Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula StarPEG heparinizado
23 de junho de 2018
Este protocolo destina-se a alcançar a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula e os grupos amina do Ilhéu membrana celular.
Este método pode ajudar a resolver os principais desafios no transplante de ilhotas pancreáticas, como imuno-rejeição, revascularização de ilhotas pós-transplante e sobrevida. As principais vantagens desta técnica é que esta abordagem fácil de adotar permite a engenharia de superfície de células vivas, remodelando a paisagem celular da ilhota pancreática, melhorando a função do enxerto, a sobrevida e, finalmente, a eficácia terapêutica do transplante de ilhotas. As implicações dessa técnica se estendem às terapias baseadas em células porque o resultado terapêutico das terapias baseadas em células também é limitado pela baixa retenção celular e baixa sobrevida.
Demonstrando este procedimento está Jingyi Yang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Primeiro, pese 6,9 gramas de heparina e dissolva-a em 2 mililitros de água deionizada gelada em um tubo Eppendorf. Dissolva 0,23 gramas de NHS em 0,5 mililitros de água deionizada gelada em um tubo Eppendorf.
Em seguida, dissolva 0,77 gramas de EDC em 0,5 mililitros de água deionizada gelada em um tubo cônico de 50 mililitros. Misturar as soluções NHS e EDC num tubo cónico de 50 mililitros. Depois de deixar a solução misturada à temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugue-a a 12 000 RPM durante 10 minutos para remover o excesso de EDC e NHS.
Em seguida, adicione 30 mililitros de etanol frio à solução e centrifugue a 12.000 RPM por 10 minutos. Agora, adicione 1 mililitro de auxílio 10% starPEG MI a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 0,67 mililitros de solução de NHS de heparina a 10% ao mesmo tubo cônico de 50 mililitros.
Coloque a solução misturada em uma incubadora a 25 graus Celsius por 20 minutos para obter uma solução viscosa e clara. Escolha manualmente 200 ilhotas de camundongo previamente extraídas sob um microscópio de dissecação e transfira para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de PBS às ilhotas e centrifugue a 1.200 RPM por um minuto a quatro graus centígrados.
Remova o sobrenadante, adicione 250 microlitros da solução de heparina PEG e coloque a mistura no gelo por 10 minutos. Pipete para cima e para baixo para permitir que as ilhotas se misturem bem com a solução de heparina PEG. Em seguida, centrifugue a mistura a 1.200 rpm por um minuto.
Em seguida, remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Após centrifugação a 1 200 rpm durante um minuto, retirar o sobrenadante e conservar os ilhéus para utilização posterior.
Em seguida, adicione um a dois mililitros de RPM I 1640, suplementado com 10% FBS às ilhotas revestidas. E transfira essas ilhotas para uma placa de cultura bacteriana estéril não carregada. Finalmente, observe a morfologia e os sinais fluorescentes das ilhotas revestidas com FAM-Heparin-PEG sob um microscópio de fluorescência invertida.
Picos característicos de heparina, correspondentes aos grupos HYDROXAL, foram observados no espectro FTIR do nanorevestimento de heparina-PEG. A diminuição da amplitude desses picos representa a conjugação entre os grupos amida de auxílio estrela-PEG MI e o grupo carbonal da heparina. O pico correspondente à vibração de estiramento carbônico da amida também foi reduzido, indicando reação suficiente entre os grupos carboxilato de heparina com o suxsonato succinimidal e a amina auxiliar estrela-PEG MI.
A varredura de dados de microscopia eletrônica mostra a estrutura porosa altamente interconectada do nanorevestimento de heparina-PEG, sugerindo que ele pode ser adequado para a sobrevivência celular durante a entrega in vivo. Uma fina camada de nanorevestimento, mostrada por fluorescência verde, foi depositada uniformemente na superfície das ilhotas revestidas, sem causar alterações evidentes no volume ou tamanho das ilhotas. A ilhota de camundongo revestida com heparina-PEG exibiu viabilidade robusta da ilhota em cultura.
A formação vascular significativamente mais avançada foi evidente a partir de células endoteliais de ilhotas que foram co-cultivadas com ilhotas revestidas de heparina-PEG, indicadas por estruturas alongadas semelhantes a microvasos e estruturas vasculares semelhantes a redes. Um baixo nível de secreção de insulina foi observado em todos os grupos de tratamento quando as ilhotas foram perfundidas com uma solução salina fisiológica, suplementada com um nível subestimulatório de glicose. Quando as ilhotas foram estimuladas com um nível superfisiológico de glicose, foi observado um aumento na secreção de insulina.
Uma vez dominado, o revestimento pode ser feito em um minuto se for executado corretamente para preservar a viabilidade das ilhotas.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas usando um nanorevestimento starPEG incorporado com heparina. Esta técnica visa melhorar os resultados do transplante de ilhotas, aumentando a função e sobrevivência do enxerto.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Terapias baseadas em células
- Biologia do transplante
- Engenharia de superfície
Fundamentos
- O transplante de ilhotas pancreáticas enfrenta desafios como imuno-rejeição e baixa sobrevivência das ilhotas.
- Melhorar o panorama celular das ilhotas pode aumentar a eficácia terapêutica.
- O nanorevestimento de heparina-PEG oferece uma solução potencial para esses desafios.
- Este método é fácil de adotar e pode ser realizado rapidamente.
Propósito do Estudo
- Desenvolver uma técnica de revestimento que melhore a sobrevivência e função das ilhotas pancreáticas.
- Abordar questões relacionadas à baixa retenção celular em terapias baseadas em células.
- Demonstrar a eficácia do nanorevestimento de heparina-PEG na melhoria dos resultados do transplante de ilhotas.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções de heparina e NHS.
- Mistura de soluções de NHS e EDC para nanorevestimento.
- Revestir ilhotas de camundongos com a solução de heparina-PEG.
- Observação da morfologia e viabilidade das ilhotas sob microscópio de fluorescência.
Principais Resultados
- As ilhotas revestidas com heparina-PEG mostraram melhor viabilidade em cultura.
- Formação vascular aprimorada foi observada em células endoteliais de ilhotas co-cultivadas.
- A secreção de insulina foi responsiva à estimulação com glicose em ilhotas revestidas.
- O revestimento não alterou significativamente o volume ou o tamanho das ilhotas.
Conclusões
- O nanorevestimento de heparina-PEG é um método promissor para melhorar o transplante de ilhotas.
- Esta técnica pode aumentar a eficácia das terapias baseadas em células.
- Aplicações futuras podem se estender a outros tipos celulares que necessitam de engenharia de superfície.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starPEG nanocoating addresses critical barriers in cell-based therapies, including immuno-rejection and poor graft survival. This platform enables functional modification of living cell surfaces, supporting improved transplantation outcomes and translational continuity. The approach offers a scalable, mild, and adaptable solution for enhancing cell viability and therapeutic efficacy in preclinical and discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune-modulatory strategies for cell-based therapy targets.
- Supports biological de-risking by preserving islet viability and function post-coating.
- Facilitates predictive confidence in cell survival and engraftment for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, surface-engineered islets for downstream functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of islet viability and insulin secretion.
- Enables reliable evaluation of immune protection and vascularization in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for islet transplantation and immune response studies.
- Supports continuity from in vitro engineering to in vivo transplantation validation.
- Provides mechanistic de-risking for cell retention and survival in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanocoating method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage hypothesis testing and enabling robust preclinical validation of cell-based therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for immune evasion and graft survival mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs for islet viability and function.
- Analytics: Provides measurable readouts such as insulin secretion and vascularization metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro engineering with in vivo transplantation studies for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various cell types and functional mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell survival and immune protection.
- Operational Value: Standardizes cell surface engineering with minimal impact on cell viability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for cell therapy candidates and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, surface chemistry, and nanocoating techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and analytical instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in islet preparation and coating.
- Adaptable to different cell types and functional mediators as supported by platform design.
- Practical limitations include maintaining cell viability and ensuring uniform coating coverage.
