Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

O objetivo geral desta técnica é detectar e quantificar biomoléculas pouco abundantes em amostras altamente complexas com alta sensibilidade, simplicidade, baixo custo, velocidade e sem o uso de qualquer marcação. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biotecnologia, bioquímica e biomedicina, como monitoramento ambiental, segurança alimentar, qualidade da água potável e diagnóstico médico. As principais vantagens desta técnica são sua rapidez inerente, simplicidade, alta sensibilidade, baixo custo, fácil manipulação e detecção em tempo real sem o uso de reagentes de marcação.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doenças devido à sua capacidade de quantificar biomoléculas pouco abundantes. Por exemplo, diferentes biomarcadores em tempo real. Para limpar as lamínulas de vidro, mergulhe-as em 10 mililitros de HCl 1,0 molar por 10 minutos em um limpador ultrassônico em temperatura ambiente.

Em seguida, mergulhe-os em água deionizada e hidróxido de sódio 1,0 molar nas mesmas condições. Seque as lamínulas de vidro com gás nitrogênio. Em seguida, mergulhe as lamínulas limpas e secas em 10 mililitros de uma solução APTES por uma hora para introduzir grupos amino na superfície da lamínula à temperatura ambiente.

Enxágue as lamínulas com água deionizada antes de secá-las novamente com gás nitrogênio. Mergulhe as lamínulas modificadas APTES em uma solução de 10 mililitros de glutaraldeído por duas horas para ativar os grupos amino na superfície à temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue as lamínulas com tampão fosfato 10 milimolar para remover o excesso de glutaraldeído da superfície.

Seque as lamínulas com gás nitrogênio. Em seguida, prepare 1,0 mililitro de solução molde em tampão fosfato 10 milimolar em uma concentração de 0,1 miligrama por mililitro. Coloque 200 microlitros desta solução molde nas lamínulas modificadas e incube a quatro graus Celsius durante a noite.

Para limpar os eletrodos, primeiro mergulhe os eletrodos em um pequeno béquer contendo cinco mililitros de etanol a 70% por 10 minutos em um limpador ultrassônico em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe sequencialmente os eletrodos em água deionizada, acetona, água deionizada, solução ácida de piranha e água deionizada nas mesmas condições. Seque os eletrodos com gás nitrogênio.

Para realizar a eletropolimerização da tiramina, prepare oito mililitros de solução de tiramina a 10 milimolares em tampão fosfato 10 milimolar contendo dois mililitros de etanol. Execute 15 ciclos de varreduras voltamétricas cíclicas nesta solução usando um potenciostato cobrindo uma faixa de potencial de zero a 1,5 volts e uma taxa de varredura de 50 milivolts por segundo. Em seguida, enxágue os eletrodos com água deionizada antes de secá-los com gás nitrogênio.

Mergulhe os eletrodos em uma solução contendo 30 milimolares de cloreto de acriloil e 30 milimolares de trimetilamina em tolueno em temperatura ambiente durante a noite antes de enxaguar e secar os eletrodos novamente. Antes da polimerização, prepare uma solução de monômero contendo monômeros e reticulador em 820 microlitros de água ultrapura. Em seguida, prepare 5% volume a volume TEMED em água ultrapura.

Adicione 20 microlitros da solução TEMED à solução de monômero e purgue com gás nitrogênio por cinco minutos. Em seguida, adicione 20 microlitros de APS recém-preparado na solução de monômero. Pipete 1,5 microlitros da solução de monômero na superfície do eletrodo de ouro modificado.

Agora, inicie a polimerização colocando o carimbo do molde em contato com a superfície tratada com monômero e deixe-o por cinco horas em temperatura ambiente. Após a polimerização, remova o carimbo do modelo da superfície com cuidado, usando uma pinça. Em seguida, enxágue o eletrodo com água deionizada e seque com gás nitrogênio.

Mergulhar os eléctrodos em um mililitro de dez milómeros de um dodecanetol preparado em etanol durante vinte minutos, a fim de cobrir os orifícios na superfície do eléctrodo. Por fim, enxágue os eletrodos com água deionizada e seque os eletrodos com gás nitrogênio antes de caracterizar suas superfícies com microscopia eletrônica de varredura. Insira os eletrodos de ouro capacitivos impressos na célula de fluxo eletroquímico integrada a um biossensor capacitivo.

Prepare 100 mililitros de tampão de regeneração e um litro de tampão de funcionamento. Inicie a análise com a injeção de buffer de regeneração para regenerar o sistema e buffer de execução para reequilibrar o sistema por 25 minutos. Prepare soluções de modelo padrão na faixa de concentração desejada no buffer de corrida.

Em seguida, injete 250 microlitros dessas soluções padrão sequencialmente no sistema em condições ideais. A caracterização da superfície dos eletrodos de ouro é realizada por microscopia eletrônica de varredura. A superfície dourada nua é mostrada.

Também são mostrados bacteriófagos aderentes à superfície do eletrodo em diferentes ampliações. Aqui é mostrada a ligação de bacteriófagos em tempo real ao eletrodo de ouro impresso por meio de um sensograma. Uma linha de base estável é estabelecida após a regeneração e reequilíbrio do sistema antes da injeção da amostra.

Existem cavidades específicas de fagos no eletrodo. A injeção dos bacteriófagos indutores de amostra resulta em uma capacitância reduzida, devido à ligação dos bacteriófagos alvo às cavidades impressas na superfície dos eletrodos de ouro. As curvas de calibração mostram a mudança de capacitância versus injeção de proteína na injeção de bacteriófagos.

A partir das equações desses gráficos, é possível calcular a concentração de bacteriófago ou proteína em uma amostra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um sistema de detecção ultrassensível, rápido e em tempo real. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas e trinta minutos, excluindo os tempos de espera intermediários.

Ao tentar este procedimento, é importante preparar todos os agentes frescos, no mesmo dia. Seguindo este procedimento, outras métricas, como microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de varredura, elipsômetro e medições de ângulo quântico, podem ser realizadas para determinar se a polimerização ou impressão foi bem-sucedida e para detectar qualquer diferença significativa entre as superfícies de eletrodos de ouro nus e impressos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de bioquímica, biotecnologia e biomedicina explorarem uma detecção ultrassensível de uma biomolécula na segurança alimentar e no diagnóstico médico.

Não se esqueça de que trabalhar com monômeros funcionais, reticuladores, iniciadores e outros agentes pode ser extremamente perigoso. E, precauções como usar luvas, jalecos de laboratório e realizar os experimentos de polimerização dentro da hotte, devem sempre ser tomadas, durante a realização desses experimentos.