Name: Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a coletar tecido adiposo branco de camundongos e extrair RNA de alta qualidade para estudos de expressão gênica em metabolismo e biologia molecular. Este método é essencial para pesquisas em roedores.

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Este trabalho foi apoiado pelo Canadá de Diabetes.

<ol><li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC. Public Health. 9, 88(2009).</li>
<li>Wronska, A., Kmiec, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characteristics+of+various+white+adipose+tissue+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots.</a> Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).</li>
<li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue%3A+structural+and+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/246759856_RNA_Isolation_from_Adipose_Tissue_An_Optimized_Procedure_for_High_RNA_Yield_and_Integrity">RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity.</a> Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).</li>
<li>Cirera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+isolation+of+total+RNA+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue.</a> BMC Res Notes. 6, 472(2013).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+protein+extraction%3A+the+past+and+the+present%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.</a> J Biomed Biotechnol. 2009, 574398(2009).</li>
<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnol. 14, 94(2014).</li>
<li>Tan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+prorenin%2Frenin+receptor+on+the+development+of+obesity+and+associated+cardiometabolic+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver.+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors.</a> Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), 1-5 (2010).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+increases+in+circulating+prorenin+are+not+associated+with+renal+or+cardiac+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies.</a> Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).</li>
<li>Dusaulcy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-specific+disruption+of+autotaxin+enhances+nutritional+fattening+and+reduces+plasma+lysophosphatidic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid.</a> J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+a+link+between+obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease.</a> J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+RT-quantitative+PCR%3A+firsthand+observations+of+implementation+of+minimum+information+for+the+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments+%28MIQE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE).</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Seguir HF-dieta alimentar, ratos obesos foram encontrados para ter aumentado o corpo e os pesos de tecido adiposo branco em comparação com ratos alimentados com uma dieta de N. RNA extraído usando solução de fenol rendeu amostras com boa pureza. Leptina é uma adipokine primeiramente produzido pelo tecido adiposo e é conhecida por correlacionar-se positivamente com a massa gorda16. Como esperado, a expressão de RNAm de leptina aumentou em ratos obesos em concomitância com sua massa gorda.
<p cl...

A obesidade é uma epidemia mundial que pode levar a complicações, tais como o tipo 2 diabetes1. Modelos animais induzida por dieta obesos e geneticamente modificados são frequentemente usados para investigação em obesidade e suas complicações associadas. Tradicionalmente, o tecido adiposo branco é conhecido como um compartimento de armazenamento para o excesso de energia e é principalmente composto de lipídios enquanto marrom tecido adiposo converte energia em calor2,3. Tecido adiposo é dinâmico e irá expandir e encolher dependendo de vários fatores tais como a ingestão de alimentos e atividade física. Portanto, para determinar os fatores que contribuem para essas alterações, manipulação e coleta adequada de tecido adiposo são necessários4.
Entre os brancos os tecidos adiposos, é geralmente aceite que os depósitos de gordura subcutâneos e viscerais possuem diferentes propriedades como localização anatômica e função2,5. Por conseguinte, para evitar resultados conflitantes ou grande variabilidade, atenção deve ser tomado para evitar a contaminação cruzada entre estes depósitos de gordura diferentes quando coletando almofadas de gordura.
Além disso, existem três grandes desafios quando isolando RNA ou proteína do tecido adiposo de ratos brancos. Primeiro, coletar almofadas de gordura em ratos obesos não é uma tarefa fácil como a fronteira que separa diferentes depósitos de gordura brancos nem sempre é clara, em contraste com outros órgãos como rins e coração6. Em segundo lugar, por causa do alto teor lipídico do tecido adiposo, durante o isolamento do RNA ou proteína, uma camada de lipídios flutua no topo e impede o acesso direto à amostra. Em terceiro lugar, em vez de marrom tecido adiposo ou outros tecidos, tecido adiposo branco tem consideravelmente mais baixo conteúdo de RNA e proteína e isso é de grande preocupação quando usando ratos jovens, ratos alimentados com uma dieta normal de (N) e ratos que deverão tem baixas gordura massas (ou seja, KO modelos, tratamento com medicamentos, exercem, treinamento, etc.) 7 , 8.
Portanto, escolher o método apropriado para isolar o RNA do tecido adiposo é crítico. Métodos alternativos para extração fenol/clorofórmio são jogos comerciais. Eles normalmente são baseados em uma etapa de extração do fenol inicial, seguida de purificação de RNA em uma coluna de9. No entanto, esses kits são tipicamente mais caros e dar amostras de rendimento mais baixo, enquanto a qualidade do RNA pode ser variável mas são menos demorados. No entanto, uma das maiores vantagens para extração de solução/clorofórmio fenol descrito aqui é a possibilidade de isolar o DNA, RNA e proteína de uma única amostra10. Desde almofadas de gordura de ratos são geralmente pequenas e dar uma quantidade pequena de RNA e proteínas (especialmente em modelos do rato magra), estes protocolos maximizam os dados um pode tirar uma pequena amostra.
O objetivo deste trabalho é descrever detalhadamente um método para garantir a coleta de amostra adequada de depósitos de tecido adiposo branco três ratos, bem como a quantidade e a qualidade da isolação do RNA. RNA obtido seguindo este protocolo pode ser usado para realizar ensaios PCR em tempo real. Este protocolo não se destina para isolamento de RNA de adipócitos primários culturas.

<table><tbody><tr><td>1 mL seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE solução (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA&bull; Na2. pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas</td><td></td><td></td><td></td>de 22 G</tr><tr><td>Agulhas</td><td></td><td></td><td></td>de 26 G</tr><tr><td>Aquecedor de bloco de etanol</td><td></td><td></td><td></td>de 75%</tr><tr><td>(banho seco)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 U/&micro; l)&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Corante</td> fluorescente universal <td>Thermo scientific R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox)&nbsp;</td><td>Pinça de Pontas</td><td>Filtradas</td> Roche 4913914001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Martelo</td><td></td> de Gaze Instrumentarium HB275 <td></td></tr><tr><td>Dieta para roedores com alto teor de gordura</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td></td> Isopropanol&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Primer de PCR direto de leptina (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer de PCR reverso de leptina (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Maxima Transcriptase reversa (enzima e tampão 5x)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Água nanopura (referida como água ultrapura)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td>de exame de nitrilo</tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td>de nitrilo</tr><tr><td>Dieta normal para roedores</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de fenol (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td></td><td></td><td></td>de quartzo</tr><tr><td>pré-identificado em folha</td><td></td><td></td><td></td>de alumínio</tr><tr><td>Rack para tiras de tubo PCR</td> Racks para tiras <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de tubo RT-PCR</td></tr><tr><td>Hexâmeros aleatórios&nbsp;</td>Sistema de Gene de Rotor PCR em Tempo Real <td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td></td>Ciclador <td></td><td>térmico Rotor-Gene RG-3000</td> <td>da Corbett research</td></tr><tr>Centrífuga <td></td><td></td><td></td><td>refrigerada de bancada</td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Tubos eppendorf de 1,5 mL sem RNase Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>com tampa de rosca de 1,5 mL</td> sem RNase Tiras <td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>tubo PCR sem RNase (0,2 mL) e tampas</td><td></td><td></td><td></td></tr> Água <tr><td>sem RNase&nbsp;</td><td>Máquina de RT-PCR Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo RT-PCR (0,1 mL) e tampas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR direto S16 (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR reverso S16 (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Espectrofotômetro de 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Pilão</td><td></td><td></td><td></td>e almofariz de aço inoxidável</tr><tr><td>Almofadas cirúrgicas</td><td>Feita em casa uma placa de espuma envolvida em uma almofada</td><td></td><td></td>absorvente descartável</tr><tr><td>Tesoura cirúrgica&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador Termociclador</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr>Misturador <td></td><td></td><td></td><td>de vórtice</td></tr><tr><td>Espátula de</td><td></td><td></td><td></td> pesagem</tr></tbody></table>

coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de rna

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Comparado a outros tecidos, tecido adiposo branco tem um teor consideravelmente menos RNA e proteína para aplicações a jusante, tais como a PCR em tempo real e Western Blot, desde que em sua maioria contém lipídios. Isolamento de RNA a partir de amostras de tecido adiposo é também um desafio como etapas adicionais são necessárias para evitar esses lipídios. Aqui, apresentamos um procedimento para coletar três anatomicamente diferentes brancos adiposo tecidos de ratos, para processar estas amostras e realizar o isolamento de RNA. Podemos descrever a síntese do cDNA e gene experimentos de expressão usando PCR em tempo real. O protocolo descrito por este meio permite a redução da contaminação de cabelo e sangue nas almofadas de gordura, bem como a contaminação cruzada entre diferentes almofadas de gordura durante a coleta de tecido do animal. Ele também foi otimizado para garantir adequada quantidade e qualidade do RNA extraído. Este protocolo pode ser amplamente aplicado a qualquer modelo de rato onde as amostras de tecido adiposo são necessárias para experimentos de rotina, tais como a PCR em tempo real, mas não deve ser isolada da cultura de células primárias de adipócitos.

Após o processo de necropsia, os três tecidos adiposo brancos foram coletados e ponderados de dois grupos de ratos (N e HF dieta-alimentou ratos). Como esperado, os ratos na dieta de HF tinham aumentado de peso final e ganho de peso em comparação com littermates dieta N (tabela 1). Estas observações foram acompanhadas por mais do que um aumento de 2 vezes no peso da PGF, PRF e SCF em ratos obesos em comparação com aqueles na dieta de N.
<p class="jove_content" fo:keep...

O objetivo deste trabalho é apresentar um procedimento passo a passo para coletar os diferentes tecidos adiposo brancos de ratos, processar as amostras de gordura e extrair o RNA.

Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

O objetivo geral deste procedimento é garantir a coleta adequada de amostras de depósitos de tecido adiposo branco de diferentes camundongos e isolar uma grande quantidade de RNA de boa qualidade do tecido. Este método pode responder a questões-chave nos campos do metabolismo, bioquímica e biologia molecular que, por exemplo, dizem respeito à expressão gênica no tecido adiposo de camundongos tratados ou geneticamente modificados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento de grandes quantidades de RNA de boa qualidade do tecido adiposo, que normalmente tem baixo conteúdo de RNA.Demonstrando o procedimento estará Emilie Pepin, assistente de pesquisa do meu laboratório. Depois de sacrificar um camundongo, corte a pele sobre a linha alba de acordo com o protocolo de texto e, em seguida, faça duas incisões de aproximadamente dois centímetros do meio da caixa torácica em direção ao braço direito e próximo aos órgãos genitais acima do membro posterior direito. Estique um canto da pele aberta e use uma agulha de calibre 22 para prendê-la na almofada.Em seguida, prenda o outro canto. Usando uma tesoura cirúrgica posicionada contra a pele o mais plana possível, faça a dissecção romba da gordura subcutânea abdominal, ou SCF, e transfira-a para um pedaço pré-cortado de papel alumínio. Repita a dissecção para o lado esquerdo do animal.Em seguida, puxe as almofadas de gordura coletadas esquerda e direita na folha de alumínio e use nitrogênio líquido para congelar a amostra. Para ter acesso ao tecido adiposo visceral, corte o músculo abdominal ao longo da linha alba. Em seguida, faça uma incisão nos músculos abdominais dos órgãos genitais em direção à parte de trás do mouse em ambos os lados.A gordura ao redor dos órgãos reprodutivos é a gordura perigonadal, ou PGF. Separe as bolsas de gordura esquerda e direita do epidídimo, dos testículos e do ducto deferente e transfira-as para a folha de alumínio pré-rotulada. Em seguida, congele a amostra em nitrogênio líquido.Começando com o lado esquerdo, exponha os rins movendo o intestino da cavidade abdominal para o lado direito. O tecido adiposo visto aqui ao redor do rim e das glândulas supra-renais é a gordura perirrenal, ou PRF. Isole e remova as glândulas supra-renais antes de coletar o PRF.Isso pode ser tedioso, pois eles são um pouco mais rosados que o tecido adiposo. Agora, isole o PRF da parede muscular posterior e corte o ureter, a artéria e a veia renais que separam o PRF e o rim do resto do corpo. Em seguida, isole o PRF do rim cortando e removendo a cápsula renal.Depois de isolar o PRF direito, transfira a amostra para a folha de alumínio com o tecido do lado esquerdo e use nitrogênio líquido para congelar as amostras. Refrigere tubos cônicos sem RNase de 1,5 mililitro, um almofariz e pilão e uma espátula em nitrogênio líquido de acordo com o protocolo de texto. Coloque a amostra de tecido adiposo no almofariz e use algumas camadas de papel pardo para levantar o pilão do nitrogênio líquido e encaixá-lo no almofariz.Enquanto segura o pilão com o papel, use o martelo para bater no topo do pilão uma ou duas vezes. Em seguida, triture a amostra usando um movimento rotativo até obter um pó fino. Em seguida, remova o pilão, recupere a espátula do nitrogênio líquido e use-a para transferir a amostra para o tubo cônico pré-resfriado correspondente de 1,5 mililitro.Mergulhe a espátula de volta em nitrogênio líquido de vez em quando para evitar que a amostra derreta. Além disso, mantenha o tubo cônico em gelo seco para evitar que a amostra descongele. Encha o tubo cônico até aproximadamente 2/3 da capacidade com amostra moída para rendimento adequado de RNA.Em seguida, prepare as amostras restantes de acordo com o protocolo de texto. Sob um capuz químico e usando um jaleco, luvas e óculos de segurança, remova uma amostra moída do nitrogênio líquido. Abra lentamente o tubo e adicione 500 microlitros de solução de fenol.Feche a tampa do tubo e o vórtice na velocidade máxima por cerca de cinco segundos e, em seguida, abra lenta e cuidadosamente o tubo para liberar a pressão do nitrogênio. O som do ar saindo do tubo será ouvido. Pipete mais 500 microlitros de solução de fenol no tubo.Em seguida, vortex e abra-o lentamente como antes. Vortex a amostra até que esteja completamente dissolvida. Em seguida, abra o tubo para liberar a pressão antes de processar amostras adicionais.Depois que todas as amostras forem processadas, subtraia-as brevemente em vórtice na velocidade máxima e incube-as em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugue os tubos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, traga os tubos de volta à temperatura ambiente.Para evitar contaminação, para cada amostra, use uma pipeta P1000 com uma ponta filtrada para isolar o máximo de RNA possível da camada rosa média, perfurando a fase lipídica perto da lateral do tubo. Dispense o RNA nos novos tubos cônicos sem tocar nas laterais dos tubos para evitar a transferência de lipídios presentes na parte externa da ponta. Adicione 200 microlitros de clorofórmio puro a cada amostra e misture os tubos por inversão por 15 segundos.Em seguida, depois de incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugar os tubos a 12 000 vezes G e a quatro graus Celsius durante 15 minutos e trazer os tubos de volta à temperatura ambiente. Para cada amostra, use uma pipeta P1000 e pontas filtradas para transferir o máximo possível de fase superior contendo RNA transparente aquoso para o segundo conjunto de tubos cônicos correspondentes. Em seguida, adicione 500 microlitros de isopropanol a 100% a cada amostra e misture os tubos por inversão por 15 segundos.Em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugue os tubos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos antes de trazê-los de volta à temperatura ambiente. Descarte o isopropanol despejando-o para fora de cada tubo.Agora, adicione um mililitro de etanol 75% a cada amostra e subtraia brevemente os tubos na velocidade máxima. Em seguida, centrifugue as amostras a 7.500 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de girar as amostras e levá-las à temperatura ambiente, descarte o etanol 75% invertendo cada tubo e acendendo-os batendo contra o papel pardo para remover qualquer etanol residual.Deixe a tampa aberta e seque ao ar o pellet de RNA por cerca de 15 a 20 minutos. Depois de avaliar o tamanho dos pellets de RNA, adicione 10 a 25 microlitros de água livre de RNase a cada amostra. Incube as amostras em um bloco de calor a 60 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, faça um vórtice breve dos tubos. Incube as amostras no mesmo bloco de calor por mais cinco minutos. Em seguida, gire rapidamente todas as amostras e coloque-as imediatamente no gelo.Realizar RT-PCR para expressão gênica no tecido adiposo de acordo com o protocolo de texto. Como esperado, os ratos na dieta rica em gordura aumentaram o peso corporal e o ganho de peso em comparação com os companheiros de ninhada na dieta normal. Essas observações foram acompanhadas por um aumento de mais de duas vezes no peso do PGF, PRF e SCF em camundongos obesos em comparação com aqueles na dieta normal.Esta tabela mostra que, para cada tecido adiposo branco, o isolamento de RNA por solução de fenol produziu amostras com OD260 sobre OD280 de cerca de 2,0, o que é considerado puro para RNA. Como visto neste gráfico de barras, os dados de PCR em tempo real mostraram que a expressão de mRNA de leptina foi significativamente maior em PGF, PRF e SCF de camundongos obesos em comparação com aqueles em uma dieta normal. As diferenças observadas na expressão do mRNA da leptina não foram devidas a uma variação do s16, o gene de referência usado para normalizar os resultados entre os dois grupos de camundongos, pois os valores de CT não foram alterados.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em um ambiente livre de RNase durante o procedimento de extração de RNA. Após este procedimento, outros métodos, como amplificação por PCR em tempo real, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como modificações na expressão gênica.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de metabolismo explorarem as modulações do tecido adiposo relacionadas à obesidade e diabetes em roedores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar diferentes almofadas de gordura e isolar o RNA delas. Não se esqueça de que trabalhar com a solução de fenol pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar jaleco e luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Relatamos um procedimento para isolar RNA com alta integridade do pâncreas de camundongo rico em ribonuclease.

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

Um protocolo da microdissecção da captação do laser (LCM) foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene nas pilhas de todo o tecido duro.

Um protocolo da microdissecção da captação do laser que rende o RNA da alta qualidade dos ossos frescos-congelados do rato

Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.

Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Aprenda a coletar tecido adiposo branco de camundongos e extrair RNA de alta qualidade para estudos de expressão gênica em metabolismo e biologia molecular. Este método é essencial para pesquisas em roedores.

Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

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