Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula StarPEG heparinizado

Este método pode ajudar a resolver os principais desafios no transplante de ilhotas pancreáticas, como imuno-rejeição, revascularização de ilhotas pós-transplante e sobrevida. As principais vantagens desta técnica é que esta abordagem fácil de adotar permite a engenharia de superfície de células vivas, remodelando a paisagem celular da ilhota pancreática, melhorando a função do enxerto, a sobrevida e, finalmente, a eficácia terapêutica do transplante de ilhotas. As implicações dessa técnica se estendem às terapias baseadas em células porque o resultado terapêutico das terapias baseadas em células também é limitado pela baixa retenção celular e baixa sobrevida.

Demonstrando este procedimento está Jingyi Yang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Primeiro, pese 6,9 gramas de heparina e dissolva-a em 2 mililitros de água deionizada gelada em um tubo Eppendorf. Dissolva 0,23 gramas de NHS em 0,5 mililitros de água deionizada gelada em um tubo Eppendorf.

Em seguida, dissolva 0,77 gramas de EDC em 0,5 mililitros de água deionizada gelada em um tubo cônico de 50 mililitros. Misturar as soluções NHS e EDC num tubo cónico de 50 mililitros. Depois de deixar a solução misturada à temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugue-a a 12 000 RPM durante 10 minutos para remover o excesso de EDC e NHS.

Em seguida, adicione 30 mililitros de etanol frio à solução e centrifugue a 12.000 RPM por 10 minutos. Agora, adicione 1 mililitro de auxílio 10% starPEG MI a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 0,67 mililitros de solução de NHS de heparina a 10% ao mesmo tubo cônico de 50 mililitros.

Coloque a solução misturada em uma incubadora a 25 graus Celsius por 20 minutos para obter uma solução viscosa e clara. Escolha manualmente 200 ilhotas de camundongo previamente extraídas sob um microscópio de dissecação e transfira para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de PBS às ilhotas e centrifugue a 1.200 RPM por um minuto a quatro graus centígrados.

Remova o sobrenadante, adicione 250 microlitros da solução de heparina PEG e coloque a mistura no gelo por 10 minutos. Pipete para cima e para baixo para permitir que as ilhotas se misturem bem com a solução de heparina PEG. Em seguida, centrifugue a mistura a 1.200 rpm por um minuto.

Em seguida, remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Após centrifugação a 1 200 rpm durante um minuto, retirar o sobrenadante e conservar os ilhéus para utilização posterior.

Em seguida, adicione um a dois mililitros de RPM I 1640, suplementado com 10% FBS às ilhotas revestidas. E transfira essas ilhotas para uma placa de cultura bacteriana estéril não carregada. Finalmente, observe a morfologia e os sinais fluorescentes das ilhotas revestidas com FAM-Heparin-PEG sob um microscópio de fluorescência invertida.

Picos característicos de heparina, correspondentes aos grupos HYDROXAL, foram observados no espectro FTIR do nanorevestimento de heparina-PEG. A diminuição da amplitude desses picos representa a conjugação entre os grupos amida de auxílio estrela-PEG MI e o grupo carbonal da heparina. O pico correspondente à vibração de estiramento carbônico da amida também foi reduzido, indicando reação suficiente entre os grupos carboxilato de heparina com o suxsonato succinimidal e a amina auxiliar estrela-PEG MI.

A varredura de dados de microscopia eletrônica mostra a estrutura porosa altamente interconectada do nanorevestimento de heparina-PEG, sugerindo que ele pode ser adequado para a sobrevivência celular durante a entrega in vivo. Uma fina camada de nanorevestimento, mostrada por fluorescência verde, foi depositada uniformemente na superfície das ilhotas revestidas, sem causar alterações evidentes no volume ou tamanho das ilhotas. A ilhota de camundongo revestida com heparina-PEG exibiu viabilidade robusta da ilhota em cultura.

A formação vascular significativamente mais avançada foi evidente a partir de células endoteliais de ilhotas que foram co-cultivadas com ilhotas revestidas de heparina-PEG, indicadas por estruturas alongadas semelhantes a microvasos e estruturas vasculares semelhantes a redes. Um baixo nível de secreção de insulina foi observado em todos os grupos de tratamento quando as ilhotas foram perfundidas com uma solução salina fisiológica, suplementada com um nível subestimulatório de glicose. Quando as ilhotas foram estimuladas com um nível superfisiológico de glicose, foi observado um aumento na secreção de insulina.

Uma vez dominado, o revestimento pode ser feito em um minuto se for executado corretamente para preservar a viabilidade das ilhotas.