Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14⁺ humanos

Buscamos entender quais tratamentos imunomoduladores podem gerar células dendríticas toleradas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos já diferenciadas, e isso é muito valioso para pesquisas autoimunes e de transplante. As autoterapias estão se tornando mais práticas devido aos avanços na fabricação e as células dendríticas tolerogênicas têm se mostrado promissoras em estudos pré-clínicos. Eles podem gerar tolerância específica ao antígeno. O mais comum é para citometria. Isso fornece uma maneira rápida e também acessível de analisar células toleradas. É desafiador gerar células dendríticas tolerogênicas que persistam em ambas as funções in vivo. É por isso que não existem terapias com células dendríticas clinicamente aprovadas para tolerados. Identificamos novas combinações de compostos imunomoduladores de grandes estudos de triagem que mostram melhora na funcionalidade tolerada das células dendríticas. Também projetamos formulações de nanopartículas tolerantes.

[Instrutor] Para começar, coloque os tubos de 15 mililitros contendo monócitos humanos enriquecidos e com células T em uma centrífuga. Após a centrifugação estar completa, use uma pipeta para aspirar o sobrenadante dos tubos. Adicione um mililitro de meio de cultura MODC ao pellet de monócitos, um mililitro de meio de cultura de células T ao tubo com as células T e misture bem antes da contagem de células. Em seguida, adicione nove mililitros de meio de cultura MODC quente à suspensão de monócitos para fazer o volume final de 10 mililitros. Em seguida, pipete 100 microlitros de cada uma das soluções estoque de GM-CSF e IL-4. Transfira a suspensão para uma placa de Petri rotulada, marcada como MODC, e incuba. Em seguida, adicione um mililitro de meio de congelamento de células T à suspensão de células T. Divida a mistura em dois frascos criogênicos de dois mililitros. Coloque os frascos criogênicos selados em uma câmara de congelamento com tubos de balanceamento em poços não utilizados. No quarto dia, adicione cinco mililitros de meio de cultura MODC fresco ao tubo de monócitos. Em seguida, pipete 100 microlitros cada uma das soluções estoque de GM-CSF e IL-4 sete e incube até o sétimo dia. No sétimo dia, transfira as células dendríticas derivadas de monócitos diferenciados, ou MDOCs, para um tubo de 50 mililitros e centrifugue como antes. Adicione um mililitro de meio de cultura MODC quente ao pellet celular e pipete para cima e para baixo para misturar bem. Conte as células usando um hemocitômetro. Diluir a suspensão com meio de cultura MODC quente contendo GM-CSF e IL4 até obter a concentração celular desejada. Dispense 100 microlitros da suspensão contendo 30.000 células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços. Adicione um microlitro de drogas imunomoduladoras nos poços designados e incuba. No dia seguinte, centrifugue a placa MODC a 300 G por cinco minutos. Depois de remover suavemente o sobrenadante, adicione suavemente 200 microlitros de HBSS quente na lateral da placa e centrifugue. Novamente, adicione 100 microlitros de meio de cultura MODC quente contendo GM-CSF e IL4 após aspiração sobrenadante. Se a imunoestimulação for usada, adicione um microlitro de estoque 100X de lipopolissacarídeo aos poços designados e incuba. No oitavo dia, descongele dois frascos criogênicos em um banho de esferas quentes a 37 graus Celsius até que o conteúdo comece a derreter. Depois de parcialmente descongelados, transfira os frascos para uma capa de cultura de células. Em seguida, adicione um mililitro de meio de cultura de células T quente para descongelar rapidamente as células. Transfira o conteúdo para um tubo de 50 mililitros e lave os frascos criogênicos com mais um mililitro de meio de cultura de células T para coletar todas as células. Complete a suspensão com solução de coloração de fluxo para 15 mililitros e centrifugue. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de solução de coloração de fluxo e centrifugue novamente, depois ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio de cultura de células T quente após pipetar o sobrenadante. Adicione nove mililitros de meio de cultura de células T quente para fazer um volume final de 10 mililitros. Transfira a suspensão para uma placa de Petri rotulada como células T descongeladas e incuba. No oitavo dia, centrifugue a placa MODC a 300 G por cinco minutos. Depois de pipetar o sobrenadante, adicione 200 microlitros de solução de coloração de fluxo a cada poço e incuba. Em seguida, pipete para cima e para baixo para remover as células ligadas e a suspensão da célula para uma nova placa de fundo em V de 96 poços antes de centrifugar novamente. Pipete 50 microlitros de anticorpo inibidor de ligação ao receptor FC em cada poço após aspirar o sobrenadante para bloquear a ligação inespecífica. Depois de incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos, adicione 50 microlitros do coquetel de anticorpos do painel de validação preparado em cada poço. Misture 50 microlitros de grânulos de compensação com 50 microlitros de cada anticorpo diluído em tubos de 1,5 mililitro e incuba. Centrifugar a placa a 300 g durante cinco minutos. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de solução de coloração de fluxo para lavar as células. Após a lavagem final e centrifugação, ressuspender as células em 110 microlitros de solução de coloração de fluxo para análise por citometria de fluxo. Para os MODCs tolerogênicos, substitua o coquetel de anticorpos pelo coquetel do painel de tolerância. No nono dia, transfira a placa de Petri de células T descongelada para um tubo de 50 mililitros e complete o tubo com solução de coloração de fluxo. Use o segundo tubo contendo células T não coradas para análise trigonométrica. Girar os tubos a 250 G durante cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda as células em meios de cultura de células quentes. Conte as células T e certifique-se de que um mínimo de 4 milhões de células sejam obtidas. Centrifugar a placa MODC a 300 G durante cinco minutos. Depois de aspirar os sobrenadantes, adicione 200 microlitros de células T em cada poço. Adicione células T não coradas para placas de análise trigonométrica. Adicione 25 microlitros por mililitro de coquetel de anticorpos anti-CD3 / CD28 a todos os grupos, exceto poços de controle negativo, para estimular as células T e incubar até o dia 12. Em seguida, transfira todas as suspensões de células da placa de cultura de 96 poços para uma placa de fundo em V com solução de coloração de fluxo. Lave as células duas vezes em 200 microlitros de solução de coloração de fluxo. Separe algumas células para controles de compensação. Após a segunda lavagem, centrifugue a placa. Em seguida, adicione 50 microlitros de anticorpo inibidor de ligação ao receptor FC diluído em cada poço e incuba. Quando a incubação estiver completa, adicione 50 microlitros do coquetel de anticorpos do painel trigonométrico preparado em cada poço. Para controles de compensação, misture 50 microlitros de células de compensação não coradas com 50 microlitros de cada anticorpo corado. Incube a placa e os controles de compensação a quatro graus Celsius por uma hora e, em seguida, lave com solução de coloração de fluxo antes de centrifugar. Agora core as células com corante Near-IR vivo / morto diluído em HBSS a 200 microlitros por poço antes da incubação a frio. Lave e centrifugue a placa antes da coloração com Fox P3 e análise por citometria de fluxo. No primeiro dia, os monócitos indiferenciados eram predominantemente HLA-DR-menos com um pequeno CD14 menos, enquanto os monócitos diferenciados no sétimo dia mostraram a maioria das células como HLA-DR-mais CD14 menos, CD1c-mais, CD141 mais. O tratamento com rapamicina com e sem lipopolissacarídeo reduziu significativamente as populações DC-SIGN-plus CD1c-plus e inibiu a regulação positiva dos marcadores CD86 e CD40 observados apenas com o tratamento com LPS. As populações de células reguladoras de T FOX P3-plus foram aumentadas quando os MDCs foram co-cultivados com células T. Mas não foram observadas diferenças significativas entre os quatro grupos de tratamento do MODC. A proliferação de células T foi reduzida nas populações de células T CD4-plus e CD8-plus após co-cultura com MDOCs tratados com Rapa. As amostras tratadas com interleucina-10 aumentaram significativamente a produção de interleucina-10 em 24 horas. Os MDOCs tratados com dex aumentaram significativamente a produção de interleucina-10, mas somente após repouso por 72 horas. O pré-tratamento com dexametasona reduziu a geração média de TNF alfa após o tratamento com LPS em 24 horas. Aumentos significativos nos MDOCs PDL1-plus foram observados nos grupos tratados com Dex mais LPS e Rapa em 72 horas. A supressão da expressão de CD86 foi observada em todos os grupos tratados com imunomoduladores em 24 e 72 horas. Os MDOCs tratados com imunomoduladores não aumentaram a proliferação de células T CD4-plus.