Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais

O objetivo geral deste protocolo é isolar e caracterizar micropartículas derivadas de neutrófilos para estudos funcionais. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o papel das vesículas de exocélulas, ou micropartículas, na comunicação célula-célula em diferentes processos fisiológicos, incluindo câncer, inflamação e cicatrização de feridas. As principais vantagens desta técnica são que ela é relativamente rápida, econômica e permite a avaliação da composição p'henotípica de micropartículas, ou microvesículas, em ativos funcionais.

Demonstrando o procedimento estarão Ariel Finkielsztein, um pós-doutorando em meu laboratório, e Joseph Lee, um estudante de graduação em meu laboratório. Para a separação do gradiente de densidade de células polimorfonucleares da medula óssea murina, ou PMN, primeiro coloque lentamente três mililitros de solução recém-preparada, em temperatura ambiente, 1,077 gramas por mililitro sobre três mililitros de solução recém-preparada, em temperatura ambiente, 1,119 gramas por mililitro de solução de densidade em um tubo cônico de 15 mililitros por amostras de células da medula óssea. Em seguida, sobreponha um mililitro de células da medula óssea recém-isoladas em PBS gelado na camada superior de gradiente de densidade de cada tubo e separe as células por centrifugação de gradiente de densidade.

No final da separação, remover cuidadosamente as camadas de células mononucleares nas interfaces entre o PBS e as camadas superiores de gradiente de densidade em cada tubo, sem perturbar as bandas de PMN. Usando uma pipeta de transferência, colete as camadas de PMN em um novo tubo de 15 mililitros por amostra e aumente o volume final em cada tubo para 15 mililitros com PBS filtrado de 0,1 mícron. Pellet os PMNs por centrifugação, seguida por uma segunda centrifugação em dois mililitros de PBS recém-filtrado por tubo.

Em seguida, ressuspenda os pellets em um mililitro de PBS recém-filtrado para contagem. Após a contagem, centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de HBSS filtrado de 0,1 mícron de tamanho de derramamento, suplementado com o estimulante de interesse por 10 milhões de células. Incube por 20 a 30 minutos a 37 graus Celsius.

No final da estimulação, recolher as células por centrifugação e transferir os sobrenadantes sem células para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 militer por amostra. Centrifugue os sobrenadantes para remover quaisquer detritos celulares e transfira os sobrenadantes limpos para novos tubos de ultracentrífuga, depois centrifugue os sobrenadantes e armazene as micropartículas peletizadas em tubos de ultracentrífuga selados com parafina a 80 graus Celsius até uma análise experimental adicional. Para administrar as micropartículas no cólon do camundongo, primeiro coloque um camundongo totalmente anestesiado em decúbito ventral e use uma pinça de biópsia e um endoscópio equipado com uma câmera de alta resolução para gerar de três a cinco feridas superficiais ao longo do lado dorsal do cólon.

Retorne o camundongo à gaiola com monitoramento até a recuperação total. 24 horas depois, use o endoscópio para adquirir imagens das feridas infligidas sob anestesia. Em seguida, use um sistema de microinjeção baseado em colonoscopia para administrar um volume experimental de micropartículas de PMN ressuspensas em 100 microlitros de HBSS diretamente em cada local da ferida.

A heterogeneidade de tamanho das micropartículas PMN pode ser avaliada comparando as micropartículas com esferas de citometria de fluxo de tamanho conhecido. Como demonstrado, a expressão de proteínas de interesse pelas micropartículas também pode ser examinada por citometria de fluxo. Neste experimento, a expressão de moléculas inflamatórias e anti-inflamatórias chave por micropartículas derivadas de PMN estimuladas por ativadores foi avaliada por immunoblot.

Os efeitos das micropartículas de PMN na cicatrização das células epiteliais podem ser monitorados pela aquisição de imagens de monocamadas epiteliais feridas por arranhões em pontos de tempo pré-determinados in vitro, bem como após a biópsia com pinças de ferimento in vivio. Uma vez dominadas, as micropartículas derivadas de PMN podem ser isoladas em quatro horas, se a técnica for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, antes da estimulação, o PMN deve ser mantido em gelo para evitar ativação prematura e perda de micropartículas.

Seguindo esse procedimento, técnicas de citometria de fluxo, immunoblotting e reação de proliferação em tempo real podem ser usadas para definir o conteúdo de micropartículas, sob várias condições estimulatórias ou de diferentes células de origem. Esta técnica é útil para examinar o papel da contribuição de micropartículas na regulação das respostas imunes, função de barreira, lesão e reparo tecidual, bem como na progressão do câncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e rotular micropartículas murinas e usar as micropartículas em um ativo funcional de cicatrização de feridas in vivo.

Não se esqueça de que trabalhar com animais vivos pode ser perigoso e que as precauções sugerem colocar o equipamento de proteção individual e concluir os treinamentos de segurança apropriados antes de realizar este procedimento.