Name: Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula StarPEG heparinizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Aprenda a engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas usando nanocápsula StarPEG heparinizada. Esta técnica melhora a viabilidade, função do enxerto e eficácia terapêutica em transplantes de ilhotas.

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Agradecemos o apoio financeiro do fundos nacionais de ciências naturais da China (31770968) e a Tianjin pesquisa programa de Application Foundation e Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. fabricação de heparina-incorporada Starpeg nanocápsula
<ol><li>
Síntese de succinato de grufo de heparina (heparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesar 0,69 g de heparina e dissolver em 2,0 mL de água destilada gelada.</li>
		<li>Pesar 0,23 g de NHS e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.</li>
		<li>Pesar 0,77 g de EDC e dissolver em 0,5 mL de água desionizada gelada num balão de fundo redondo.</li>
		<li>Misture as soluções NHS e EDC num balão de fundo redondo. Deixe a solução mista no banco na temperatura ambiente por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugue a mistura de EDC NHS no 5.031 x g durante 10 minutos remover o excesso de EDC e NHS.</li>
		<li>Adicione 30 mL de álcool etílico frio para a mistura solução e centrifugar 5.031 x g por 10 min.<ol>
<li>Repita duas vezes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de nanocápsula starPEG-heparina
	<ol>
<li>Adicione 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 para um balão de fundo redondo.</li>
		<li>Adicione 0,67 mL de heparina de 10% (p/v)-NHS no mesmo balão de fundo redondo.</li>
		<li>Coloque a solução mista de starPEG-(NH2)8 e heparina-NHS na incubadora a 25 ° C por 20 min obter uma solução clara com viscosidade. Nota: Para experimentos em que se exigia fluorescente etiquetada heparina (FAM-heparina), o processo de fabricação é o mesmo exceto que a estrela de (NH2) - PEG -8 foi dissolvido em água desionizada, suplementada com 5(6)- carboxyfluorescein N- succinimidil éster 0.1% (razão molar) de starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterização de heparina-PEG nanocápsula por Fourier Transform espectroscopia no infravermelho (FT-IR)
	<ol>
<li>Antes de começar, lave o dispositivo de almofariz, pilão e granulação de ágata (pequenos discos com diâmetro de 13 mm) com acetona e água deionizada. Seque o vidro em um forno antes do uso.</li>
		<li>Amostra de heparina-PEG Mix aproximadamente 0,1 – 1% com 200 – 250 mg de pó fino de KBr.</li>
		<li>Coloque a mistura de KBr e heparina-PEG o almofariz de ágata e pulverizar finamente em pequenas pelotas com diâmetros de 2 µm.</li>
		<li>Transfira a mistura para um dispositivo de granulação. Aplica força de compressão elevada (8 T/cm2) em um vácuo por 1 – 2 min formar pelotas transparentes.</li>
		<li>Puxe gentilmente as pelotas de amostra longe o dispositivo de granulação. Tenha cuidado para não puxar demais para não se incorrer em rachaduras.</li>
		<li>Transferi as pelotas de amostra com muito cuidado para um Fourier Transform Infrared espectroscópio para determinar a estrutura química de amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame das estruturas internas porosas de heparina-PEG nanocápsula por microscopia eletrônica de varredura (SEM)
	<ol>
<li>Para os procedimentos a seguir, prepare-se pipetas e placa de cultura de células de 48-bem padrão.</li>
		<li>Pipete a solução de copolímero de heparina-PEG para os poços de uma placa de cultura de 48-bem.</li>
		<li>Congele a placa a-80 ° C por 24 h.</li>
		<li>Lypophilize as amostras a-50 ° C, em ambiente de vácuo (0,1 Pa) por 24 h.</li>
		<li>Espalhe as amostras através da superfície pegajosa de um esboço de alumínio.</li>
		<li>Revestir as amostras com ouro e observar sob o microscópio de elétron digitalizado para observar estruturas porosas internas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame da superfície de nanocápsula de heparina-PEG por microscopia de força atômica (AFM)
	<ol>
<li>Limpar as lâminas de vidro de sílica com solução de piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C por 40 min.</li>
		<li>Proceda à sonicação os slides em metanol por 10min e depois em tolueno por 10 min.</li>
		<li>Seca as lâminas por secagem a vácuo.</li>
		<li>Lave os slides com abundância solução 3-aminopropil-triethoxysilane (2% em tolueno), agite.</li>
		<li>Proceda à sonicação os slides em metanol por 10 min depois em tolueno por 10 min.</li>
		<li>Lugar de 100 µ l de solução de heparina-PEG 3% em toda a superfície dos slides usando uma pipeta padrão.</li>
		<li>Examinar a superfície de heparina-PEG sob um microscópio de força atômica (uma frequência ressonante de 50 a 80 kHz, força constante de 0.350 N m 21, raio de ponta de 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mouse ilhéu engenharia de superfície com heparina-PEG nanocápsula
<ol><li>
Revestimento de superfície do mouse ilhéu com heparina-PEG nanocápsula
	<ol>
<li>Extrato de ilhotas do mouse pelo colagenase digestão e histopaque gradiente purificação como anteriormente relatada em JoVE19.</li>
		<li>Escolher 200 ilhotas sob um microscópio de dissecação de um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de PBS para os ilhéus e centrifugar 503 x g por 1 min.</li>
		<li>Tire o sobrenadante e adicionar 250 µ l da solução de heparina-PEG e manter a mistura no gelo durante 10 min. pipeta acima e para baixo para permitir que os ilhéus misturar bem com a solução de heparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugar 503 x g por 1 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e adicionar 500 µ l de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.</li>
		<li>Centrifugar a 503 x g por 1 min e remover o sobrenadante e manter os ilhéus para utilização posterior. Para exame de ilhotas do mouse revestido com heparina-PEG, FAM-heparina-PEG foi usado para o revestimento de ilhéu seguindo estas etapas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exame das ilhotas do mouse revestido com a nanocápsula FAM-heparina-PEG
	<ol>
<li>Adicionar 1 a 2 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal para os ilhéus revestidos e transferir estas ilhotas em um prato de cultura bacteriana estéril não carregada.</li>
		<li>Observe os sinais de FAM-heparina-PEG revestido nanocápsula Ilhéus sob um microscópio de fluorescência invertido morfologia e fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. função de heparina-PEG revestido Mouse ilhotas comparadas com ilhotas não revestidos
<ol><li>
Viabilidade de heparina-PEG revestido ilhotas de rato
	<ol>
<li>Escolher a 20 dos ilhéus rato heparina-PEG revestido e colocá-los em um poço de uma placa de cultura de células 96 poços.</li>
		<li>Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de rato de heparina-PEG revestido para cada poço.</li>
		<li>Escolher 20 das ilhotas de noncoated controle e colocá-los em um poço da placa de cultura de células 96 poços mesmo.</li>
		<li>Preencha um total de 10 poços com 20 ilhotas de noncoated de controle para cada poço.</li>
		<li>Colocar 200 µ l de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino em cada poço da placa de 96 poços que contém ilhotas e manter em cultura, durante 14 dias.</li>
		<li>Substitua o ilhéu de meios de cultura em 2 dias.</li>
		<li>Trate os ilhéus com um vivo/morto kit de coloração no final de 14 dias em cultura e observada sob um microscópio de fluorescência invertido.</li>
		<li>Contar células de PI+ (vermelho) dentro de cada ilhota debaixo de um microscópio de fluorescência invertido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularização de heparina-PEG revestido de ilhotas de rato em vitro
	<ol>
<li>Pré-fixe todos os plásticos experimentais incluindo placa de cultura e pontas da pipeta pelo menos 12 h antes da utilização.</li>
		<li>Coloque um lugar 24-bem uma ventoinha. Adicionar 250 µ l de gelo frio Matrigel reduzida de fator de crescimento em cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços. Coloque a placa de 24 poços revestida a 4 ° C, durante pelo menos 30 min.</li>
		<li>Enquanto a solução de matriz é pôr na geladeira, trypsinize rato ilhota pancreatic milha Sven 1 (MS1) células endoteliais.<ol>
<li>Remova o frasco de cultura de tecidos, todos os meios de cultura. Lave o balão com 5 mL de PBS.</li>
			<li>Remover a PBS e adicionar 3 mL de EDTA-tripsina. Incube a 37 ° C por 3 min em uma incubadora padrão.</li>
			<li>Bata levemente o fundo do frasco para separar as células e adicionar 5 mL de soro-completada a mídia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Tire o sobrenadante e adicionar 5 mL de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar mídia DMEM soro-completados no tubo e semear 50.000 células em cada poço da placa de 24 poços matriz-solução-revestido.</li>
		<li>Adicione 5 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de noncoated de controle para cada poço.</li>
		<li>Adicione mídia DMEM soro-completada em cada poço para um total de 500 µ l por bem.</li>
		<li>Observe a formação do tubo após 4h e 24 h de incubação sob um microscópio de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secreção de insulina glicose-estimulada de ilhotas de heparina-PEG revestido Nota: Para avaliar se a nanocápsula afetaria a função das ilhotas de rato, foi avaliada a secreção de insulina glicose-estimulada de heparina-PEG revestido e ilhotas de noncoated.<ol>
<li>Escolher 30 ilhotas de heparina-PEG revestido ou ilhotas de controle noncoated em um tubo de 1,5 mL. Prepare um total de 10 tubos para revestido ilhotas e Ilhéus noncoated cada.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de solução salina fisiológica, suplementada com 2 mmol/L glicose20 e incubar a 37 ° C por 2 h. Nota: Para a receita da solução salina fisiológica, por favor consulte a tabela 1. Mantenha a tampa dos tubos soltos durante a incubação na incubadora.</li>
		<li>Remova a solução tanto quanto possível.</li>
		<li>Estimula a Ilhéus, adicionando 600 µ l de solução salina fisiológica suplementado com 20 glicose mmol/L a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Colete 200 µ l do sobrenadante de cada tubo para quantificação de ELISA usando uma insulina comercial ELISA kit de insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, demonstramos uma abordagem "fácil-para-adotar" para viver uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula de engenharia de superfície celular e a grupos amina da membrana de superfície de ilhotas pancreáticas. De facto, os grupos aminoácidos dentro das membranas celulares são altamente reativos e como consequência, estudos anteriores relataram interações entre grupos aminoácidos primários com registrados N- hydroxysuccinimidyl (NHS) éster sob condições fisiológicas14 ,16,21. Além disso, extensa pesquisa tem relatado que incorporação de heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatado e importante componente da matriz extracelular, durante o encapsulamento do Ilhéu, poderia levar a reforçada pós-transplante revascularização do miocárdio e redução IBMIR22,23. Considerando a biocompatibilidade de PEG e multivalentes Propriedades de heparina, usamos 8-armado PEG para heparina máxima de carregamento durante a fabricação da nanocápsula. Heparina foi modificada com -NHS, que posteriormente reagiria com os grupos de2 -NH na membrana celular de ilhéu. Permitindo a formação de ligação covalente entre -NH2 (membrana celular) e -NHS de Hep-PEG, os ilhéus iria ser prontamente "revestidos" pelo PEG heparina-incorporada, formando assim uma camada fina nano (nanocápsula) sobre a superfície externa do pâncreas Ilhéus.
A presente abordagem é diferente de métodos anteriormente publicados que também selecionou PEG como polímero principal para microencapsulação ilhéu nisso Chemistry de pseudo-opaco entre o -SNS (da nanocápsula) e -NH2 da célula ilhéu utilizou-se a membrana. Considerando que a estabilidade da ilha/célula revestimento, especialmente em um ambiente complexo como o plasma, é crucial para revascularização pós-transplante e sobrevivência, a formação entre -NHS e -NH2 seria mais estável em relação ao interação hidrofóbica entre a PEG e membrana celular24, interações eletrostáticas9,15,24,25,26 ou ligação biológica entre a biotina streptavidin14.
Além disso, em contraste com o ilhéu do revestimento que se baseia na abordagem LBL com período de tratamento estendido ilhéu para deposição de várias camadas14,16,25, a técnica presente também requer mínima processamento e muito curto período de revestimento dos ilhéus isolados. Ambos esses fatores são essenciais para a sobrevivência do Ilhéu pós-transplante desde viabilidade de ilhotas é frequentemente já comprometido isolamento ilhéu seguintes devido ao ECM danificado durante a digestão enzimática. No entanto, uma limitação da abordagem actual é que, ao contrário da LBL, através do qual a espessura do revestimento exterior podia ser controlada aumentando ou reduzindo o número de deposição de camada, espessura de nanocápsula o Hep-PEG não pode ser adaptada para o momento.
Além disso, devido à condição suave, onde a reação química entre o NHS - e -NH2 tem lugar, a abordagem actual é aplicável para a célula viva superfície engenharia não limitada de ilhotas pancreáticas, mas a maioria de terapia celular. Além disso, Considerando que a heparina é conhecida por interagir com uma variedade de citocinas e moléculas biologicamente ativas, a nanocápsula Hep-PEG também apresenta uma plataforma aberta que tem o potencial para a incorporação de mediadores biológicos ilimitadas, bem como interfaces para célula mais complexa engenharia de superfície.

O efeito terapêutico de terapias baseadas em células é limitado pela célula baixa retenção e sobrevivência pobre1,2. A fim de melhorar o resultado das terapias celulares, celular engenharia de superfície através de manipulação enzimática, conjugação de peptídeo, opaco química e físico encapsulamento com biomateriais tem sido explorado3,4, 5,6,7,8,9,10. O protocolo atual pretende atingir engenharia de superfície das células vivas, usando um método de "fácil-para-adotar" aplicando uma nanocápsula ultrafinos heparina-incorporada starPEG (heparina-PEG) à superfície da célula. Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas foi apresentada aqui como um exemplo devido a heterogeneidade das ilhotas de Langerhans e os resultados depreciativos da transplantação de ilhéu clínica atual.
Com efeito, ilhéu clínica transplante é atualmente realizado por injecção directa de ilhotas isoladas para a veia porta hepática e este procedimento só está disponível para pacientes seletivos por causa da escassez de materiais do doador e baixa eficácia terapêutica 11. convencionalmente, alginato tem sido o biomaterial mais comumente usado para o encapsulamento de ilhéu e modificação da superfície, embora seja menos que o ideal devido à instabilidade química do alginato e fibrose inflamatória relacionados12, 13. Além disso, em comparação com o tamanho natural de Ilhéus que varia entre 100 a 200 µm, as microcápsulas de alginato-ilhéu são maiores, variando entre 400 e 800 µm, que excedam a distância de difusão fisiológica de oxigênio. Encapsulamento de conformal ilhéu, ou seja., encapsulando ilhotas sem alteração significativa do volume de ilhota, foi então desenvolvido. Assim, a deposição de nanomembranes composto de PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicone ou nanocápsula multi-camadas (também conhecido como a técnica de "camada por camada" [LBL]) tem sido relatada, resultando em sobrevivência melhorada em vitro ilhéu14 ,15,16,17,18, embora a LBL abordagem muitas vezes requer ilhotas extensas período entregando para deposição de várias camadas, o que pode comprometer a viabilidade do Ilhéu . Além disso, a instabilidade do nanomembranes que se baseia em eletrostáticas ou covalentes interações entre camadas biomembrane ou interações hidrofóbicas entre nanomembranes e a superfície da ilha também gera preocupações9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Outro fator limitante que dificulta o resultado terapêutico do transplante de ilhotas intraportal é a instant mediada por sangue reação inflamatória (IBMIR) causada por contato direto de ilhotas implantados com sangue, resultando em agregação plaquetária, coagulação e efeito adverso imune ou ativação celular indesejadas9. Para resolver esses problemas, uma nanocápsula ultra fina composta de glicol de polietileno em forma de estrela (starPEG) foi preparada pela sua biocompatibilidade estabelecida e versatilidade como ilhéu material da carcaça. Heparina, um glicosaminoglicano altamente sulfatada, também foi incorporada na nanocápsula starPEG por suas propriedades anti-inflamatórias, anticoagulantes e capacidade de facilitar a vascularização através do recrutamento de fatores de crescimento angiogênico pro22, 23.

<table><tbody><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozototina</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Dissociação Celular</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Solução de D-(+)-Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 faloidina</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V / PI kit de apoptose</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase de Clostridium, Tipo XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8 braços PEG</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100 5</td><td></td></tr><tr><td>(6)-carboxifluoresceína N-succinimidyl éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil-trietoxissilano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>tolueno</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração viva/morta</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, matriz de membrana basal, fator de crescimento reduzido</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, 99,5%</td> <td>J& K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio, 99%, extra puro</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio, 99,7%, reagente ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado, 99%, reagente ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio, 99%, extra puro</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnésio heptahidratado, 99%, para análise</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Solução volumétrica de cloreto de cálcio, 1,0 M CaCl2</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA de Insulina de Rato/Camundongo</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula starpeg heparinizado

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Engenharia de superfície celular pode proteger implantado as células de ataque imune do hospedeiro. Ela também pode remodelar a paisagem celular para melhorar a função do enxerto e pós-transplante de sobrevivência. Este protocolo pretende atingir a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula ultrafinos starPEG heparina-incorporada (Hep-PEG). Para gerar a nanocápsula Hep-PEG para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas, succinato de grufo de heparina (heparina-NHS) foi sintetizado pela primeira vez modificação dos seus grupos carboxilato usando N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etil carbodiimida cloridrato de (EDC) e N- Hidroxisuccinimida (NHS). A mistura de Hep-PEG formou-se então por reticulação do starPEG de oito-armados de final-acrescida de amino (starPEG-(NH2)8) e heparina-NHS. Para o revestimento de superfície ilhéu, ilhotas de rato foram isoladas através de digestão de colagenase e purificação gradiente usando Histopaque. Ilhotas isoladas, em seguida, foram tratadas com solução fria de Hep-PEG gelo durante 10 minutos permitir a ligação covalente entre o SNS e os grupos amina da membrana celular de ilhéu. Nanocápsula com o Hep-PEG incorre mínima alteração do tamanho do Ilhéu e volume e heparinização dos ilhéus com Hep-PEG podem também reduzir instantânea reação inflamatória mediada por sangue durante o transplante de ilhotas. Esta abordagem "fácil-para-adotar" é ameno o suficiente para a engenharia de superfície de células vivas sem comprometer a viabilidade celular. Considerando que a heparina demonstrou afinidade de ligação para várias citocinas, a nanocápsula Hep-PEG também fornece uma plataforma aberta que permite a incorporação de mediadores biológicos funcionais ilimitados e superfícies multi-camadas para viver superfície celular bioengenharia.

A nanocápsula de heparina-PEG foi sintetizada pela conjugação de starPEG-(NH2)8 e heparina usando EDC e NHS como acoplamento agentes (Figura 1). Estrutura química da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por FT-IR e como mostrado na Figura 2, Picos característicos de heparina podem ser observados em 3.300 – 3.600 cm-1, correspondente aos grupos hidroxila de heparina (Figura 2 vermelho). A diminuição da amplitude do pico em 3.300 – 3.600 cm-1 (Figura 2 azul) representa a conjugação entre a starPEG-(NH2)8 grupos amida e grupo carbonila de heparina. Amplitude de pico 1.650 cm-1 corresponde a amida carbonila vibrações de alongamento também foi reduzida, indicando a reação suficiente entre os grupos carboxilato de heparina com succinato de grufo e amina de starPEG-(NH2) 8. estrutura de superfície da nanocápsula de heparina-PEG foi examinada por microscopia de força atômica e é mostrado de Lou et al, a nanocápsula era aproximadamente 30 nm de altura e 2 µm de largura com pequenas características porosas (manchas escuras) que vão entre 100 a 200 nm em diâmetro10. Dados obtidos de microscopia eletrônica de varredura também confirmam a estrutura porosa altamente interconectada da cavilha de heparina (Figura 3), sugerindo que poderia ser apropriado para a sobrevivência da pilha durante a entrega em vivo.
Revestimento de superfície de ilhotas isoladas de rato foi examinado e conforme apresentado na Figura 4, uma camada fina de nanocápsula, mostrada por fluorescência verde foi depositada uniformemente através da superfície de ilhotas revestidas sem causar alterações evidentes na ilhota tamanho/volume. Durante o revestimento, é recomendável manter as ilhotas no gelo para manter a sua viabilidade. Da mesma forma, o período de revestimento, 10 min neste caso, foi também otimizado para permitir a manutenção da viabilidade de Ilhéus. É interessante notar que para melhor observação da nanocápsula, microscopia de elétron que examina as secções transversais de ilhotas revestidas como relatado anteriormente9,16 seria mais adequada, embora os dados seria gerados de ilhotas fixas e incorporadas em vez de viver ilhotas na cultura.
Relativamente à sobrevivência e função das ilhotas revestidas, revascularização ilhéu e funções em foram avaliados in vitro. Considerando as propriedades benéficas da heparina, functionalization de heparina para a superfície da ilha poderia facilitar a revascularização ilhéu da cultura e, consequentemente, a sua sobrevivência. Temos observado que os ilhéus de rato de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto na cultura (Figura 5). Significativamente mais avançado formação vascular era também evidente a partir de células endoteliais ilhéu (MS1) que co foram cultivadas com heparina-PEG revestido ilhotas, indicadas por estruturas microvessel alongadas e rede-como estruturas vasculares (Figura 6 ).
O processo de nanocápsula incorridos sem capacidade de secretoras de insulina glicose-estimulada com efeito dos ilhéus heparina-PEG revestido. Baixo nível de secreção de insulina foi observado em todos os grupos de tratamento quando ilhéus foram perfundidos com solução salina fisiológica, suplementada com sub-stimulatory nível de glicose (2 mmol/L; A Figura 7). Quando ilhéus foram estimulados com um nível suprafisiológica da glicose (glicose de 20 mmol/L), observou-se aumento da secreção de insulina em todos os grupos de tratamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Estrutura química da Hep-PEG nanocápsula para engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas. Revestimento de ilhéu foi conseguido através da reticulação ligações covalente entre o NHS de heparina e aminas primárias dentro da membrana celular e estrela - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina possui vários grupos carboxila, que foram modificados para ter um grupo de NHS cada. Os grupos carboxila NHS-ativado irão reagir com aminas primárias de proteína para ligações amida de formulário, através do qual é estabilizada nanocápsula de Hep-PEG e ilhotas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Espectro infravermelho da estrela - PEG-(NH2)8, heparina e Hep-PEG nanocápsula em seco estado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de Hep-PEG no estado seco digitalizadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Imagens representativas de heparina-PEG revestido Ilhéus sob microscópio de fluorescência. Heparina foi previamente rotulada com FAM (mostrado em verde). Imagens são representativos de 100 ilhotas. Barra de escala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Ilhotas de heparina-PEG revestido exibiram viabilidade ilhéu robusto. (A) dados apresentados como média erro-padrão do meio, n = 50 ilhotas por grupo. (B) as células vivas foram mostradas em células e inoperante em vermelho. Barra de escala = 100 µm. imagens são representante de 50 ilhotas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Heparina-PEG nanocápsula facilita intrailhéu revascularisation. Formação de tubo Matrigel de células MS1 co cultivadas com heparina-PEG revestido Ilhéus e ilhotas de noncoated controle. Imagens foram tiradas do bar 4 e 24 h. escala = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Heparina-PEG nanocápsula incorre em nenhuma mudança na função de secreção de insulina ilhéu. Heparina-PEG revestido de Ilhéus e ilhotas noncoated controle (30 cada) foram expostas a 2 mmol/L (barra branca) ou 20 glicose mmol/L (barra preta) por 30 min. a secreção de insulina em resposta a 20 glicose mmol/L foi comparável entre o revestido e ilhotas de controle. Dados são mostrados como média ± erro padrão de meios, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo destina-se a alcançar a superfície engenharia de ilhotas pancreáticas usando uma nanocápsula starPEG heparina-incorporada através de pseudo-opaco química entre os grupos N- hidroxisuccinimida a nanocápsula e os grupos amina do Ilhéu membrana celular.

Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula StarPEG heparinizado

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

Este método pode ajudar a resolver os principais desafios no transplante de ilhotas pancreáticas, como imuno-rejeição, revascularização de ilhotas pós-transplante e sobrevida. As principais vantagens desta técnica é que esta abordagem fácil de adotar permite a engenharia de superfície de células vivas, remodelando a paisagem celular da ilhota pancreática, melhorando a função do enxerto, a sobrevida e, finalmente, a eficácia terapêutica do transplante de ilhotas. As implicações dessa técnica se estendem às terapias baseadas em células porque o resultado terapêutico das terapias baseadas em células também é limitado pela baixa retenção celular e baixa sobrevida.Demonstrando este procedimento está Jingyi Yang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Primeiro, pese 6,9 gramas de heparina e dissolva-a em 2 mililitros de água deionizada gelada em um tubo Eppendorf. Dissolva 0,23 gramas de NHS em 0,5 mililitros de água deionizada gelada em um tubo Eppendorf.Em seguida, dissolva 0,77 gramas de EDC em 0,5 mililitros de água deionizada gelada em um tubo cônico de 50 mililitros. Misturar as soluções NHS e EDC num tubo cónico de 50 mililitros. Depois de deixar a solução misturada à temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugue-a a 12 000 RPM durante 10 minutos para remover o excesso de EDC e NHS.Em seguida, adicione 30 mililitros de etanol frio à solução e centrifugue a 12.000 RPM por 10 minutos. Agora, adicione 1 mililitro de auxílio 10% starPEG MI a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 0,67 mililitros de solução de NHS de heparina a 10% ao mesmo tubo cônico de 50 mililitros.Coloque a solução misturada em uma incubadora a 25 graus Celsius por 20 minutos para obter uma solução viscosa e clara. Escolha manualmente 200 ilhotas de camundongo previamente extraídas sob um microscópio de dissecação e transfira para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de PBS às ilhotas e centrifugue a 1.200 RPM por um minuto a quatro graus centígrados.Remova o sobrenadante, adicione 250 microlitros da solução de heparina PEG e coloque a mistura no gelo por 10 minutos. Pipete para cima e para baixo para permitir que as ilhotas se misturem bem com a solução de heparina PEG. Em seguida, centrifugue a mistura a 1.200 rpm por um minuto.Em seguida, remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de PBS. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Após centrifugação a 1 200 rpm durante um minuto, retirar o sobrenadante e conservar os ilhéus para utilização posterior.Em seguida, adicione um a dois mililitros de RPM I 1640, suplementado com 10% FBS às ilhotas revestidas. E transfira essas ilhotas para uma placa de cultura bacteriana estéril não carregada. Finalmente, observe a morfologia e os sinais fluorescentes das ilhotas revestidas com FAM-Heparin-PEG sob um microscópio de fluorescência invertida.Picos característicos de heparina, correspondentes aos grupos HYDROXAL, foram observados no espectro FTIR do nanorevestimento de heparina-PEG. A diminuição da amplitude desses picos representa a conjugação entre os grupos amida de auxílio estrela-PEG MI e o grupo carbonal da heparina. O pico correspondente à vibração de estiramento carbônico da amida também foi reduzido, indicando reação suficiente entre os grupos carboxilato de heparina com o suxsonato succinimidal e a amina auxiliar estrela-PEG MI.A varredura de dados de microscopia eletrônica mostra a estrutura porosa altamente interconectada do nanorevestimento de heparina-PEG, sugerindo que ele pode ser adequado para a sobrevivência celular durante a entrega in vivo. Uma fina camada de nanorevestimento, mostrada por fluorescência verde, foi depositada uniformemente na superfície das ilhotas revestidas, sem causar alterações evidentes no volume ou tamanho das ilhotas. A ilhota de camundongo revestida com heparina-PEG exibiu viabilidade robusta da ilhota em cultura.A formação vascular significativamente mais avançada foi evidente a partir de células endoteliais de ilhotas que foram co-cultivadas com ilhotas revestidas de heparina-PEG, indicadas por estruturas alongadas semelhantes a microvasos e estruturas vasculares semelhantes a redes. Um baixo nível de secreção de insulina foi observado em todos os grupos de tratamento quando as ilhotas foram perfundidas com uma solução salina fisiológica, suplementada com um nível subestimulatório de glicose. Quando as ilhotas foram estimuladas com um nível superfisiológico de glicose, foi observado um aumento na secreção de insulina.Uma vez dominado, o revestimento pode ser feito em um minuto se for executado corretamente para preservar a viabilidade das ilhotas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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