Análise baseada em citometria de fluxo da ativação de células dendríticas usando complexos imunes

Comece com uma suspensão de células tumorais quimicamente fixadas.

Adicione uma concentração ideal de imunoglobulina G de ligação ao tumor que se liga aos antígenos da superfície das células tumorais, formando complexos imunes ou ICs.

Transfira os CIs para uma placa de cultura contendo células dendríticas aderidas. Incubar.

A célula dendrítica reconhece o IC, internaliza-o e processa-o em fragmentos de peptídeos.

Os fragmentos são carregados em moléculas do complexo principal de histocompatibilidade classe II ou MHC-II e apresentados na superfície celular, juntamente com a molécula coestimulatória CD86.

Remova a mídia. Adicione um tampão de dissociação celular e pipete vigorosamente para separar as células.

Transfira as células para um tubo.

Centrifugue e ressuspenda as células em uma solução de bloqueio para bloquear interações não específicas.

Sobreposição com um coquetel de anticorpos marcado com fluoróforo visando MHC-II e CD86.

Adicione um corante de ligação ao DNA e incube brevemente para corar os núcleos das células mortas.

Usando citometria de fluxo, identifique as células vivas que co-expressam MHC-II e CD86, confirmando a ativação de células dendríticas mediadas por IC.

Primeiro, fixe as células em paraformaldeído tamponado a 1,8% por 10 minutos em temperatura ambiente. Semeie a suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços em forma de U. Em seguida, adicione diluições variadas de anticorpos de ligação ao tumor em cada poço. Depois disso, incube as células no gelo por 15 a 20 minutos.

Após a incubação, lave as células com 150 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e, em seguida, centrifugue a 400 vezes g por 5 a 10 minutos a 4 graus Celsius. Após a centrifugação, expulsar o sobrenadante e lavar as células duas vezes. Dissolva as células em 100 microlitros de tampão FACS, contendo anticorpo secundário conjugado com fluoróforo. Em seguida, incube o prato no gelo por 15 a 20 minutos.

Após 15 a 20 minutos, adicione 200 microlitros de tampão FACS para lavar as células. Centrifugue a placa a 400 vezes g durante 5 a 10 minutos. Decantar o sobrenadante. Realize citometria de fluxo para analisar a ligação do tumor e determinar a concentração mínima de imunoglobulina G necessária para revestir as células.

Uma vez que as células estejam revestidas com concentração mínima de imunoglobulina G, adicione o complexo imune tumoral marcado com CFSE às células dendríticas derivadas de monócitos em uma proporção de 1:5. Em seguida, incube a mistura por 12 a 16 horas durante a noite em meio completo. Realize a análise FACS da ativação de células dendríticas derivadas de monócitos.