Name: Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a detectar biomarcadores de ultra-alta sensibilidade usando um biosensor capacitivo baseado em impressão molecular. Este método permite a detecção em tempo real sem marcação, com aplicações em biotecnologia e diagnóstico médico.

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Maria Baumgarten (plataforma de biotecnologia IQ, infecção de medicina, Universidade de Lund) é reconhecido pela execução e fornecer varredura micrografias de elétron. Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa Sueco The Conselho Formas (2017-00100) como parte da terceira comum programação iniciativa europeia na chamada de resistência antimicrobiana (JPIAMR) "Dinâmica de transmissão." Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, interpretação, escrita, preparação do manuscrito, decisão de submeter ou a decisão de publicar o trabalho.

1. modificação de lamínulas de vidro (modelo selos)
<ol><li>Para limpar as lamínulas de vidro, mergulhe-os sequencialmente em 10 mL de HCl 1,0 M, água deionizada e 1,0 M de NaOH, respectivamente, por 10 min em cada etapa em um líquido de limpeza ultra-sônico à temperatura ambiente.<ol>
<li>Seque as lamínulas de vidro com gás nitrogênio. Nota: As lamínulas são secas por evaporação sob um fluxo de nitrogênio gasoso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhe as lamínulas limpas e secas em 10% (v/v), 10 mL da solução de 3-amino-propil-triethoxysilane (APTES) em etanol por 1h introduzir grupos aminoácidos na superfície de vidro, à temperatura ambiente.<ol>
<li>Lave as lamínulas com água desionizada.</li>
		<li>Seque as lamínulas com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhe as lamínulas APTES-modificado em 5% (v/v), 10 mL da solução de glutaraldeído em 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) por 2 h a fim de ativar os grupos aminoácidos na superfície, a temperatura ambiente6,15.<ol>
<li>Lave as lamínulas com 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) a fim de remover o excesso glutaraldeído da superfície.</li>
		<li>Seque as lamínulas com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 1,0 mL de solução de modelo (proteína/bacteriófago) em 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) na concentração de 0,1 mg/mL. Nota: Dissolva 0,1 mg de proteína em 1,0 mL de tampão fosfato (10 mM, pH 7,4). Se necessário, um espectrofotômetro (280 nm) pode ser usado para determinar a concentração de proteína.<ol>
<li>Largue a 200 µ l desta solução de modelo para as lamínulas modificadas e incubar a 4 ° C durante a noite. Nota: A solução do modelo em excesso pode ser usada para preparar 1-2 mais selos do modelo a ser usado nos estudos de caracterização.</li>
		<li>Lave as lamínulas com 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) a fim de remover o modelo desvinculado da superfície. Nota: Para enxaguar os eléctrodos, lave-os com tampão fosfato (10 mM, pH 7,4) por 30 s.</li>
		<li>Seque as lamínulas com gás nitrogênio. Nota: As lamínulas devem ser armazenadas a 4 ° C até que eles são usados na etapa de polimerização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. modificação de eletrodos de ouro capacitivos
<ol><li>Para limpar os eletrodos, mergulhar os eléctrodos num copo pequeno, sequencialmente, contendo 5 mL de etanol (70%), água deionizada água, acetona, água desionizada, solução ácida piranha (3:1, H2SO4: H2O2, v/v) e deionizada água, respectivamente, para 10 min em cada etapa, em um líquido de limpeza ultra-sônico à temperatura ambiente.<ol>
<li>Seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para executar o electropolymerization de tiramina, prepare-se 8 mL de solução de tiramina de 10 mM em 10 mM fosfato tampão (pH 7,4) contendo etanol (2 mL)15. Nota: O volume total da solução de tiramina deve ser 8 mL no total incluindo 2 mL de etanol.<ol>
<li>Executar varreduras voltamétricos cíclicas (15 ciclos) nesta solução usando um potentiostat cobrindo um potencial intervalo de 0 - 1.5 V (Ag/AgCl) e uma taxa de varredura de 50 mV/s30.</li>
		<li>Lave os eletrodos com água desionizada.</li>
		<li>Seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhar os eléctrodos em uma solução contendo cloreto de acryloyl de 30 mM e 30 mM trimetilamina em tolueno (Vtotal = 5 mL) à temperatura ambiente durante a noite,6,15,30.<ol>
<li>Lave os eletrodos com água desionizada. Nota: Para garantir uma melhor remoção de acryloyl não tenha reagido resíduos cloreto e trimetilamina, também é possível lavar a superfície com NaOH após água desionizada.</li>
		<li>Seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação do modelo de impresso capacitivos eletrodos de ouro
<ol><li>
Preparação do bacteriófago impresso capacitivos eletrodos de ouro
	<ol>
<li>Antes da polimerização, prepare uma solução de monómero que contém monômero (N-hidroximetil acrilamida) e cross-linker (polietileno glicol-400-Dimetacrilato) na proporção de 1:5 em 1 mL de 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) (mol/mol). Nota: A solução de monómero que contém monômero e cross-linker pode ser usada em diferentes proporções, ou os tipos do monômero e cross-linker podem ser alterados de acordo com o modelo para otimização da interação específica.</li>
		<li>Adicione 1 mg de foto-iniciador para esta solução. Nota: Se a polimerização é realizada sob a luz UV, então o foto-iniciador deve ser usado para iniciar a polimerização. Se a polimerização é realizada pela polimerização do radical livre, o tipo de iniciador deve ser alterado.</li>
		<li>Pipete 1,5 µ l desta solução para a superfície de ouro do eletrodo ouro modificado. Nota: A superfície de ouro do eléctrodo é mostrada esquematicamente na Figura 1.</li>
		<li>Trazer o carimbo modelo em contacto com a solução de monômero na parte superior da superfície do eletrodo de ouro.</li>
		<li>Iniciar a polimerização UV (365 nm, 400 W) e continue por 15 min31. Nota: A polimerização UV é executada dentro de um armário de refrigeração, que é definido para-25 ° C antes de iniciar a polimerização. Então, a sistema de cura a luz UV é ativada e a polimerização é continuada por 15 min antes de desligar a sistema de fotopolimerização de luz UV.</li>
		<li>Remova o selo de modelo da superfície com o uso de fórceps. Nota: Ao remover o selo de modelo da superfície, a película polimérica na superfície pode ser danificada. Portanto, o carimbo deve ser removido da superfície com muito cuidado e lentamente sem usar força.</li>
		<li>Enxaguar a superfície do eletrodo com água deionizada e seque-o com gás nitrogênio.</li>
		<li>Mergulhe os eléctrodos em 1 mL de 10 mM 1-dodecanethiol preparado em etanol por 20 min para cobrir furos na superfície do eletrodo.</li>
		<li>Lave os eletrodos com água desionizada e seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de proteína impresso capacitivos eletrodos de ouro
	<ol>
<li>Antes da polimerização, preparar uma solução de monômero contendo monômeros (acrilamida: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µ l; N-isopropylacrylamide: mg 85,6) e cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) em 820 µ l de água ultra pura30,32.</li>
		<li>Prepare-se 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) em água ultra pura.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l da solução TEMED para a solução de monômero e purga com gás de nitrogênio por 5 min.</li>
		<li>Prepare-se 10% (p/v) persulfato de amónio (APS) em água ultra pura.</li>
		<li>Adicione 20 µ l da solução de APS para a solução de monômero.</li>
		<li>Pipete 1,5 µ l da solução de monômero para a superfície do eletrodo de ouro modificada.</li>
		<li>Trazer o carimbo modelo em contacto com a superfície tratada com monômero.</li>
		<li>Iniciar a polimerização à temperatura ambiente e continue por 5 h. Nota: Para a preparação de proteína-impresso eletrodos de ouro, em vez de UV-polimerização, radicais livres polimerização à temperatura ambiente (25 ° C) é executada usando APS-TEMED como iniciador-catalisador.</li>
		<li>Remova o selo de modelo da superfície cuidadosamente usando fórceps.</li>
		<li>Lave o eletrodo com água deionizada e seque com gás nitrogênio.</li>
		<li>Mergulhe os eléctrodos em 1 mL de 10 mM 1-dodecanethiol preparado em etanol por 20 min para cobrir furos na superfície do eletrodo.</li>
		<li>Lave os eletrodos com água desionizada e seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Caracterização da superfície do eletrodo com microscopia eletrônica (SEM)
<ol><li>Monte os espécimes nos suportes de alumínio com fita adesiva de carbono.</li>
	<li>Revesti os eléctrodos com 10 nm de paládio/ouro.</li>
	<li>Examinar os eléctrodos com SEM.</li>
</ol>5. medições capacitivas em tempo real com modelo impresso capacitivos eletrodos de ouro
<ol><li>Inserir os eletrodos de ouro capacitivos imprimidos a célula eletroquímica fluxo integrada para um biossensor capacitivo.</li>
	<li>Preparar 100 mL de buffers de regeneração (25mm glicina-HCl, pH 2.5, incluindo 50mm Tween-20) e execução 1 L (para bacteriófago impresso sistema: fosfato 10 mM, pH 7,4; para o sistema de proteína-impresso: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4).</li>
	<li>Inicie a análise com a injeção de buffer de regeneração para regenerar o sistema e execução buffer para re-equilibrar o sistema por 25 min.</li>
	<li>Prepare soluções de modelo padrão na faixa de concentração desejada em reserva de marcha. Nota: Primeiro prepare um estoque da solução modelo dissolvendo 0,1 mg de proteína, ou aproximadamente 108 pfu bacteriófagos, em 1,0 mL de tampão de fosfato (fosfato 10 mM, pH 7,4). Então, prepare-se das soluções-padrão para a curva de calibração, fazendo dez diluições de 10 vezes sequenciais de solução-mãe. Essas soluções serão analisadas com o biosensor capacitivo na etapa 5.5. Concentração de proteína pode ser medida usando um espectrofotômetro (280 nm). Para medir a concentração do bacteriófago, pode ser usado um método de ágar de dupla camada, que é descrito em detalhes anteriormente19.</li>
	<li>Injectar 250 µ l destas soluções padrão sequencialmente para o sistema em ótimas condições (taxa de fluxo: 100 µ l/min, temperatura: 25 ° C). Nota: Nesta aplicação, as soluções de proteína padrão foram preparadas na faixa de concentração de 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, enquanto as concentrações de bacteriófago estavam no intervalo de 1.0 x 101 - 1,0 x 105 pfu/mL. As soluções foram colocadas na válvula de injeção e sequencialmente injetadas no sistema, injetando as amostras em triplica através da bomba de seringa única e a válvula multiporta. A diminuição da capacidade após injetar as soluções padrão decorrentes da vinculação do modelo das cavidades impressa é monitorada automaticamente pelo software do instrumento.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Quando este método é realizado, existem algumas etapas essenciais que devem ser consideradas ao seguir o protocolo. Um passo crítico é a etapa de limpeza com solução ácida de piranha. Passo 2.1 não deve ser mais de 10 min. A solução de modelo para a etapa 1.4 não deve exceder 0,1 mg/mL, desde que estes valores foram previamente otimizados. Exames titulimétricos cíclica não devem exceder 15 ciclos a fim de obter a espessura ideal. Para etapa 3.1.3, 1,5 µ l é um valor otimizado. Este valor não deve ser mais elevado para este tipo específico de eletrodo. Se o sistema de cura UV tem uma potência de 400 W, a polimerização deve ser executada por um período máximo de 10-15 min. Tão logo o APS (iniciador) é adicionado à solução após TEMED, a etapa subsequente deve ser executada muito rapidamente para evitar a polimerização imediata (passo 3.2.5).
Um dos passos mais importantes é a remoção do carimbo modelo da superfície após a polimerização UV. Se esta etapa não é realizada corretamente, há um risco de que o filme polimérico na superfície do eléctrodo pode ser removido com o carimbo. Portanto, é recomendável para mergulhar o eléctrodo e o carimbo de proteína no topo de uma solução de água após a polimerização e, em seguida, retire o selo muito lentamente e com cuidado a superfície (etapa 3.1.6).
Baseado no modelo utilizado, modificações no tipo e proporção de monômeros usados (monómero funcional e cross-linker) poderão ser avaliadas em termos de geração de maior sensibilidade. Isso deve ser determinado empiricamente. Além disso, a ligação de afinidade da molécula modelo geralmente envolve várias interações diferentes simultaneamente. Portanto, isso pode levar a problemas durante as etapas de regeneração. Se o modelo vinculado não é liberado da superfície corretamente, isso pode influenciar a capacidade de reutilização do eletrodo para posterior análise. Essas afinidades multipontos também podem resultar de ligação através de interações fracas. Em tais sistemas, inespecificas podem ter lugar, que pode influenciar negativamente o a seletividade do sistema16. Estas são comuns e gerais, limitações do método.
Além dessas limitações específicas, existem muitas vantagens significativas do método discutido sobre os métodos existentes. Enquanto RIAs, Elisa e medições fluorométrica são muito sensíveis, eles exigem o uso de material rotulado (modelo ou detector), enquanto o biosensor é completamente rótulo livre. Esses métodos também são mais caros e demorados. Uma abordagem de biosensor permite a síntese rápida, paralelo de MIPs em composições diferentes, o mesmo tempo16. Uma vez que apenas alguns microlitros de solução de monômero é necessária para a preparação, o método é conveniente quando usando caros ou não limitado de monômeros. Além disso, o único eletrodos MIP podem ser usados para aproximadamente 80 análises sem uma diminuição significativa no desempenho, que é significativamente maior do que outros de métodos existentes30. Os métodos existentes também sofrem, em graus variáveis, de baixa sensibilidade e seletividade, enquanto o método descrito permite para detecção e quantificação de moléculas na faixa de pM com alta seletividade.
Devido a relação custo-eficácia, a facilidade de operação do instrumento e a detecção sensível em tempo real em um curto período de tempo em comparação com os métodos existentes, os biosensores são muito promissor ponto-de sistemas de deteção de cuidados sob condições de campo; por exemplo, para monitoramento ambiental e para aplicações em países em desenvolvimento. Em muitas aplicações no diagnóstico da doença, detecção em tempo real, sensível, seletiva e rápida de um biomarcador em uma mistura complexa como o soro é necessário15,25. Aqui, biosensores são superiores aos métodos existentes, em particular, devido à sua sensibilidade e robustez. Especificamente para a detecção de agentes infecciosos, bacteriófagos são recentemente considerados como elemento de biorecognition alternativos para biossensores devido à sua especificidade anfitrião de bactérias33,34,35. Substituição de anticorpos com bacteriófagos é muito promissor, a fim de reduzir o custo e aumentar a estabilidade ainda mais36. Esse sistema também permitirá a detecção e quantificação do fago específico no ambiente e de amostras clínicas. Devido a prevalência de bacteriófagos e sua capacidade de transduce bactérias com genes de resistência aos antibióticos37,38, tal método pode ser valioso para estudar a propagação de bactérias resistentes.

A quantificação das biomoléculas é usada em muitos campos diferentes de pesquisa dentro da ciência, empregando métodos como o radioimunoensaio (RIA) ou ELISA1. Alguns desses métodos requerem um rotulado reagente como um radioisótopo ou uma enzima chamada anticorpo/antigénio, o que os torna trabalhosa e demorada com procedimentos complexos2. Além disso, a robustez, seletividade e sensibilidade desses métodos não são suficientes para todas as análises; em particular não são suficientes quando quantidades attogram precisam ser analisado, ao invés de pictograma quantidades3. Para este efeito, biosensores ganharam considerável interesse4,5, em especial em combinação com impressão molecular para uma maior robustez.
Impressão molecular baseia-se na criação de cavidades, polimerização de monômeros funcionais em torno do modelo6, criação de sites de reconhecimento artificial que lembram perfeitamente o modelo7. Esta técnica tem sido usada para diversas aplicações, incluindo sistemas de entrega de droga e separação analítica, mas também como elementos biorecognition em biosensores8,9,10. No entanto, existem ainda algumas dificuldades na concepção de polímeros molecularmente impressos (MIPs) para modelos macromoleculares como proteínas e células de11,12. Devido a isto, muitos pesquisadores concentraram-se na impressão a proteína modelo diretamente sobre um substrato, criando assim uma superfície que será reconhecida pela proteína alvo12. Esta técnica de revestimento de superfície usada para empregar cavidades de reconhecimento por grandes moléculas e montagens, incluindo proteínas é chamada microcontact impressão13,14. O procedimento geral do método depende da polimerização entre duas superfícies - um selo de modelo e um suporte de polímero - sobre a qual o modelo é adsorvido em uma superfície de15,16e trouxe em contato com o superfície tratada com monômero. Por esta maneira, uma película fina de polímero é formada com o apoio através de UV-polimerização. Finalmente, o modelo é removido, deixando para trás a cavidades específicas do modelo na superfície do eletrodo impresso. Este método tem algumas vantagens, incluindo uma perda reduzida atividade da molécula imprimida, quantidades muito pequenas, bem como exigindo de moléculas modelo para a impressão processam16,17. Assim, estas superfícies cost-effective, estáveis, sensíveis e seletivas podem ser criados nas superfícies de sensor, visando a qualquer modelo de escolha do usuário.
O biosensor pode ser usado para a detecção de proteínas simples e macromoléculas muito maiores, incluindo vírus. Um grupo específico de vírus ganhando interesse recente é o bacteriófago, que é um vírus que infecta bactérias. Detecção rápida e sensível de bacteriófagos é importante durante biotecnológicas e biofarmacêutica processos a fim de determinar as infecções de culturas bacterianas com bacteriófagos18. O ensaio biológico mais comumente usado para a deteção do bacteriófago é a dupla camada agar método19, que é trabalhoso e demorado. Várias tentativas foram feitas para desenvolver novas ferramentas de diagnóstico para vírus (incluindo bacteriófagos) como força atômica (AFM) a microscopia20, interferometria21, eletroquímica22e sensor sistema23, 24. um monte de trabalho tem sido focado em biosensores devido a suas vantagens como sendo capaz de medição em tempo real,15,25, altamente sensível e fácil de operar. Um tipo específico de biosensor baseia-se em mudanças na capacitância. Estes biosensores capacitivos são os sensores eletroquímicos que medem mudanças nas propriedades dielétricas quando um analito interage com um elemento de biorecognition na superfície do sensor, causando uma diminuição da capacitância2,4 . Biosensores capacitivos têm sido utilizados para a detecção de vários analitos como antígenos, anticorpos, proteínas e heavy metal íons6,26,,27,28. Estes tipos de biosensores têm muitas vantagens como inerente rapidez, alta sensibilidade, simplicidade, baixo custo, fácil manipulação e medição em tempo real sem rotulagem29.
O método descrito neste documento destina-se a permitir a detecção e quantificação de baixo-abundantes biomoléculas em amostras altamente complexas, sem a necessidade de usar qualquer rotulagem. Em particular, a técnica é mais útil na faixa de atto-picograma de biomoléculas, onde outros instrumentos comercialmente existentes não conseguem dosar com precisão seu alvo.

<table><tbody><tr><td>Vidro Lamínulas</td><td>ThermoFisher</td><td>102222</td><td>selo de proteína</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td>limpeza</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>limpeza Limpador ultrassônico</td><td>Branson Ultrassônico BRANSONIC</td><td>M1800- E</td><td>limpeza</td></tr><tr><td>3-amino-propil-trietoxissilano (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td>modificação</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1009836010</td><td>enxágue / limpeza</td></tr><tr><td>glutaraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-100ML</td><td>reticulador</td></tr><tr><td>acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850-1L-M</td><td>limpeza</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741-100ML</td><td>solução</td></tr> <tr><td>de piranhaH2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-500ML</td><td>piranha solução</td></tr><tr><td>tiramina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T90344-5G</td><td>modificação</td></tr><tr><td>CompactStat</td><td>Ivium Technologies</td><td>CompactStat.h:</td><td>Potenciostato</td>de 30mA@10V/3MHz</tr><tr><td>Kit de contra-eletrodo de platina</td><td>Equilabrium</td><td>AFCTR5</td><td>Potenciostato</td></tr><tr><td>Referência Eletrodo</td><td>Equilabrium</td><td>RREF0021</td><td>potenciostato</td></tr><tr><td>cloreto de acriloil</td><td>EMD Millipore</td><td>8.00826.0100</td><td>modificação</td></tr><tr><td>trietilamina</td><td>EMD Millipore</td><td>8.08352.0100</td><td>modificação</td></tr><tr><td>tolueno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-100ML</td><td>modificação</td></tr><tr><td>N-hidroximetil acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>monômero funcional</td></tr><tr><td>polietilenoglicol-400-dimetacrilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>409510-250ML</td><td>reticulador</td></tr><tr><td>2-Hidroxi-4&prime;-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896-50G</td><td>monômero funcional</td></tr><tr><td>Polimerizador UV</td><td>Dymax</td><td>Dymax 5000ECE</td> Pinça <td>de polimerização UV</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168777-1EA</td><td>consumível</td></tr><tr><td>1-dodecanetiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471364-100ML</td><td>agente bloqueador</td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>Monômero funcional</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td></tr><tr><td>N-hidroximetilacrilamida</td> Monômero funcional <td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>Monômero funcional</td></tr><tr><td>N-isopropilacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415324-50G</td><td>monômero funcional</td></tr><tr><td>metilenobisacrilamida</td><td></td><td>Monômero de reticulação</td>Sigma-Aldrich <td>146072-500G</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletildiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td>catalisador</td></tr><tr><td>persulfato de amônio</td><td>Iniciador Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biossensor capacitivo</td><td>CapSenze</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>tampão de</td><td>regeneração 1042011000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td>buffer de regeneração</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352-1KG</td><td>buffer de execução</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; &touro; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567547-1KG</td><td>tampão de corrida</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; &touro; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567549-1KG</td><td>buffer de execução</td></tr><tr><td>DELPHI luz correlativa e microscópio eletrônico</td><td>Phenom-World</td><td></td><td>equipamento</td></tr><tr><td>Eletrodos de ouro capacitivos</td><td>CapSenze Biosystems</td><td></td><td>consumíveis</td></tr><tr><td>2,2'-azobis (2-metipropionitrila)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090-25G</td><td>foto-iniciador</td></tr><tr><td>CapSenze Smart Software</td><td>CapSenze Programa de software para biossistemas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um imprinting molecular baseado biosensor capacitivo

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

A capacidade de detectar e quantificar biomoléculas em soluções complexas sempre foi muito procurada dentro da ciência natural; sendo usado para a detecção de biomarcadores, contaminantes e outras moléculas de interesse. Uma técnica comumente utilizada para este fim é a enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA), onde muitas vezes um anticorpo é direcionado a uma molécula-alvo específico, e um segundo anticorpo marcado é utilizado para a detecção do anticorpo primário, permitindo a quantificação absoluta da biomolécula sob estudo. No entanto, o uso de anticorpos como elementos de reconhecimento limita a robustez do método; como faz a necessidade do uso de moléculas rotuladas. Para superar essas limitações, impressão molecular foi implementado, criação de sites de reconhecimento artificial complementar à molécula de modelo e obsoleting a necessidade do uso de anticorpos para ligação inicial. Além disso, para maior sensibilidade, o anticorpo secundário marcado pode ser substituído por biosensores depender a capacitância para a quantificação da molécula alvo. Neste protocolo, descrevemos um método para rapidamente e sem rótulo detectar e dosar baixo-abundantes biomoléculas (proteínas e vírus) em amostras complexas, com uma sensibilidade que é significativamente melhor do que os sistemas de deteção comumente usados, tais como o ELISA. Isto é tudo mediado por impressão molecular em combinação com um biossensor de capacitância.

Seguindo o protocolo, de acordo com o esquema na Figura 1, um eletrodo de ouro nua será gravado com um modelo, que representa a estrutura de um biomacromolecule. Este eletrodo pode ser aplicado em um biossensor capacitivo (Figura 2), permitindo que o aplicativo estável de um modelo para o eletrodo e a medição de mudanças na capacitância mediante vinculação do modelo.
Uma representação esquemática do biosensor capacitivo é mostrada na Figura 2. A bomba de centris, que é responsável pela injeção contínua de buffer de execução (fosfato 10 mM, pH 7,4) e o buffer de regeneração (25mm glicina-HCl, pH 2.5) durante a regeneração dentro da célula de fluxo, pode ser vista claramente na figura. A célula de fluxo consiste em trabalhar, referência e eletrodos de contador. A válvula de injeção é composta de soluções padrão de proteína/bacteriófago, que estão de passagem o desgaseificador primeiro e então injetado sequencialmente no sistema. Tão logo as soluções atingem o eletrodo de trabalho inserido na célula de fluxo, o resultado é monitorado em tempo real. Os valores de capacitância podem ser registrados, seguindo o sensorgrams na tela do computador.
Figura 3 e Figura 4 mostram as diferenças entre a superfície dos eléctrodos de ouro desencapados e imprimidas. Esta etapa de caracterização é importante para garantir que existem cavidades poliméricas, vistas como rugosidade na superfície do eléctrodo após a programação. Além de SEM, existem também outros métodos de caracterização incluindo AFM, medições de ângulo de contato, etc., que podem ser usados para caracterizar a superfície após a programação de elipsometria. Desta forma, pode ser assegurado que o processo de impressão é bem sucedido e que as cavidades modelo são formadas na superfície. Dentro dessas cavidades, o modelo pode vincular com afinidade e alta especificidade.
Depois de injectar das soluções-padrão do sistema capacitivo, uma média das cinco últimas leituras foi calculada automaticamente pelo software, e os gráficos de calibração foram obtidos plotando a mudança na capacitância vs. a concentração do analito. A diminuição da capacidade registrada surgiu a ligação do modelo. As mais moléculas que se ligam ao eléctrodo de ouro de superfície, maior a redução da capacidade total, de acordo com o princípio geral de medição capacitiva. Figura 5 e Figura 6 mostram que com o aumento da concentração do analito, a ΔC aumenta conforme o esperado. A gama dinâmica (entre os quais é o intervalo de concentração onde o sistema é útil para a detecção de um alvo específico) e o limite de detecção (LOD) podem ser avaliadas através da análise desses gráficos. De acordo com a Figura 6, o biosensor capacitivo do bacteriófago imprimido pode detectar bacteriófagos na faixa de concentração de 101 - 105 pfu/mL, com um valor LOD de pfu/mL 10 neste estudo. Tanto a Figura 5 e Figura 6 também destacar a necessidade de medir a curva de calibração no mesmo intervalo necessário para a concentração de modelo deve, desde que a linearidade da regressão pode variar mais as concentrações ( Figura 5), ou ter inclinações diferentes (Figura 6). Também note que devido as baixas concentrações utilizadas, o sistema é bastante sensível às flutuações (turbidez da amostra, projecto de ar, etc.), e portanto, é recomendável executar pelo menos triplica para reduzir o potencial de outliers, incluindo . Pela mesma razão, o desvio-padrão pode ser bastante significativo para amostras altamente diluídas, como visto na Figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> Figura 1 . Representação esquemática do método de impressão microcontact. (A) preparação de lamínulas de vidro (selos de modelo), (B) preparação dos eléctrodos de ouro capacitivos, (C) microcontact impressão do modelo para a superfície do eletrodo de ouro através de UV-polimerização e (D) remoção do modelo da superfície do eletrodo (reproduzido do Ertürk et al, biotecnologia relatórios 2014 (3): 65-72, com permissão). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> Figura 2. Representação esquemática do biosensor capacitiva. O layout geral do biosensor capacitivo utilizado neste estudo (reproduzido do Ertürk et al, biotecnologia relatórios 2014 (3): 65-72, com permissão). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura de proteína impresso eletrodos. Imagens SEM do (A), um eletrodo de ouro desencapado (barra de escala = 20 µm), e (B), uma proteína impresso eletrodo capacitivo de ouro (barra de escala = 10 µm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> Figura 4. Microscopia eletrônica de varredura do bacteriófago impresso eletrodos. Imagens SEM de um eletrodo de ouro desencapado (barra de escala = 20 µm) (A), e um bacteriófago impresso capacitivo eletrodo de ouro em diferentes ampliações (6600 x, barra de escala = 10 µm) (B) e 11, 500 X, escala bar = 5 µm) (C); as setas denotam aderidos bacteriófagos). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> Figura 5. Efeito de composição do tampão para gráficos de calibração. Gráfico de calibração mostrando a mudança na capacitância vs uma concentração de proteína em óptimas condições (executando Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; Buffer de regeneração: 25mm glicina-HCl, pH 2.5 incluindo 50mm Tween-20; Taxa de fluxo: 100 µ l/min, volume de amostra: 250 µ l; T: 25 ° C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> Figura 6. Curva de calibração representante para grandes macromoléculas. Gráfico de calibração que mostra a mudança na capacitância vs concentração do bacteriófago em óptimas condições (executando Buffer: fosfato 10 mM, pH 7,4; Buffer de regeneração: 25mm glicina-HCl, pH 2.5 incluindo 50mm Tween-20; Taxa de fluxo: 100 µ l/min, volume de amostra: 250 µ l; T: 25 ° C) <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de baixas moléculas abundantes em soluções complexas usando molecular imprinting em combinação com um biossensor de capacitância.

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

O objetivo geral desta técnica é detectar e quantificar biomoléculas pouco abundantes em amostras altamente complexas com alta sensibilidade, simplicidade, baixo custo, velocidade e sem o uso de qualquer marcação. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biotecnologia, bioquímica e biomedicina, como monitoramento ambiental, segurança alimentar, qualidade da água potável e diagnóstico médico. As principais vantagens desta técnica são sua rapidez inerente, simplicidade, alta sensibilidade, baixo custo, fácil manipulação e detecção em tempo real sem o uso de reagentes de marcação.As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doenças devido à sua capacidade de quantificar biomoléculas pouco abundantes. Por exemplo, diferentes biomarcadores em tempo real. Para limpar as lamínulas de vidro, mergulhe-as em 10 mililitros de HCl 1,0 molar por 10 minutos em um limpador ultrassônico em temperatura ambiente.Em seguida, mergulhe-os em água deionizada e hidróxido de sódio 1,0 molar nas mesmas condições. Seque as lamínulas de vidro com gás nitrogênio. Em seguida, mergulhe as lamínulas limpas e secas em 10 mililitros de uma solução APTES por uma hora para introduzir grupos amino na superfície da lamínula à temperatura ambiente.Enxágue as lamínulas com água deionizada antes de secá-las novamente com gás nitrogênio. Mergulhe as lamínulas modificadas APTES em uma solução de 10 mililitros de glutaraldeído por duas horas para ativar os grupos amino na superfície à temperatura ambiente. Após a incubação, enxágue as lamínulas com tampão fosfato 10 milimolar para remover o excesso de glutaraldeído da superfície.Seque as lamínulas com gás nitrogênio. Em seguida, prepare 1,0 mililitro de solução molde em tampão fosfato 10 milimolar em uma concentração de 0,1 miligrama por mililitro. Coloque 200 microlitros desta solução molde nas lamínulas modificadas e incube a quatro graus Celsius durante a noite.Para limpar os eletrodos, primeiro mergulhe os eletrodos em um pequeno béquer contendo cinco mililitros de etanol a 70% por 10 minutos em um limpador ultrassônico em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe sequencialmente os eletrodos em água deionizada, acetona, água deionizada, solução ácida de piranha e água deionizada nas mesmas condições. Seque os eletrodos com gás nitrogênio.Para realizar a eletropolimerização da tiramina, prepare oito mililitros de solução de tiramina a 10 milimolares em tampão fosfato 10 milimolar contendo dois mililitros de etanol. Execute 15 ciclos de varreduras voltamétricas cíclicas nesta solução usando um potenciostato cobrindo uma faixa de potencial de zero a 1,5 volts e uma taxa de varredura de 50 milivolts por segundo. Em seguida, enxágue os eletrodos com água deionizada antes de secá-los com gás nitrogênio.Mergulhe os eletrodos em uma solução contendo 30 milimolares de cloreto de acriloil e 30 milimolares de trimetilamina em tolueno em temperatura ambiente durante a noite antes de enxaguar e secar os eletrodos novamente. Antes da polimerização, prepare uma solução de monômero contendo monômeros e reticulador em 820 microlitros de água ultrapura. Em seguida, prepare 5% volume a volume TEMED em água ultrapura.Adicione 20 microlitros da solução TEMED à solução de monômero e purgue com gás nitrogênio por cinco minutos. Em seguida, adicione 20 microlitros de APS recém-preparado na solução de monômero. Pipete 1,5 microlitros da solução de monômero na superfície do eletrodo de ouro modificado.Agora, inicie a polimerização colocando o carimbo do molde em contato com a superfície tratada com monômero e deixe-o por cinco horas em temperatura ambiente. Após a polimerização, remova o carimbo do modelo da superfície com cuidado, usando uma pinça. Em seguida, enxágue o eletrodo com água deionizada e seque com gás nitrogênio.Mergulhar os eléctrodos em um mililitro de dez milómeros de um dodecanetol preparado em etanol durante vinte minutos, a fim de cobrir os orifícios na superfície do eléctrodo. Por fim, enxágue os eletrodos com água deionizada e seque os eletrodos com gás nitrogênio antes de caracterizar suas superfícies com microscopia eletrônica de varredura. Insira os eletrodos de ouro capacitivos impressos na célula de fluxo eletroquímico integrada a um biossensor capacitivo.Prepare 100 mililitros de tampão de regeneração e um litro de tampão de funcionamento. Inicie a análise com a injeção de buffer de regeneração para regenerar o sistema e buffer de execução para reequilibrar o sistema por 25 minutos. Prepare soluções de modelo padrão na faixa de concentração desejada no buffer de corrida.Em seguida, injete 250 microlitros dessas soluções padrão sequencialmente no sistema em condições ideais. A caracterização da superfície dos eletrodos de ouro é realizada por microscopia eletrônica de varredura. A superfície dourada nua é mostrada.Também são mostrados bacteriófagos aderentes à superfície do eletrodo em diferentes ampliações. Aqui é mostrada a ligação de bacteriófagos em tempo real ao eletrodo de ouro impresso por meio de um sensograma. Uma linha de base estável é estabelecida após a regeneração e reequilíbrio do sistema antes da injeção da amostra.Existem cavidades específicas de fagos no eletrodo. A injeção dos bacteriófagos indutores de amostra resulta em uma capacitância reduzida, devido à ligação dos bacteriófagos alvo às cavidades impressas na superfície dos eletrodos de ouro. As curvas de calibração mostram a mudança de capacitância versus injeção de proteína na injeção de bacteriófagos.A partir das equações desses gráficos, é possível calcular a concentração de bacteriófago ou proteína em uma amostra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um sistema de detecção ultrassensível, rápido e em tempo real. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas e trinta minutos, excluindo os tempos de espera intermediários.Ao tentar este procedimento, é importante preparar todos os agentes frescos, no mesmo dia. Seguindo este procedimento, outras métricas, como microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de varredura, elipsômetro e medições de ângulo quântico, podem ser realizadas para determinar se a polimerização ou impressão foi bem-sucedida e para detectar qualquer diferença significativa entre as superfícies de eletrodos de ouro nus e impressos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de bioquímica, biotecnologia e biomedicina explorarem uma detecção ultrassensível de uma biomolécula na segurança alimentar e no diagnóstico médico.Não se esqueça de que trabalhar com monômeros funcionais, reticuladores, iniciadores e outros agentes pode ser extremamente perigoso. E, precauções como usar luvas, jalecos de laboratório e realizar os experimentos de polimerização dentro da hotte, devem sempre ser tomadas, durante a realização desses experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interesse para a saúde humana), utilizando um método de triagem recém-desenvolvido com base em um método imunoquímico competitiva e uma detecção eletroquímica final é demonstrada.

ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

Magnética modulação do sistema biosensoriamento é utilizada para rapidamente, com sensibilidade e simplesmente detectar ensaios biológicos, tais como moléculas de DNA e proteínas.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

Este vídeo demonstra um método para detectar e quantificar transmissores de peptídeos usando um biossensor de imunossonda capacitiva. O eletrodo funcionalizado, revestido com anticorpos, interage com peptídeos de interesse, levando a uma mudança de sinal que permite a medição e detecção precisas de peptídeos.

Detecção e medição de peptídeos alvo usando um biossensor de imunossonda capacitiva

Nós apresentamos um biochip electroquímica à base de microfluidos para a detecção de hibridação de ADN. Após a funcionalização ADNcs sonda, a especificidade, a sensibilidade, e o limite de detecção são estudadas com alvos de ADNcs complementares e não complementares. Os resultados ilustram a influência dos eventos de hibridação de ADN no sistema electroquimico, com um limite de detecção de 3,8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Este protocolo demonstra como atingir a sensibilidade de detecção femto molar de proteínas em 10 μL de sangue total em 30 min. Isso pode ser alcançado usando esteiras nanofibrosas eletrofiadas integradas em um lab-on-a-disc, que oferece alta área de superfície, bem como mistura e lavagem eficazes para melhorar a relação sinal-ruído.

Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total

Neste trabalho, relatamos um novo método para estudar as interações da proteína-proteína usando um biossensor titulometria, baseado na tecnologia de β-lactamases de híbrido. Este método baseia-se na liberação de prótons após hidrólise da β-lactamas.

O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

Este trabalho descreve um método de litografia de nanoimprinting para fabricar matrizes de sensoriamento de alta qualidade que funcionam no princípio de transmissão óptica extraordinária. O biosensor é de baixo custo, robusto e fácil de usar e pode detectar troponina cardíaca eu no soro em concentrações clinicamente relevantes (99th percentil corte ∼10-400 pg/mL, dependendo do ensaio).

Usando transmissão óptica extraordinária para quantificar biomarcadores cardíacos no soro humano

Uma plataforma de biosensor microfluidic foi projetada e fabricado usando a tecnologia de fotorresiste de película seca de baixo custo para a quantificação rápida e sensível de vários analitos. Este sistema de uso único permite a leitura eletroquímica de ensaios de enzima-lig na-microplaqueta-imobilizado mediante a técnica de stop-fluxo.

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.

Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar

A biosensação de efeito de campo (FEB) é uma técnica livre de rótulos para detectar interações biomoleculares. Ele mede a corrente elétrica através do biosensor de grafeno ao qual os alvos de ligação são imobilizados. A tecnologia FEB foi utilizada para avaliar interações biomoleculares entre Hsp90 e Cdc37 e foi detectada uma forte interação entre as duas proteínas.

Explorando a interação biomolecular entre a acompanhante molecular Hsp90 e sua proteína cliente Kinase Cdc37 usando tecnologia de biosensão de efeito de campo

Um protocolo para um novo ensaio funcional de plaquetas multiparâmetro dinâmico usando um biossensor capacitivo é apresentado aqui. Essa abordagem, projetada em um microambiente semirrígido para aumentar a relevância fisiológica, fornece três parâmetros de saída sensíveis à contagem de plaquetas, forças de estimulação e vias de ativação.

Avaliação dinâmica da função plaquetária multiparamétrica usando um biossensor capacitivo

Aprenda a detectar biomarcadores de ultra-alta sensibilidade usando um biosensor capacitivo baseado em impressão molecular. Este método permite a detecção em tempo real sem marcação, com aplicações em biotecnologia e diagnóstico médico.

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

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