Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

O objetivo geral deste procedimento é detectar interações sensíveis ao detergente entre proteínas de membrana ou outras proteínas. Este procedimento requer que uma proteína seja marcada com histidina e superexpressa nas células, enquanto a outra é um peptídeo marcado com myc. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da bioquímica importantes estudos de interação de proteínas.

A principal vantagem desta técnica é a capacidade de detectar a interação entre as proteínas da membrana de forma sensível ao detergente. O procedimento é rápido e fácil. Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações entre proteínas de membrana, ele também pode ser usado para estudar interações de proteínas fracas.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando queríamos verificar a interação entre as proteínas de membrana, Saltilin e GLUT4, mas as tentativas de co-imunoprecipitá-las a partir da lise de mamíferos não tiveram sucesso. Para fazer um pedido para o peptídeo, selecione a sequência alvo do peptídeo crítico para interação e adicione um epítopo myc no final ou no terminal C da sequência. Uma vez que o peptídeo chegou, pepare 100 microgramas por mililitro de solução de trabalho do peptídeo em água ultra pura.

Semear três células pré-adipócitos 3T3-L1 em quatro placas de cultura de 10 centímetros e mantê-las na incubadora. Em seguida, transfecte duas placas de cultura com a proteína-alvo marcada com histodina 6X e rotule como HISP nas outras duas placas com dois plasmídeos de controle e rotule como WT. Após a transfecção, deixe as células na incubadora por 48 horas para atingir 80 a 90% de confluência. Para preparar o lisado celular, lave as células em gelo três vezes com 10 mililitros de solução salina tamponada 1X resfriada a quatro graus Celsius.

Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de lise a cada um deles. Em seguida, retire as células dos pratos usando um raspador de células para preparar o lisado. Transfira o lisado celular preparado de cada placa de cultura para quatro tubos separados de 1,5 milímetro e rotule todos os tubos.

Em seguida, passe o lisado celular por uma seringa com agulha de calibre 26 para cima e para baixo por cinco vezes para lise celular total. Em seguida, centrifugue os lisados celulares a 16000xg por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira os sobrenadantes para quatro novos tubos rotulados de forma idêntica.

Para futuras experiências de solução de problemas e controle, alíquota de 20 microlitros do lisado celular e armazene-o a 20 graus Celsius. Para uso posterior, titule o tampão de lavagem em PH8 com ácido clorídrico para obter PH6 e armazene o tampão a quatro graus Celsius. Em seguida, para preparar uma suspensão homogênea das contas de cobalto, gire cuidadosamente a garrafa.

Em seguida, transfira 40 microlitros de suspensão de esferas de cobalto para todos os quatro tubos marcados individualmente. Depois de adicionar as esferas de cobalto, adicione um mililitro de tampão de lise aos tubos. Em seguida, centrifugue os tubos a 1000xg por cinco segundos.

Descarte o sobrenadante e pipete 40 microlitros de tampão de lise para as esferas assentadas. Em seguida, transfira o lisado celular para os tubos correspondentes e incube a quatro graus Celsius por 90 minutos em um rotador de tubo. Após 90 minutos, centrifugue as amostras a 1000xg por cinco segundos.

Em seguida, colete o sobrenadante rotulado como Flowthrough-1 e armazene a 20 graus Celsius. Em seguida, adicione 500 microlitros do tampão de lavagem com PH8 aos tubos individuais e ressuspenda os grânulos suavemente. Centrifugue os tubos a 1000xg por cinco segundos e expulse os sobrenadantes.

Em seguida, adicione tampão de lavagem com PH8 com ou seis aos tubos, de acordo com as etiquetas e ressuspenda bem as contas. Centrifugue os tubos a 1000xg por cinco segundos e expulse os sobrenadantes. Preparar uma solução de trabalho de um micrograma por mililitro do péptido e do tampão de água com PH6 ou oito.

Em seguida, adicione 100 microlitros da solução peptídica aos grânulos lavados correspondentes a PH semelhante. Em seguida, incube as contas a quatro graus Celsius em um rotador de tubo por 30 minutos. Em seguida, pegue quatro microcolunas, rotule-as e coloque as colunas em tubos de coleta rotulados como Flowthrough-2. Após o término da incubação, adicione a mistura de incubação às colunas.

Deixe a solução passar por força gravitacional e colete a amostra do fluxo. Coloque as colunas em novos tubos de coleta e armazene a 20 graus Celsius. Em seguida, passe 500 microlitros de tampão de lavagem com PH6 ou oito por fluxo gravitacional através das colunas individuais e descarte o fluxo.

Repita esta etapa quatro vezes. Centrifugue os tubos a 1000xg por cinco segundos. Coloque a coluna no novo tubo de coleta rotulado Elution.

É importante lavar as contas em todos os tubos com muito cuidado e igualmente para se livrar do peptídeo não ligado. Às esferas lavadas, adicione 40 microlitros de tampão de amostra de tricina com beta mercaptoetanol. Deixe descansar por 20 minutos em temperatura ambiente.

Centrifugue a coluna a 8000xg por dois minutos. Descarte as colunas e aqueça os tubos coletores a 100 graus Celsius por 10 minutos. E então, centrifugue a 1000xg por cinco segundos.

Como alternativa, adicione 40 microlitros de tampão Elution Imidazole às esferas lavadas e incube em temperatura ambiente por 20 minutos. Após o término da incubação, centrifugue os tubos a 8000xg por dois minutos. Rejeitar as colunas e adicionar 40 microlitros de tricina amostra.

Aqueça os tubos coletores a 100 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, centrifugue-os a 1000xg por cinco segundos. Use os géis gradientes de 10-20% de tricina disponíveis comercialmente. Use o tampão de corrida Tris / Tricina / SDS, carregue 20 microlitros cada uma das amostras eluídas e lisados totais no gel e comece a operar a unidade de eletroforese.

Quando a eletroforese terminar, use tampão de transferência suplementado com 20% de metanol para transferir o material do gel para a membrana de nitrocelulose de 0,45 micrômetro. Depois de bloquear a membrana, corte-a horizontalmente. Em seguida, sonde a porção superior da membrana com anticorpo Anti His P na metade inferior da membrana com anti myc.

Para estudar a interação entre a sortilina imobilizada em grânulos de cobalto em GLUT4, foi realizada análise de immunoblot. Os lisados e eluatos celulares foram obtidos em células 3T3-L1 transfectadas do tipo selvagem e Sortilin-myc/His e depois carregados na página SDS. O blot foi sondado com anticorpo anti-myc.

A mancha mostra um Sortili-myc/His de 110 kilodotina e cinco kilotin myc-first luminal loop-GLUT4 dos eluatos transfectados. Em seguida, para estudar a importância do PH e a interação entre a sortilina imobilizada em esferas de cobalto e o GLUT4, foi realizada análise de immunoblot. Neste ensaio, a primeira alça luminal Myc GLUT4 foi incubada com grânulos imobilizados com proteínas marcadas com Sortilin-myc / His em PH6 e oito.

O blot mostra uma clara interação entre Sortilin-myc/His e myc-first luminal loop GLUT4 tanto em PH6 quanto em oito dos eluatos obtidos das células 3T3-L1 transfectadas marcadas com Sortilin-myc/His. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas até que as amostras estejam prontas para análise de sangue ocidental. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de projetar um peptídeo que seja solúvel, de preferência em água.

Para fortalecer seus resultados, outros métodos, como imunoprecipitação após reticulação, podem ser realizados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar proteínas de membrana e interações proteicas em um procedimento sensível a detergentes. Também permite explorar a interação entre fragmentos de proteínas.

Jazz rítmico suave.