Name: Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a detectar interações sensíveis a detergente entre proteínas de membrana usando marcadores de histidina e myc. Este método permite estudar interações proteicas fracas em contexto bioquímico relevante com sortilin e GLUT4.

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Este trabalho foi financiado pelo DK52057 e DK107498 do NIH para X.P de K.V.K foi apoiada pelo 2T32DK007201 de concessão a formação institucional do NIH de bolsas de investigação.

1. manipulação do Peptide
<ol><li>Design e ordenação do peptide<ol>
<li>Escolha a sequência desejada do peptide e adicionar uma marca, como myc epítopo (EQKLISEED) no seu ou N - ou C-terminal.</li>
		<li>Verifica a solubilidade prevista do peptide em água, usando peptídeo solubilidade calculadora http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se a solubilidade é baixa, tente adicionar outra tag solúvel em água, para alterar o equilíbrio de carga. Nota: Usamos o peptídeo correspondente ao primeiro luminal loop (fll) de GLUT4 marcados com o epítopo myc (negrito) no terminal N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA que tem "boa" predita solubilidade em água .</li>
		<li>Ordem do peptide personalizado pelo menos 75% pureza, que é suficiente para o ensaio e pede o provedor teste de solubilidade. Separe a ordem em pelo menos duas alíquotas em caso de problemas imprevistos com a dissolução do peptide. Nota: O Myc-fll-GLUT4 ordenaram-se em duas alíquotas. Sua solubilidade relatada em água ultrapura é ≤ 10 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolução do peptide Nota: Água ultrapura é o melhor solvente. Se o peptídeo parece não ser solúvel em água, consulte http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html para obter instruções.<ol>
<li>Prepare 100 x solução de trabalho do peptide em água ultrapura ou no buffer de escolha, com a concentração de 100 μg/mL.</li>
		<li>Separe a solução em alíquotas de 50-100 µ l e armazená-los a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. manipulação de células
<ol><li>Cultura celular<ol>
<li>Use células de tipo selvagem (WT) como um controle negativo e celulas que expressam a proteína do alvo com seis histidines (HisP). Nota: Usamos 3T3 L1 pré adipócitos estàvel transfectados com Sortilin-myc/His5.</li>
		<li>Crescem as células açúcar elevado médio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% de soro de bovino do bezerro, glutamina (2 mM) e penicilina/estreptomicina (5 μg/mL) a 37 ° C em 10% CO2.</li>
		<li>Sente-se quatro pratos de 10cm de células, dois com HisP transfect e transfect os outros dois com controle do plasmídeo (WT). 48 h após a transfeccao, células devem chegar a confluência de 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação dos lisados celulares<ol>
<li>Preparar o tampão de lise (10 mM Hepes, 30 mM de NaCl, 5% de glicerol, 10 mM imidazol, 0,5% Triton X-100 e protease inibidor cocktail sem EDTA, para o isolamento de proteínas com sua Tag, pH 7,4) e mantê-lo em 4 ° c:</li>
		<li>Lavar as células três vezes com 10 mL de 1x tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C.</li>
		<li>Coloque os pratos no gelo e adicione 500 µ l de tampão de Lise para cada prato. Os lisados celulares usando um raspador de célula da colheita.</li>
		<li>O lisado celular de cada prato em um tubo de diferentes 1,5 mL de lugar. Rotule os tubos como pH6-WT, WT-pH8, HisP-pH6, pH8-HisP.</li>
		<li>Passe os lisados celulares através de uma seringa com uma agulha 26G cinco vezes acima e para baixo, para lise completa.</li>
		<li>Centrifugue os lisados celulares a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Transferi os sobrenadantes para novos tubos de forma idêntica rotulados.</li>
		<li>Analise a concentração da proteína usando o Kit de ensaio do BCA proteína ou outro kit.</li>
		<li>Usando do lysis, equalize a concentração de proteína de todos os quatro lysates.</li>
		<li>Separar uma alíquota de pequeno (ca. 20 µ l) de cada lisado e mantê-lo a-20 ° C para possíveis experimentos de controle e/ou resolução de problemas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ligação de proteínas com sua tag aos talões de cobalto HisPur
<ol><li>Use o tampão de lavagem disponíveis comercialmente ou preparar um (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM de NaCl, imidazol 20 mM, pH 8) e mantê-lo em 4 ° C.</li>
	<li>Preparar a lavagem do buffer com pH 6 por risonhas lavagem tampão pH 8 com HCl. Mantenha-a 4 ° C.</li>
	<li>Agite suavemente o frasco dos grânulos cobalto tornar suspensão homogênea.</li>
	<li>Dispense a 40 µ l de suspensão de grânulos de cobalto em quatro tubos de 1,5 mL marcados como acima (passo 2.2.4).</li>
	<li>Adicionar 1 mL de tampão de Lise para cada tubo, centrifugar os tubos a 1000 x g durante 5 s. Aspire o sobrenadante e adicionar 40 μL de tampão de lise de grânulos se estabeleceram.</li>
	<li>Adicione os lisados celulares para tubos correspondentes.</li>
	<li>Incube os tubos por 90 min a 4 ° C em rotacao do tubo a 20 rpm.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 1000 x g por 5 s e recolher o sobrenadante. Manter o sobrenadante a 4 ° C.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l de tampão de lavagem de pH 6 ou pH 8 tubos correspondentes e ressuspender os grânulos suavemente.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 1000 x g durante 5 s e descartar os sobrenadantes.</li>
	<li>Repita as etapas de 3.9 e 3.10 por quatro vezes.</li>
</ol>4. ligação do Peptide à proteína com sua tag imobilizada em grânulos
<ol><li>Solução de trabalho x 100 do peptide (etapa 1.2.1), preparar 1 x soluções de trabalho em pH 6 ou tampão de lavagem do pH 8 (alíquotas de dois 100 µ l de cada um, 1 µ g/mL).</li>
	<li>Adicione 100 μL de solução de peptídeo x 1 para os grânulos lavados com o pH correspondente.</li>
	<li>Incube os grânulos por 30 min a 4 ° C em rotacao do tubo a 20 rpm.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 1.000 x g, durante 5 s, recolher o sobrenadante e mantê-lo a-20 ° C.</li>
	<li>Repita as etapas de 3.9 e 3.10 por quatro vezes. Nota: Para diminuir o possível plano de fundo, as etapas a seguir poderiam substituir etapas 4.4 e 4.5.</li>
	<li>Tome quatro colunas micro com 30 μm de poros, rotulá-los como na etapa 2.2.4 e coloque as colunas em tubos de colheita.</li>
	<li>Após a conclusão da etapa 4.3, transfira a mistura de incubação em colunas, permitir que a solução passar pela gravidade. Manter o fluxo através da-20 ° C.</li>
	<li>Passe de 500 µ l de tampão de lavagem com pH 6 ou pH 8 através de colunas correspondentes pela gravidade. Descarte a fluir.</li>
	<li>Repita a etapa 4.8 quatro vezes.</li>
	<li>Após a última lavagem, Centrifugar as colunas a 1.000 x g, durante 15 s.</li>
</ol>5. eluição de cobalto missanga
<ol><li>Amortecedor da amostra do Tricine uso comercial (200 mM Tris-HCl, 40% de glicerol, 2% SDS, 0,04% azul de Coomassie, pH 6,8) e adicionar β-Mercaptoetanol para a concentração final de 2%.</li>
	<li>Adicione 40 µ l de tampão de amostra Tricine (com β-Mercaptoetanol) para os grânulos lavados e vórtice a amostra.</li>
	<li>Aquecer as amostras durante 10 minutos a 100 ° C, vórtice novamente, as amostras e centrifugar os tubos a 1.000 x g, durante 5 s. Nota: A fim de reduzir a possível ligação inespecífica na eluição, as etapas a seguir poderiam substituir etapas 5.1-5.3.</li>
	<li>Adicionar 40 μL de tampão de eluição imidazol (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, imidazol 0,25 M) para a lavada de pérolas, vórtex e incubar os tubos à temperatura ambiente por 20 min.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 3.000 x g por 30 s, recolher o sobrenadante (eluted amostras) e transferi-lo para novos tubos etiquetados.</li>
	<li>Adicionar 40 μL de tampão de amostra de Tricine para cada tubo, aquecer as amostras durante 10 minutos a 100 ° C, vórtice e centrifugar os tubos a 1.000 x g, durante 5 s. Nota: Se forem usadas colunas micro, adicionar o tampão de eluição para os grânulos lavados, incubar por 20 min e coletar a eluição por centrifugação a 8.000 x g por 2 min. Nota: As amostras podem ser mantidas a-20 ° C até electroforese é executada.</li>
</ol>6. eletroforese e mancha ocidental
Nota: As amostras estão prontas para a separação por SDS-PAGE e mancha ocidental posterior. Segui o protocolo da electroforese do gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) com as seguintes modificações.
<ol><li>Use comercialmente disponível de 10-20% Tricine gradientes géis.</li>
	<li>Em gel, carrega 20 µ l das amostras eluted e 20 µ l de lisados (etapa 2.2.10). Para resolução de problemas, recomenda-se carregar 20 µ l de material não vinculado (passo 3.8) e 10 ng do peptide; antes do carregamento, adicione uma quantidade igual de tampão de amostra Tricine para estas amostras.</li>
	<li>Realize a eletroforese em comercial Tris/Tricine/SDS executando o tampão (100 mM Tris, Tricine, de 100 mM e 0,1% SDS, pH 8.3).</li>
	<li>Transferi o material do gel para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 µm usando buffer de transferência (25 mM Tris base, glicina 192 mM, pH 8,4) suplementado com 20% de metanol.</li>
	<li>Bloquear a membrana com 3% albumina de soro bovino (BSA) por 1h à temperatura ambiente. Usando marcadores de pre-manchado peso molecular como guias, corte a membrana horizontal, borre a parte superior com um anticorpo contra HisP e borre a parte de baixo com um anticorpo contra o epítopo myc para identificar o peptídeo myc-tag. Nota: No nosso caso particular, corte da membrana não é necessária uma vez que ambos HisP e Myc-fll-GLUT4 podem ser detectado com um anticorpo anti-myc.</li>
</ol>7. análise dos resultados
<ol><li>Quantificar a intensidade de todos os sinais de Western blot utilizando um programa de imagem estação ou ImageJ.</li>
	<li>Normalize o sinal do peptide myc-marcados contra o sinal do HisP em ambos os valores de pH.</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Sortilin é um receptor de proteína de ligante multi conservada evolucionária que está envolvido em ambos sinalização na membrana plasmática e no intracelular classificação eventos6,7. No entanto, a busca por ligantes do sortilin o autêntico (alguns dos quais são proteínas de membrana luminal ou integral) é complicada, como a interação do sortilin com alguns dos seus parceiros de ligação parece ser sensível aos detergentes. Portanto, uma fácil e uma abordagem gene...

GLUT4 é uma proteína de transporte de glicose que se expressa predominantemente nas células do músculo esquelético e gordura onde que medeia o efeito da insulina no sangue pós-prandial glicose autorização1. Sendo uma proteína muito estável, GLUT4 é regulada em um nível pós-traducional. Na ausência de insulina, GLUT4 é em grande parte excluídos da membrana plasmática (daí baixa permeabilidade basal de glicose) e está localizado principalmente no interior da célula em pequenas vesículas insulin-responsivos (IRVs) e rede trans-Golgi (TGN) que é provável que representam o compartimento do doador IRV. Após a administração de insulina, os IRVs se fundem com a membrana plasmática e entregam GLUT4 para o site do seu funcionamento. Isto aumenta a permeabilidade da membrana plasmática de glicose, assim a absorção de glicose do sangue em adipócitos e miócitos esqueléticos aumenta 10 a 40 vezes. Após a retirada da insulina, GLUT4 é interiorizado em endossomos iniciais/classificação e então obtida para TGN onde os IRVs são re-formados. Ambos classificação passos na via de GLUT4, ou seja, recuperação dos periféricos endossomos iniciais para o perinuclear TGN e a formação dos IRVs sobre o doador TGN membranas são ativadas pelo membro da família Vps10p, sortilin, que representa um tipo I proteína transmembranar e um receptor de classificação. De acordo com um modelo, o sortilin funciona como uma proteína transmembrana andaime: liga GLUT4 no lúmen dos endossomos e TGN e recrutas retromer ou Clatrina adaptadores para o lado citoplasmático da doadora membrana através de seu C-terminal2, 3. isso facilita a distribuição de GLUT4 em operadoras vesiculares que translocar GLUT4 entre compartimentos intracelulares.
A interação da cauda citoplasmática de sortilin com retromer e várias proteínas do adaptador tem sido bem documentada. No entanto, a ligação do sortilin GLUT4 (e vários de seus outros ligantes de proteína) tem sido desafiador para provar. Em particular, as tentativas de co-immunoprecipitate sortilin e GLUT4 não foram bem sucedidas, provavelmente devido à natureza de detergente sensível da interação entre estas duas proteínas. Além disso, como uma proteína de transporte típico, GLUT4 tem 12 domínios transmembranares e 6 loops luminal qualquer combinação de que potencialmente pode representar um sítio de ligação a sortilin. Ao mesmo tempo, um grande corpo de evidências indiretas, tais como localização co substancial na célula, cross-linking com DSP membrana permeável e a interação em dois sistema híbrido de levedura sugerem que sortilin pode ligar a GLUT4. Além disso, usando a última abordagem em uma combinação com a alanina digitalização mutagênese, nós determinamos anteriormente que o domínio de Vps10p de sortilin vincula-se principalmente para o primeiro loop luminal de GLUT4. No entanto, a prova de tal interação em células de mamíferos está desaparecido. Aqui, isolamos o sortilin com sua Tag de células transfectadas 3T3-L1 usando resina de cobalto e demonstrado que ele pode interagir com quimicamente sintetizado peptídeo correspondente ao primeiro loop luminal de GLUT4 no pH 6 e pH 8 que se assemelham a meio ácido na CDDP lúmen e ambiente neutro no lúmen das membranas TGN. Nenhuma ligação de peptídeo foi detectada em experimentos de controle onde o extrato preparado a partir de células transfectadas não foi carregado sobre as mesmas contas.

<table><tbody><tr><td>Coquetel inibidor de protease</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>para uso na purificação da proteína de etiqueta de histidina</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1mL Seringa de Insulina U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lavagem</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>Para purificação de proteína His-tag</td></tr><tr><td>Resina de Cobalto HisPur</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de amostra de tricina Bio-Rad</td><td></td><td>161-0739</td><td>com SDS, bMercaptaetanol deve ser adicionado</td></tr><tr><td>Eluição&nbsp; Tampão</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-236</td><td>Para purificação de proteína His-tag com 250mM Imidazole</td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine géis pré-moldados 10-20%&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>Para separação de peptídeo e pequena proteína</td></tr><tr><td>Tris/Tricine/SDS running buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Transferência</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>Adicione 20% de metanol</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose&nbsp; 0.45 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Anti Myc anti Myc anticorpo</td><td>Sinalização Celular</td><td>2272</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo de Coelho</td><td>Genscipt</td><td></td><td>personalizar</td></tr><tr><td>pedidos Precision Plus Protein Dual color Standarts</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Nossa capacidade de explorar as interações da proteína-proteína é a chave para a compreensão de conexões regulamentares na célula. No entanto, a detecção de interações da proteína-proteína em muitos casos é associada com desafios significativos experimentais. Em particular, classificação de receptores interagem com sua carga de proteína no lúmen dos compartimentos da membrana muitas vezes de forma sensível detergente, fazendo co-imunoprecipitação destas proteínas inutilizável. Ligação da classificação sortilin do receptor para o transportador de glicose que GLUT4 pode servir como um exemplo de fracos luminal interações entre proteínas de membrana. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, simples e barato para validar a interação entre sortilin e GLUT4. Por isso, nós temos projetado e quimicamente sintetizado o peptídeo myc-tag correspondente para o potencial sortilin-ligação epítopo na parte luminal de GLUT4. Sortilin marcado com seis histidines foi expressa em células de mamíferos e isolada de lisados celulares usando grânulos de cobalto. Sortilin imobilizada em grânulos foi incubado com a solução de peptídeo em valores de pH diferentes, e o material eluted foi analisada pela mancha ocidental. Este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outras interações da proteína-proteína de detergente sensíveis.

Lisados foram preparados a partir 3T3 L1 células transfectadas estàvel com Sortilin-myc/His5 e de células de L1 3T3 WT, usadas como um controle negativo. Ambos os lisados foram incubados com grânulos de cobalto em pH 6 ou pH 8 e cuidadosamente lavados. Grânulos com proteínas imobilizadas em seguida foram incubados na solução de Myc-fll-Glut4. Após cuidadosos lavagens, proteínas vinculadas aos talões foram eluídas com 0,25 M de imidazol. Amostras foram submetidas, j...

Descreveremos um protocolo para a deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana, usando a ligação do receptor classificação, sortilin, o primeiro loop luminal da proteína do transportador de glicose, GLUT4, como exemplo.

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar interações sensíveis ao detergente entre proteínas de membrana ou outras proteínas. Este procedimento requer que uma proteína seja marcada com histidina e superexpressa nas células, enquanto a outra é um peptídeo marcado com myc. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da bioquímica importantes estudos de interação de proteínas.A principal vantagem desta técnica é a capacidade de detectar a interação entre as proteínas da membrana de forma sensível ao detergente. O procedimento é rápido e fácil. Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações entre proteínas de membrana, ele também pode ser usado para estudar interações de proteínas fracas.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando queríamos verificar a interação entre as proteínas de membrana, Saltilin e GLUT4, mas as tentativas de co-imunoprecipitá-las a partir da lise de mamíferos não tiveram sucesso. Para fazer um pedido para o peptídeo, selecione a sequência alvo do peptídeo crítico para interação e adicione um epítopo myc no final ou no terminal C da sequência. Uma vez que o peptídeo chegou, pepare 100 microgramas por mililitro de sol

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho de detecção de fluorescência para rastrear a estabilidade da proteína de membrana fundida com proteína fluorescente verde (GFP) em Escherichia coli após a solubilização do detergente. Proteínas que exibem um pico simétrico no perfil de exclusão de tamanho com pouca ou nenhuma GFP livre indicam proteínas purificadas com degradação e agregação mínimas, que podem ser posteriormente selecionadas para análise...

Cromatografia de exclusão de tamanho por detecção de fluorescência: uma técnica para identificar a integridade de proteínas de membrana fluorescente após solubilização de detergente

A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana In Vivo

Uma abordagem simplificada para a triagem para a expressão de proteínas de membrana recombinantes em Escherichia coli com base na fusão de proteína fluorescente verde é apresentada.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Apresentamos um método que combina purificação de proteína de membrana e reconstituição em peptidiscs em um único passo cromatográfico. Andaimes biotinylados são usados para fixação direta da superfície e medição de interações proteína-ligand através da interferometria da biocamada.

PeptiQuick, uma incorporação de um passo de proteínas da membrana em Peptidiscs biotinylated para ensaios obrigatórios de proteína aerodinâmica

Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Aprenda a detectar interações sensíveis a detergente entre proteínas de membrana usando marcadores de histidina e myc. Este método permite estudar interações proteicas fracas em contexto bioquímico relevante com sortilin e GLUT4.

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

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