Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento
17 de dezembro de 2017
Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.
A técnica de escarro induzido foi desenvolvida no início dos anos 90. A técnica foi proposta para investigar novas informações sobre doenças obstrutivas das vias aéreas, como asma, DPOC e, mais recentemente, tem havido interesse também em examinar novas informações sobre fibrose pulmonar. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente não invasiva, ao contrário da broncoscopia.
O processamento requer trabalho de laboratório e leva tempo, por isso é bastante exigente, demorado e precisa ter alguma experiência no laboratório, por isso é claramente uma técnica difícil de obter em todos os centros. A técnica de escarro induzido é composta por duas partes, a primeira parte é a indução e a segunda parte é o processamento. Antes de induzir o escarro, precisamos realizar uma espirometria, que é uma avaliação do volume e da taxa de fluxo que o paciente é capaz de produzir.
E precisamos fazer isso porque a indução do escarro por si só pode causar bronquioespasmo, então precisamos saber o valor basal da espirometria dos pacientes. Então, primeiro realizamos uma espirometria, depois damos broncodilatadores aos pacientes, geralmente administramos 400 microgramas de salbutamol, para abrir ao máximo as vias aéreas dos pacientes e também para evitar um bronquioespasmo que pode ocorrer durante a fase de indução. E depois de 15 minutos, medimos novamente a espirometria, para ter o que chamamos de valor basal da espirometria e, em particular, olhamos para o VEF1, que é o volume que o paciente é capaz de expirar em um segundo.
Despeje água destilada na câmara do nebulizador até o nível recomendado. Coloque um copo limpo na câmara do nebulizador. Cubra a tampa cheia com a tampa apropriada.
Encha o copo com 50mL de solução salina hipertônica 5% se o VEF1 pós-broncodilatador for maior que 65% do previsto, ou 50mL de solução salina isotônica 9% se o VEF1 pós-broncodilatador for menor que 65% do previsto. Adicione 1,75 solução de sulfato de salbutamol na concentração de cinco miligramas por ml ao copo. Conecte os tubos e válvulas de acordo com as instruções do fabricante.
A técnica deve ser realizada sob supervisão médica. Explique o princípio do teste ao paciente. Peça ao paciente para usar um clipe nasal.
Inicie o nebulizador e selecione o nível mais baixo de aerossol e configuração do ventilador. Peça ao paciente para inalar o aerossol pelo bocal com a respiração corrente. O nível de aerossol e configuração do ventilador pode ser aumentado dependendo da tolerância do paciente.
Em caso de aperto no peito ou desconforto respiratório, interrompa o procedimento e realize uma espirometria para medir o valor do VEF1 do paciente. Após os cinco minutos de inalação, ou em caso de tosse ou náusea, pare o nebulizador. Peça ao paciente para remover o clipe nasal, enxaguar a boca e gargarejar duas vezes com água da torneira e descartar essa água na pia.
Então, como o paciente tossir escarro e cuspir o que está saindo da garganta em um recipiente de plástico. Realize a primeira manobra respiratória para medir o VEF1. Após cada tentativa de produção de escarro, medimos o valor do VEF1.
Se o valor do VEF1 cair mais de 20%, interrompemos o procedimento e damos aos pacientes nebulização de brometo de ipratrópio, que é um anticolinérgico que atuará em combinação com beta-dois agonistas que já administramos durante o procedimento. Se o valor do VEF1 não cair mais de 20%, continuamos o procedimento por um tempo total de 10 a 20 minutos, de acordo com a qualidade e o volume de escarro produzido pelo paciente. Depois de obter a amostra de expectoração, mantenha-a na geladeira até o processamento.
Portanto, a segunda parte consiste no processamento do escarro e, para isso, temos primeiro que preparar as duas soluções que vamos usar para esse processamento. Portanto, temos que preparar o Ditiotreitol, também conhecido como TDT. A solução deve ser preparada por diluição da TDT com água estéril para obter uma solução de 6,5 milimolares.
Portanto, você deve evitar expor o TDT ao ar ambiente, e para isso usamos seringa e agulha. Em segundo lugar, você deve preparar a solução de azul de tripano, e para isso você deve fazer uma diluição de DPBS com azul de tripano, para obter uma solução de 0,08%Portanto, em relação ao escarro, você deve transferir todo o escarro em um tubo de plástico de fundo cônico de 50mL e pesar a amostra. Adicione um peso triplo de solução de DPBS.
Lentamente, vórtice a amostra por 30 segundos, centrifugue a 800 g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante em um tubo de plástico de fundo cônico de 50 mL, após filtração através de duas camadas únicas de gaze estéril. Aloque o sobrenadante em tubos plásticos de 2mL e armazene a 80 graus Celsius negativos.
Observe que as amostras sobrenadantes são úteis para nós como componente trifásico do escarro. Se o volume do palete de células for inferior a 5mL, adicione DPBS para atingir um volume de 5mL de suspensão de células. Diluir a suspensão celular com um volume de TDT a 6,5 milimolares.
Balance a suspensão da célula por 20 minutos em temperatura ambiente com um trabalhador de bancada. Diluir a suspensão celular pelo menos três vezes com a SPD. Centrifugar a suspensão de células diluídas a 550 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante. Suspenda a paleta de células em cerca de um ml de DPBS. Avalie e registre o volume exato da suspensão celular.
Adicionar 50 microlitros de suspensão celular a 50 microlitros da solução diluída de azul de tripano e homogeneizar. Coloque a amostra sob a lamínula de um citômetro hemocil e coloque-a sob um microscópio óptico. Avalie a concentração celular da suspensão celular, a porcentagem de células escamosas e a porcentagem de viabilidade de células não escamosas.
Diluir uma alocação da suspensão com DPBS para obter pelo menos 350 microlitros de suspensão celular a 500.000 células por mL. Monte o concentrador de células de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 100 microlitros da suspensão celular em cada um dos três compartimentos do concentrador de células.
Centrifugar dois minutos a 150 g à temperatura ambiente numa centrífuga citogénica. Descarte o sobrenadante. Deixe o slide secar ao ar.
Pinte a corrediça com div quick ou um kit de coloração de valência de níquel de acordo com as instruções do fabricante. Monte com um suporte de montagem e lamínula. Coloque a lâmina sob o microscópio óptico com imersões em óleo.
Conte pelo menos 500 células não escamosas, neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, linfócitos e células epiteliais, e registre os valores absolutos e a porcentagem e o tipo de célula. Em relação aos resultados, usando o hemocitômetro, temos que contar as células vivas não escamosas que não são coloridas. Além disso, as células mortas não escamosas que são coloridas em azul.
E as células escamosas. Essas células são células epiteliais que vêm da boca. Eles são grandes, por isso são fáceis de reconhecer em comparação com as pequenas células humanas.
Portanto, você deve evitar também contar bactérias, leveduras ou sucata. Se a suspensão celular contiver mais de 80% de células escamosas, esta amostra é considerada de baixa qualidade e inadequada para uma lâmina de citospina. Esta amostra é, portanto, considerada infrutífera.
A contagem no citospin corado é realizada de acordo com a cor das células e sua morfologia. Os neutrófilos, a principal característica é o núcleo multilobulado que facilitou a identificação das células. Essas células são redondas, pequenas e coloridas em rosa neutro.
Os eosinófilos, essas células são compostas por grânulos vermelhos, fáceis de identificar. O tamanho dessas células é próximo ao dos neutrófilos. Os macrófagos, eles são duas a cinco vezes maiores que os neutrófilos e são coloridos em azul.
O citoplasma pode conter detritos e vacúolos. Os linfócitos, essas células são redondas e pequenas, coloridas de azul e possuem um núcleo grande e denso. As células do epitélio têm formato colunar, são coloridas de rosa e geralmente apresentam cílios no topo.
Aqui estão alguns exemplos de amostras de citospin ilegíveis com mais de 80% de células escamosas. Eu acho que é uma técnica que é muito útil, porém a gente tem que ser muito cauteloso porque a indução do escarro deve ser feita sob supervisão médica, mas a técnica de indução do escarro dá muita informação sobre o estado inflamatório dos pacientes nas vias aéreas. Ele pode permitir que você meça diferentes marcadores bioquímicos no sobrenadante, e você também pode medir coisas diferentes nas partes celulares, de modo que o escarro induzido permite realizar citometria de fluxo, proteômica, transcriptômica e até genômica.
Visão Geral
Este artigo descreve a técnica de indução de escarro, um método não invasivo usado para coletar amostras de escarro para análise em doenças respiratórias. O protocolo inclui etapas detalhadas para o processamento do escarro para realizar contagens celulares diferenciais e coletar o sobrenadante para estudos adicionais.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Medicina Respiratória
- Técnicas Clínicas
- Análise Celular
Fundo
- Técnica de escarro induzido desenvolvida no início dos anos 90.
- Usado para investigar doenças obstrutivas das vias aéreas como asma e DPOC.
- Interesse recente em fibrose pulmonar.
- Alternativa não invasiva à broncoscopia.
Propósito do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para indução e processamento de escarro.
- Facilitar a coleta de amostras de escarro para análise celular.
- Aprimorar a compreensão das doenças respiratórias através da análise de escarro.
Métodos Usados
- Realizar espirometria para avaliar a função pulmonar basal.
- Administrar broncodilatadores para prevenir broncoespasmo durante a indução.
- Induzir escarro usando solução salina hipertônica e nebulização.
- Processar amostras de escarro para contagem celular diferencial e coleta de sobrenadante.
Principais Resultados
- Coleta bem-sucedida de amostras de escarro para análise.
- Metodologia detalhada para o processamento de escarro descrita.
- Avaliação da viabilidade e concentração celular alcançada.
Conclusões
- A técnica de indução de escarro é eficaz para coleta não invasiva de amostras.
- O processamento adequado do escarro é crucial para uma análise precisa.
- Este protocolo pode auxiliar na pesquisa e diagnóstico clínico de doenças respiratórias.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Sputum induction and processing provide a non-invasive method for collecting airway cells and supernatant, enabling mechanistic studies of inflammatory pathways in respiratory diseases. This approach supports target validation by delivering quantitative cellular and biochemical data from the lung microenvironment, which is critical for de-risking hypotheses in asthma, COPD, and fibrosis research. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by bridging clinical sample analysis with functional target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell populations (neutrophils, eosinophils, macrophages, lymphocytes, epithelial cells) in airway lumen.
- Operational Value: Provides reproducible differential cell counts and viability assessments using standardized hemocytometer and trypan blue exclusion methods.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through analysis of sputum supernatant for mediators and cellular components for flow cytometry, genomics, or proteomics.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (cell suspension and supernatant) for downstream assays with defined processing steps including DTT mucolysis and centrifugation.
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs such as cell concentration (target: 500,000 cells/mL) and viability percentage, enabling assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Facilitates screening readiness through supernatant storage at -80°C for biomarker analysis and cell concentrator use for slide preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical continuity by analyzing inflammatory cell profiles in disease-relevant systems (asthma, COPD, pulmonary fibrosis).
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions via quality control thresholds (e.g., <80% squamous cells) to ensure sample suitability for cytospin and downstream analysis.
- Scientific Value: Highlights translational biomarker alignment by enabling measurement of biochemical markers in supernatant and cellular phenotypes linked to disease mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting airway inflammation analysis and biomarker-enabled target prioritization in respiratory disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cell types and mediators in induced sputum, reflecting airway inflammatory status.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized processing: DTT dilution (6.5 mM), trypan blue staining (0.08%), centrifugation (800 g and 550 g), and cell concentration adjustment to 500,000 cells/mL.
- Analytics: Enables comparative analysis via differential cell counting (neutrophils, eosinophils, etc.), viability assessment, and supernatant collection for biochemical marker measurement.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cell profiling in asthma, COPD, and fibrosis, supporting biomarker alignment and mechanism validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal inflammatory monitoring and target validation across respiratory indications via standardized sputum induction and processing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through quantitative inflammatory profiling and reduction of mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via defined reagent concentrations (DTT 6.5 mM, trypan blue 0.08%), centrifugation parameters, and cell concentration targets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by providing early human-relevant inflammatory data from non-invasive sampling.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reproducible cell differentials and supernatant biomarker levels indicating target engagement or pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, cell handling, and microscopic analysis for accurate spirometry, induction monitoring, and cell counting.
- Needs nebulization equipment, centrifuge (800 g and 550 g), hemocytometer, cytocentrifuge, and -80°C storage for supernatant preservation.
- Demands cross-team standardization of processing steps: DTT preparation avoiding air exposure, trypan blue dilution, saline selection based on post-bronchodilator FEV1, and timed mucolysis (20 min rocking).
- Involves adaptation considerations: saline tonicity (5% hypertonic or 9% isotonic) adjusted to patient FEV1, and processing modifications if cell pellet volume <5 mL (DPBS supplementation).
- Includes practical limitations: technical demand, time consumption, need for medical supervision, and sample exclusion if squamous cells >80% indicating oral contamination.
