Alto Throughput, absoluta determinação do conteúdo de uma proteína selecionada em níveis de tecido usando quantitativa Dot Blot Analysis (QDB)

Este método pode ser chamado de ELISA no nível do tecido para se distanciar da quantificação semiquantitativa relativa tradicional do conteúdo de proteínas nos níveis celular e tecidual, que é a norma no laboratório de pesquisa e no campo do diagnóstico clínico atualmente. As principais vantagens dessa técnica podem ser descritas em três palavras: alto rendimento, quantitativa e absoluta. Se tivéssemos que acrescentar outra palavra, seria simples.

As implicações desta técnica se estendem ao campo da proteômica, enquanto a verificação dos biomarcadores pode ser alcançada em formato de alto rendimento. Este método tem amplas aplicações em toda a pesquisa e campo clínico. A quantificação da quantidade de proteína nos níveis celular e tecidual ainda é primitiva no momento.

De um modo geral, os indivíduos novos neste método não enfrentarão problemas para aprender esta técnica e é bastante básica e requer habilidades mínimas de laboratório para ser executada. Estamos entusiasmados em demonstrar sua confiabilidade, simplicidade e precisão da técnica usando o modelo animal. As amostras podem ser preparadas com qualquer método tradicional de preparação de amostras usando qualquer tampão de lise comumente usado no laboratório de pesquisa com ou sem detergente como MP40 ou Triton X.In nosso caso, usamos o tampão de lise Triton X.

Coloque uma fatia de tecido de cinco a 100 miligramas em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de lise suplementado com inibidores de protease e fosfatase. Em seguida, homogeneizar o tecido com um homogeneizador por um minuto no gelo.

Em seguida, centrifugue a amostra por 10 minutos a 8.000 vezes g a quatro graus Celsius. Recolher o sobrenadante para novos tubos e retirar um microlitro para medir a quantidade total de proteína no lisado de proteínas utilizando um kit de determinação de proteínas, como um ensaio de BCA. Incube por 30 minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, meça a absorbância a 562 nanômetros em um leitor de microplacas.

Nesta etapa, usando uma proteína recombinante com concentração conhecida como padrão, dilua a proteína a uma concentração de 12.000 picogramas por microlitro como uma solução estoque. Enquanto isso, dilua os lisados de amostra preparados para quatro microgramas por microlitro. Para obter resultados mais confiáveis, recomendamos o uso de uma mistura de lisados de amostra para evitar qualquer diferença entre amostras individuais.

Diluir em série a proteína padrão e as amostras preparadas para um estudo de dose típico. A BSA foi suplementada para garantir quantidades aproximadamente iguais da proteína carregada para cada amostra. Depois disso, misture 10 microlitros da proteína padrão diluída em série ou lisados de amostra com 10 microlitros de tampão de carga 2X.

Em seguida, aqueça a mistura a 85 graus Celsius por cinco minutos. Neste procedimento, coloque uma caixa de ponteira de pipeta vazia sob a placa QDB para evitar que a parte inferior da placa toque na superfície da mesa. Carregue até dois microlitros da amostra no centro da membrana na parte inferior de uma unidade individual da placa QDB.

Nunca permita que a parte inferior da placa QDB toque em qualquer superfície durante o carregamento e não carregue muito para o poço individual. Em nossa experiência, não mais do que quatro microlitros por poço. Em seguida, deixe a placa QDB carregada por uma hora em temperatura ambiente ou deixe a carregada a 37 graus Celsius por 15 minutos em um espaço bem ventilado.

Para bloquear a placa, mergulhe a placa QDB no tampão de transferência e agite-a suavemente por 10 segundos. Depois disso, enxágue a placa QDB suavemente com TBST três vezes e, em seguida, lave a placa por cinco minutos em TBST sob agitação constante. Em seguida, bloqueie a placa QDB com tampão de bloqueio por uma hora sob agitação constante.

Agora, dilua o anticorpo primário no tampão de bloqueio em uma concentração escolhida e adicione 100 microlitros dele a cada poço individual de uma placa comum de 96 poços. Insira a placa QDB na placa de 96 poços e incube as placas combinadas por duas horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius sob agitação constante. Depois disso, enxágue a placa suavemente com TBST três vezes antes de ser lavada com TBST três vezes de cada vez por cinco minutos sob agitação constante.

Em seguida, dilua o anticorpo secundário no tampão de bloqueio na concentração escolhida e alíquota de 100 microlitros em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, incube a placa QDB dentro da placa carregada de 96 poços por uma hora em temperatura ambiente sob agitação constante. Enxágue a placa QDB suavemente três vezes com TBST e, em seguida, lave a placa três vezes por cinco minutos cada com TBST sob agitação constante.

Para quantificação, prepare o substrato ECL e aliquote-o em uma placa de 96 poços a 100 microlitros por poço. Em seguida, insira a placa QDB dentro da placa de 96 poços por dois minutos sob agitação constante. Depois disso, remova a placa QDB da placa de 96 poços e agite brevemente para remover o excesso de líquido.

Em seguida, coloque a placa em uma placa de microtitulação branca. Em seguida, ligue o leitor de microplacas e selecione a placa com tampa na interface do usuário antes de colocar as placas combinadas dentro do leitor de microplacas para quantificação. Certifique-se de escolher a placa com tampa para evitar erros.

Esta figura mostra a especificidade do anticorpo anti-CAPG de coelho usando lisados de tecido de camundongo preparados a partir de baço, coração, músculo, rim, fígado e próstata com análise de western blot. A faixa linear de análise de QDB do anticorpo anti-CAPG de coelho usando lisados preparados a partir da próstata, rim, baço e usando o padrão de proteína CAPG recombinante purificada foi definida. Os resultados foram uma média de triplicados.

E aqui é mostrada a determinação absoluta dos níveis de CAPG em lisados preparados a partir de rins, baços e próstatas de camundongos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro a 24 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar um anticorpo específico predeterminado para todo o procedimento.

Após este procedimento, outros métodos, como a análise bioestatística, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais que só podem ser alcançadas por meio da medição absoluta do conteúdo de proteínas individuais em nível celular ou tecidual. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa proteômica explorarem a suposta relação de biomarcadores de proteínas com várias doenças em nível populacional. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise de QDB em formato de alta taxa de transferência.

Não se esqueça de que trabalhar com tecidos humanos ou animais pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.