Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

O objetivo geral deste procedimento é garantir a coleta adequada de amostras de depósitos de tecido adiposo branco de diferentes camundongos e isolar uma grande quantidade de RNA de boa qualidade do tecido. Este método pode responder a questões-chave nos campos do metabolismo, bioquímica e biologia molecular que, por exemplo, dizem respeito à expressão gênica no tecido adiposo de camundongos tratados ou geneticamente modificados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento de grandes quantidades de RNA de boa qualidade do tecido adiposo, que normalmente tem baixo conteúdo de RNA.

Demonstrando o procedimento estará Emilie Pepin, assistente de pesquisa do meu laboratório. Depois de sacrificar um camundongo, corte a pele sobre a linha alba de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, faça duas incisões de aproximadamente dois centímetros do meio da caixa torácica em direção ao braço direito e próximo aos órgãos genitais acima do membro posterior direito. Estique um canto da pele aberta e use uma agulha de calibre 22 para prendê-la na almofada.

Em seguida, prenda o outro canto. Usando uma tesoura cirúrgica posicionada contra a pele o mais plana possível, faça a dissecção romba da gordura subcutânea abdominal, ou SCF, e transfira-a para um pedaço pré-cortado de papel alumínio. Repita a dissecção para o lado esquerdo do animal.

Em seguida, puxe as almofadas de gordura coletadas esquerda e direita na folha de alumínio e use nitrogênio líquido para congelar a amostra. Para ter acesso ao tecido adiposo visceral, corte o músculo abdominal ao longo da linha alba. Em seguida, faça uma incisão nos músculos abdominais dos órgãos genitais em direção à parte de trás do mouse em ambos os lados.

A gordura ao redor dos órgãos reprodutivos é a gordura perigonadal, ou PGF. Separe as bolsas de gordura esquerda e direita do epidídimo, dos testículos e do ducto deferente e transfira-as para a folha de alumínio pré-rotulada. Em seguida, congele a amostra em nitrogênio líquido.

Começando com o lado esquerdo, exponha os rins movendo o intestino da cavidade abdominal para o lado direito. O tecido adiposo visto aqui ao redor do rim e das glândulas supra-renais é a gordura perirrenal, ou PRF. Isole e remova as glândulas supra-renais antes de coletar o PRF.

Isso pode ser tedioso, pois eles são um pouco mais rosados que o tecido adiposo. Agora, isole o PRF da parede muscular posterior e corte o ureter, a artéria e a veia renais que separam o PRF e o rim do resto do corpo. Em seguida, isole o PRF do rim cortando e removendo a cápsula renal.

Depois de isolar o PRF direito, transfira a amostra para a folha de alumínio com o tecido do lado esquerdo e use nitrogênio líquido para congelar as amostras. Refrigere tubos cônicos sem RNase de 1,5 mililitro, um almofariz e pilão e uma espátula em nitrogênio líquido de acordo com o protocolo de texto. Coloque a amostra de tecido adiposo no almofariz e use algumas camadas de papel pardo para levantar o pilão do nitrogênio líquido e encaixá-lo no almofariz.

Enquanto segura o pilão com o papel, use o martelo para bater no topo do pilão uma ou duas vezes. Em seguida, triture a amostra usando um movimento rotativo até obter um pó fino. Em seguida, remova o pilão, recupere a espátula do nitrogênio líquido e use-a para transferir a amostra para o tubo cônico pré-resfriado correspondente de 1,5 mililitro.

Mergulhe a espátula de volta em nitrogênio líquido de vez em quando para evitar que a amostra derreta. Além disso, mantenha o tubo cônico em gelo seco para evitar que a amostra descongele. Encha o tubo cônico até aproximadamente 2/3 da capacidade com amostra moída para rendimento adequado de RNA.

Em seguida, prepare as amostras restantes de acordo com o protocolo de texto. Sob um capuz químico e usando um jaleco, luvas e óculos de segurança, remova uma amostra moída do nitrogênio líquido. Abra lentamente o tubo e adicione 500 microlitros de solução de fenol.

Feche a tampa do tubo e o vórtice na velocidade máxima por cerca de cinco segundos e, em seguida, abra lenta e cuidadosamente o tubo para liberar a pressão do nitrogênio. O som do ar saindo do tubo será ouvido. Pipete mais 500 microlitros de solução de fenol no tubo.

Em seguida, vortex e abra-o lentamente como antes. Vortex a amostra até que esteja completamente dissolvida. Em seguida, abra o tubo para liberar a pressão antes de processar amostras adicionais.

Depois que todas as amostras forem processadas, subtraia-as brevemente em vórtice na velocidade máxima e incube-as em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugue os tubos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, traga os tubos de volta à temperatura ambiente.

Para evitar contaminação, para cada amostra, use uma pipeta P1000 com uma ponta filtrada para isolar o máximo de RNA possível da camada rosa média, perfurando a fase lipídica perto da lateral do tubo. Dispense o RNA nos novos tubos cônicos sem tocar nas laterais dos tubos para evitar a transferência de lipídios presentes na parte externa da ponta. Adicione 200 microlitros de clorofórmio puro a cada amostra e misture os tubos por inversão por 15 segundos.

Em seguida, depois de incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugar os tubos a 12 000 vezes G e a quatro graus Celsius durante 15 minutos e trazer os tubos de volta à temperatura ambiente. Para cada amostra, use uma pipeta P1000 e pontas filtradas para transferir o máximo possível de fase superior contendo RNA transparente aquoso para o segundo conjunto de tubos cônicos correspondentes. Em seguida, adicione 500 microlitros de isopropanol a 100% a cada amostra e misture os tubos por inversão por 15 segundos.

Em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugue os tubos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos antes de trazê-los de volta à temperatura ambiente. Descarte o isopropanol despejando-o para fora de cada tubo.

Agora, adicione um mililitro de etanol 75% a cada amostra e subtraia brevemente os tubos na velocidade máxima. Em seguida, centrifugue as amostras a 7.500 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de girar as amostras e levá-las à temperatura ambiente, descarte o etanol 75% invertendo cada tubo e acendendo-os batendo contra o papel pardo para remover qualquer etanol residual.

Deixe a tampa aberta e seque ao ar o pellet de RNA por cerca de 15 a 20 minutos. Depois de avaliar o tamanho dos pellets de RNA, adicione 10 a 25 microlitros de água livre de RNase a cada amostra. Incube as amostras em um bloco de calor a 60 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, faça um vórtice breve dos tubos. Incube as amostras no mesmo bloco de calor por mais cinco minutos. Em seguida, gire rapidamente todas as amostras e coloque-as imediatamente no gelo.

Realizar RT-PCR para expressão gênica no tecido adiposo de acordo com o protocolo de texto. Como esperado, os ratos na dieta rica em gordura aumentaram o peso corporal e o ganho de peso em comparação com os companheiros de ninhada na dieta normal. Essas observações foram acompanhadas por um aumento de mais de duas vezes no peso do PGF, PRF e SCF em camundongos obesos em comparação com aqueles na dieta normal.

Esta tabela mostra que, para cada tecido adiposo branco, o isolamento de RNA por solução de fenol produziu amostras com OD260 sobre OD280 de cerca de 2,0, o que é considerado puro para RNA. Como visto neste gráfico de barras, os dados de PCR em tempo real mostraram que a expressão de mRNA de leptina foi significativamente maior em PGF, PRF e SCF de camundongos obesos em comparação com aqueles em uma dieta normal. As diferenças observadas na expressão do mRNA da leptina não foram devidas a uma variação do s16, o gene de referência usado para normalizar os resultados entre os dois grupos de camundongos, pois os valores de CT não foram alterados.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em um ambiente livre de RNase durante o procedimento de extração de RNA. Após este procedimento, outros métodos, como amplificação por PCR em tempo real, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como modificações na expressão gênica.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de metabolismo explorarem as modulações do tecido adiposo relacionadas à obesidade e diabetes em roedores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar diferentes almofadas de gordura e isolar o RNA delas. Não se esqueça de que trabalhar com a solução de fenol pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar jaleco e luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.