Name: Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a coletar tecido adiposo branco de camundongos e extrair RNA de alta qualidade para estudos de expressão gênica em metabolismo e biologia molecular. Este método é essencial para pesquisas em roedores.

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Este trabalho foi apoiado pelo Canadá de Diabetes.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Seguir HF-dieta alimentar, ratos obesos foram encontrados para ter aumentado o corpo e os pesos de tecido adiposo branco em comparação com ratos alimentados com uma dieta de N. RNA extraído usando solução de fenol rendeu amostras com boa pureza. Leptina é uma adipokine primeiramente produzido pelo tecido adiposo e é conhecida por correlacionar-se positivamente com a massa gorda16. Como esperado, a expressão de RNAm de leptina aumentou em ratos obesos em concomitância com sua massa gorda.
<p cl...

A obesidade é uma epidemia mundial que pode levar a complicações, tais como o tipo 2 diabetes1. Modelos animais induzida por dieta obesos e geneticamente modificados são frequentemente usados para investigação em obesidade e suas complicações associadas. Tradicionalmente, o tecido adiposo branco é conhecido como um compartimento de armazenamento para o excesso de energia e é principalmente composto de lipídios enquanto marrom tecido adiposo converte energia em calor2,3. Tecido adiposo é dinâmico e irá expandir e encolher dependendo de vários fatores tais como a ingestão de alimentos e atividade física. Portanto, para determinar os fatores que contribuem para essas alterações, manipulação e coleta adequada de tecido adiposo são necessários4.
Entre os brancos os tecidos adiposos, é geralmente aceite que os depósitos de gordura subcutâneos e viscerais possuem diferentes propriedades como localização anatômica e função2,5. Por conseguinte, para evitar resultados conflitantes ou grande variabilidade, atenção deve ser tomado para evitar a contaminação cruzada entre estes depósitos de gordura diferentes quando coletando almofadas de gordura.
Além disso, existem três grandes desafios quando isolando RNA ou proteína do tecido adiposo de ratos brancos. Primeiro, coletar almofadas de gordura em ratos obesos não é uma tarefa fácil como a fronteira que separa diferentes depósitos de gordura brancos nem sempre é clara, em contraste com outros órgãos como rins e coração6. Em segundo lugar, por causa do alto teor lipídico do tecido adiposo, durante o isolamento do RNA ou proteína, uma camada de lipídios flutua no topo e impede o acesso direto à amostra. Em terceiro lugar, em vez de marrom tecido adiposo ou outros tecidos, tecido adiposo branco tem consideravelmente mais baixo conteúdo de RNA e proteína e isso é de grande preocupação quando usando ratos jovens, ratos alimentados com uma dieta normal de (N) e ratos que deverão tem baixas gordura massas (ou seja, KO modelos, tratamento com medicamentos, exercem, treinamento, etc.) 7 , 8.
Portanto, escolher o método apropriado para isolar o RNA do tecido adiposo é crítico. Métodos alternativos para extração fenol/clorofórmio são jogos comerciais. Eles normalmente são baseados em uma etapa de extração do fenol inicial, seguida de purificação de RNA em uma coluna de9. No entanto, esses kits são tipicamente mais caros e dar amostras de rendimento mais baixo, enquanto a qualidade do RNA pode ser variável mas são menos demorados. No entanto, uma das maiores vantagens para extração de solução/clorofórmio fenol descrito aqui é a possibilidade de isolar o DNA, RNA e proteína de uma única amostra10. Desde almofadas de gordura de ratos são geralmente pequenas e dar uma quantidade pequena de RNA e proteínas (especialmente em modelos do rato magra), estes protocolos maximizam os dados um pode tirar uma pequena amostra.
O objetivo deste trabalho é descrever detalhadamente um método para garantir a coleta de amostra adequada de depósitos de tecido adiposo branco três ratos, bem como a quantidade e a qualidade da isolação do RNA. RNA obtido seguindo este protocolo pode ser usado para realizar ensaios PCR em tempo real. Este protocolo não se destina para isolamento de RNA de adipócitos primários culturas.

<table><tbody><tr><td>1 mL seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE solução (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA&bull; Na2. pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas</td><td></td><td></td><td></td>de 22 G</tr><tr><td>Agulhas</td><td></td><td></td><td></td>de 26 G</tr><tr><td>Aquecedor de bloco de etanol</td><td></td><td></td><td></td>de 75%</tr><tr><td>(banho seco)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 U/&micro; l)&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Corante</td> fluorescente universal <td>Thermo scientific R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox)&nbsp;</td><td>Pinça de Pontas</td><td>Filtradas</td> Roche 4913914001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Martelo</td><td></td> de Gaze Instrumentarium HB275 <td></td></tr><tr><td>Dieta para roedores com alto teor de gordura</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td></td> Isopropanol&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Primer de PCR direto de leptina (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer de PCR reverso de leptina (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Maxima Transcriptase reversa (enzima e tampão 5x)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Água nanopura (referida como água ultrapura)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td>de exame de nitrilo</tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td>de nitrilo</tr><tr><td>Dieta normal para roedores</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de fenol (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td></td><td></td><td></td>de quartzo</tr><tr><td>pré-identificado em folha</td><td></td><td></td><td></td>de alumínio</tr><tr><td>Rack para tiras de tubo PCR</td> Racks para tiras <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de tubo RT-PCR</td></tr><tr><td>Hexâmeros aleatórios&nbsp;</td>Sistema de Gene de Rotor PCR em Tempo Real <td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td></td>Ciclador <td></td><td>térmico Rotor-Gene RG-3000</td> <td>da Corbett research</td></tr><tr>Centrífuga <td></td><td></td><td></td><td>refrigerada de bancada</td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Tubos eppendorf de 1,5 mL sem RNase Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>com tampa de rosca de 1,5 mL</td> sem RNase Tiras <td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>tubo PCR sem RNase (0,2 mL) e tampas</td><td></td><td></td><td></td></tr> Água <tr><td>sem RNase&nbsp;</td><td>Máquina de RT-PCR Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo RT-PCR (0,1 mL) e tampas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR direto S16 (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR reverso S16 (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Espectrofotômetro de 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Pilão</td><td></td><td></td><td></td>e almofariz de aço inoxidável</tr><tr><td>Almofadas cirúrgicas</td><td>Feita em casa uma placa de espuma envolvida em uma almofada</td><td></td><td></td>absorvente descartável</tr><tr><td>Tesoura cirúrgica&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador Termociclador</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr>Misturador <td></td><td></td><td></td><td>de vórtice</td></tr><tr><td>Espátula de</td><td></td><td></td><td></td> pesagem</tr></tbody></table>

coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de rna

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Comparado a outros tecidos, tecido adiposo branco tem um teor consideravelmente menos RNA e proteína para aplicações a jusante, tais como a PCR em tempo real e Western Blot, desde que em sua maioria contém lipídios. Isolamento de RNA a partir de amostras de tecido adiposo é também um desafio como etapas adicionais são necessárias para evitar esses lipídios. Aqui, apresentamos um procedimento para coletar três anatomicamente diferentes brancos adiposo tecidos de ratos, para processar estas amostras e realizar o isolamento de RNA. Podemos descrever a síntese do cDNA e gene experimentos de expressão usando PCR em tempo real. O protocolo descrito por este meio permite a redução da contaminação de cabelo e sangue nas almofadas de gordura, bem como a contaminação cruzada entre diferentes almofadas de gordura durante a coleta de tecido do animal. Ele também foi otimizado para garantir adequada quantidade e qualidade do RNA extraído. Este protocolo pode ser amplamente aplicado a qualquer modelo de rato onde as amostras de tecido adiposo são necessárias para experimentos de rotina, tais como a PCR em tempo real, mas não deve ser isolada da cultura de células primárias de adipócitos.

Após o processo de necropsia, os três tecidos adiposo brancos foram coletados e ponderados de dois grupos de ratos (N e HF dieta-alimentou ratos). Como esperado, os ratos na dieta de HF tinham aumentado de peso final e ganho de peso em comparação com littermates dieta N (tabela 1). Estas observações foram acompanhadas por mais do que um aumento de 2 vezes no peso da PGF, PRF e SCF em ratos obesos em comparação com aqueles na dieta de N.
<p class="jove_content" fo:keep...

O objetivo deste trabalho é apresentar um procedimento passo a passo para coletar os diferentes tecidos adiposo brancos de ratos, processar as amostras de gordura e extrair o RNA.

Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

O objetivo geral deste procedimento é garantir a coleta adequada de amostras de depósitos de tecido adiposo branco de diferentes camundongos e isolar uma grande quantidade de RNA de boa qualidade do tecido. Este método pode responder a questões-chave nos campos do metabolismo, bioquímica e biologia molecular que, por exemplo, dizem respeito à expressão gênica no tecido adiposo de camundongos tratados ou geneticamente modificados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento de grandes quantidades de RNA de boa qualidade do tecido adiposo, que normalmente tem baixo conteúdo de RNA.Demonstrando o procedimento estará Emilie Pepin, assistente de pesquisa do meu laboratório. Depois de sacrificar um camundongo, corte a pele sobre a linha alba de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, faça duas incisões de aproximadamente dois centímetros do meio da caixa torácica em direção ao braço direito e próximo aos órgãos genitais acima do membro posterior direito. Estique um canto da pele aberta e use uma agulha de calibre 22 para prendê-la na almofada.Em seguida, prenda o outro canto. Usando uma tesoura cirúrgica posicionada contra a pele o mais plana possível, faça a

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O perfilamento da expressão de RNA em regiões discretas do cérebro de camundongos exige uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecidos. Aqui é descrito um protocolo que utiliza o seccionamento coronal do cérebro e a microdissecação assistida por perfurador de tecidos. O rendimento e a qualidade do RNA total obtido a partir das amostras resultantes confirmam a utilidade do método descrito.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

Relatamos um procedimento para isolar RNA com alta integridade do pâncreas de camundongo rico em ribonuclease.

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.

Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

Este protocolo detalha a separação do epitélio da lente ocular do camundongo e da massa em massa da célula da fibra, seguida pelo isolamento de RNA e análise de qPCR. Este método permite separar os compartimentos das células do cristalino para uma análise mais detalhada do transcriptoma e dos processos biológicos em células epiteliais versus células de fibra diferenciadas.

Isolamento de RNA do epitélio da lente ocular de camundongo e massas em massa de células de fibra

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aprenda a coletar tecido adiposo branco de camundongos e extrair RNA de alta qualidade para estudos de expressão gênica em metabolismo e biologia molecular. Este método é essencial para pesquisas em roedores.

Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

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