289 indivíduos saudáveis do nosso departamento, a mediana (intervalo interquartil) peso de escarro foi 3,72 g (intervalo interquartil de 2,46 g - 5,54 g) e a mediana total não-escamosas contagem/g de escarro foi 0,59 x 106 ( intervalo interquartil de 0,37 x 106 - 1,29 x 106).
Os indivíduos saudáveis, a proporção de células escamosas é baixa em 19% (10% - 34%) e a viabilidade é alta em 66% (54-78%). Sobre o percentual dos diferentes tipos de células, os resultados estão resumidos na Figura 4A. Podemos observar que a porcentagem de macrófagos (49% [31-68%]) é maior do que a porcentagem de neutrófilos (34% [14% - 60%]), enquanto as percentagens de linfócitos (2% [1-3%]), eosinófilos (0% [0-0%]) e células epiteliais (4% [2-11%]) são baixas. Estes resultados são semelhantes quando os dados são expressos em valores absolutos (Figura 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
Figura 4 : Resultados representativos da contagem diferencial de células observadas em indivíduos saudáveis expressaram em percentagens (A) ou (B) valores absolutos. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Também é importante ter em conta a idade dos pacientes. Na verdade, uma forte correlação está presente entre a idade do paciente e a proporção de neutrófilos em amostras de escarro (Figura 5). Da mesma forma, quando a classificação dos pacientes segundo grupos de idade de 10 anos (Figura 6), observamos um aumento significativo da percentagem de neutrófilos, com o aumento da faixa etária. Portanto, essa variável deve ser considerada ao comparar resultados de diferentes coortes, e cuidado deve ser tomado na correspondência de assuntos.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
Figura 5: Correlação entre idade e escarro porcentagem de neutrófilos. Calculou-se a correlação com o teste de Spearman. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
Figura 6: Evolução da percentagem dos neutrófilos de acordo com a categoria de idade. O p-valor de ANOVA foi &lt; 0,0001 para a comparação da porcentagem de neutrófilos entre classes de idade. Várias comparações foram feitas com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Os p-valores são representados como segue: * p &lt; 0.05, * * p &lt; 0,01, e * * * p &lt; 0.001. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Resultados em pacientes que sofrem de doenças respiratórias A técnica de escarro induzido é comumente usada para avaliar o perfil de células inflamatórias em pacientes asmáticos.Esta técnica também pode ser aplicada para pacientes que sofrem de DPOC, outra doença respiratória inflamatória. Ao comparar indivíduos saudáveis, asmáticos e DPOC (os 3 grupos sendo pareados por idade, sexo e hábitos de tabaco), observamos que o perfil de células inflamatórias é bem diferente entre estas coortes (Figura 7). De fato, pacientes asmáticos são geralmente caracterizados por eosinófilos escarro levantadas, enquanto a proporção de neutrófilos de escarro é geralmente superior em doentes com DPOC em comparação com controles saudáveis, que está relacionada com a severidade da doença.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
Figura 7 : Perfil de células inflamatórias escarro de indivíduos saudáveis (n = 45), os pacientes asmáticos (n = 108) e doentes com DPOC (n = 54). Os três grupos foram pareados por sexo, idade e hábitos de tabaco. Os p-valores da ANOVA foram &lt; 0,05, &lt; 0,0001, e &lt; 0,0001 para a comparação de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos entre grupos, respectivamente. Várias comparações foram feitas com o teste de comparações múltiplas de Dunn. Os p-valores são representados como segue: * p &lt; 0,05 e * * * p &lt; 0.001. Os resultados são mostrados como mediana (intervalo interquartil). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.

Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

A técnica de escarro induzido foi desenvolvida no início dos anos 90. A técnica foi proposta para investigar novas informações sobre doenças obstrutivas das vias aéreas, como asma, DPOC e, mais recentemente, tem havido interesse também em examinar novas informações sobre fibrose pulmonar. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente não invasiva, ao contrário da broncoscopia.O processamento requer trabalho de laboratório e leva tempo, por isso é bastante exigente, demorado e precisa ter alguma experiência no laboratório, por isso é claramente uma técnica difícil de obter em todos os centros. A técnica de escarro induzido é composta por duas partes, a primeira parte é a indução e a segunda parte é o processamento. Antes de induzir o escarro, precisamos realizar uma espirometria, que é uma avaliação do volume e da taxa de fluxo que o paciente é capaz de produzir.E precisamos fazer isso porque a indução do escarro por si só pode causar bronquioespasmo, então precisamos saber o valor basal da espirometria dos pacientes. Então, primeiro realizamos uma espirometria, depois damos broncodilatadores aos pacientes, geralmente administramos 400 microgramas de salbutamol, para abrir ao máximo as vias aéreas dos pacientes e também para evitar um bronquioespasmo que pode ocorrer durante a fase de indução. E depois de 15 minutos, medimos novamente a espirometria, para ter o que chamamos de valor basal da espirometria e, em particular, olhamos para o VEF1, que é o volume que o paciente é capaz de expirar em um segundo.Despeje água destilada na câmara do nebulizador até o nível recomendado. Coloque um copo limpo na câmara do nebulizador. Cubra a tampa cheia com a tampa apropriada.Encha o copo com 50mL de solução salina hipertônica 5% se o VEF1 pós-broncodilatador for maior que 65% do previsto, ou 50mL de solução salina isotônica 9% se o VEF1 pós-broncodilatador for menor que 65% do previsto. Adicione 1,75 solução de sulfato de salbutamol na concentração de cinco miligramas por ml ao copo. Conecte os tubos e válvulas de acordo com as instruções do fabricante.A técnica deve ser realizada sob supervisão médica. Explique o princípio do teste ao paciente. Peça ao paciente para usar um clipe nasal.Inicie o nebulizador e selecione o nível mais baixo de aerossol e configuração do ventilador. Peça ao paciente para inalar o aerossol pelo bocal com a respiração corrente. O nível de aerossol e configuração do ventilador pode ser aumentado dependendo da tolerância do paciente.Em caso de aperto no peito ou desconforto respiratório, interrompa o procedimento e realize uma espirometria para medir o valor do VEF1 do paciente. Após os cinco minutos de inalação, ou em caso de tosse ou náusea, pare o nebulizador. Peça ao paciente para remover o clipe nasal, enxaguar a boca e gargarejar duas vezes com água da torneira e descartar essa água na pia.Então, como o paciente tossir escarro e cuspir o que está saindo da garganta em um recipiente de plástico. Realize a primeira manobra respiratória para medir o VEF1. Após cada tentativa de produção de escarro, medimos o valor do VEF1.Se o valor do VEF1 cair mais de 20%, interrompemos o procedimento e damos aos pacientes nebulização de brometo de ipratrópio, que é um anticolinérgico que atuará em combinação com beta-dois agonistas que já administramos durante o procedimento. Se o valor do VEF1 não cair mais de 20%, continuamos o procedimento por um tempo total de 10 a 20 minutos, de acordo com a qualidade e o volume de escarro produzido pelo paciente. Depois de obter a amostra de expectoração, mantenha-a na geladeira até o processamento.Portanto, a segunda parte consiste no processamento do escarro e, para isso, temos primeiro que preparar as duas soluções que vamos usar para esse processamento. Portanto, temos que preparar o Ditiotreitol, também conhecido como TDT. A solução deve ser preparada por diluição da TDT com água estéril para obter uma solução de 6,5 milimolares.Portanto, você deve evitar expor o TDT ao ar ambiente, e para isso usamos seringa e agulha. Em segundo lugar, você deve preparar a solução de azul de tripano, e para isso você deve fazer uma diluição de DPBS com azul de tripano, para obter uma solução de 0,08%Portanto, em relação ao escarro, você deve transferir todo o escarro em um tubo de plástico de fundo cônico de 50mL e pesar a amostra. Adicione um peso triplo de solução de DPBS.Lentamente, vórtice a amostra por 30 segundos, centrifugue a 800 g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante em um tubo de plástico de fundo cônico de 50 mL, após filtração através de duas camadas únicas de gaze estéril. Aloque o sobrenadante em tubos plásticos de 2mL e armazene a 80 graus Celsius negativos.Observe que as amostras sobrenadantes são úteis para nós como componente trifásico do escarro. Se o volume do palete de células for inferior a 5mL, adicione DPBS para atingir um volume de 5mL de suspensão de células. Diluir a suspensão celular com um volume de TDT a 6,5 milimolares.Balance a suspensão da célula por 20 minutos em temperatura ambiente com um trabalhador de bancada. Diluir a suspensão celular pelo menos três vezes com a SPD. Centrifugar a suspensão de células diluídas a 550 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante. Suspenda a paleta de células em cerca de um ml de DPBS. Avalie e registre o volume exato da suspensão celular.Adicionar 50 microlitros de suspensão celular a 50 microlitros da solução diluída de azul de tripano e homogeneizar. Coloque a amostra sob a lamínula de um citômetro hemocil e coloque-a sob um microscópio óptico. Avalie a concentração celular da suspensão celular, a porcentagem de células escamosas e a porcentagem de viabilidade de células não escamosas.Diluir uma alocação da suspensão com DPBS para obter pelo menos 350 microlitros de suspensão celular a 500.000 células por mL. Monte o concentrador de células de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 100 microlitros da suspensão celular em cada um dos três compartimentos do concentrador de células.Centrifugar dois minutos a 150 g à temperatura ambiente numa centrífuga citogénica. Descarte o sobrenadante. Deixe o slide secar ao ar.Pinte a corrediça com div quick ou um kit de coloração de valência de níquel de acordo com as instruções do fabricante. Monte com um suporte de montagem e lamínula. Coloque a lâmina sob o microscópio óptico com imersões em óleo.Conte pelo menos 500 células não escamosas, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfócitos e células epiteliais, e registre os valores absolutos e a porcentagem e o tipo de célula. Em relação aos resultados, usando o hemocitômetro, temos que contar as células vivas não escamosas que não são coloridas. Além disso, as células mortas não escamosas que são coloridas em azul.E as células escamosas. Essas células são células epiteliais que vêm da boca. Eles são grandes, por isso são fáceis de reconhecer em comparação com as pequenas células humanas.Portanto, você deve evitar também contar bactérias, leveduras ou sucata. Se a suspensão celular contiver mais de 80% de células escamosas, esta amostra é considerada de baixa qualidade e inadequada para uma lâmina de citospina. Esta amostra é, portanto, considerada infrutífera.A contagem no citospin corado é realizada de acordo com a cor das células e sua morfologia. Os neutrófilos, a principal característica é o núcleo multilobulado que facilitou a identificação das células. Essas células são redondas, pequenas e coloridas em rosa neutro.Os eosinófilos, essas células são compostas por grânulos vermelhos, fáceis de identificar. O tamanho dessas células é próximo ao dos neutrófilos. Os macrófagos, eles são duas a cinco vezes maiores que os neutrófilos e são coloridos em azul.O citoplasma pode conter detritos e vacúolos. Os linfócitos, essas células são redondas e pequenas, coloridas de azul e possuem um núcleo grande e denso. As células do epitélio têm formato colunar, são coloridas de rosa e geralmente apresentam cílios no topo.Aqui estão alguns exemplos de amostras de citospin ilegíveis com mais de 80% de células escamosas. Eu acho que é uma técnica que é muito útil, porém a gente tem que ser muito cauteloso porque a indução do escarro deve ser feita sob supervisão médica, mas a técnica de indução do escarro dá muita informação sobre o estado inflamatório dos pacientes nas vias aéreas. Ele pode permitir que você meça diferentes marcadores bioquímicos no sobrenadante, e você também pode medir coisas diferentes nas partes celulares, de modo que o escarro induzido permite realizar citometria de fluxo, proteômica, transcriptômica e até genômica.

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