Análise baseada em citometria de fluxo da ativação de células dendríticas usando complexos imunes

Comece com uma suspensão de células tumorais quimicamente fixadas.

Adicione uma concentração ideal de imunoglobulina G de ligação ao tumor que se liga aos antígenos da superfície das células tumorais, formando complexos imunes ou ICs.

Transfira os CIs para uma placa de cultura contendo células dendríticas aderidas. Incubar.

A célula dendrítica reconhece o IC, internaliza-o e processa-o em fragmentos de peptídeos.

Os fragmentos são carregados em moléculas do complexo principal de histocompatibilidade classe II ou MHC-II e apresentados na superfície celular, juntamente com a molécula coestimulatória CD86.

Remova a mídia. Adicione um tampão de dissociação celular e pipete vigorosamente para separar as células.

Transfira as células para um tubo.

Centrifugue e ressuspenda as células em uma solução de bloqueio para bloquear interações não específicas.

Sobreposição com um coquetel de anticorpos marcado com fluoróforo visando MHC-II e CD86.

Adicione um corante de ligação ao DNA e incube brevemente para corar os núcleos das células mortas.

Usando citometria de fluxo, identifique as células vivas que co-expressam MHC-II e CD86, confirmando a ativação de células dendríticas mediadas por IC.

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