Geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método simples para gerar e isolar células presas pelo ciclo celular com cariótipos complexos. Este método pode fornecer respostas a questões-chave no campo da pesquisa de aneuploidia, como a interação do sistema imunológico com as células aneuploides. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera uma população de células que abriga apenas cariótipos complexos.

Para iniciar a sincronização das células RPE-1 hTERT, use células recém-descongeladas e distribua-as em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros usando oito mililitros de meio de crescimento padrão. Em seguida, use um hemocitômetro para determinar o número de células. Em seguida, incube as células durante a noite.

No dia seguinte, substituir o meio de cultura padrão por um meio que contenha cinco milimolares de timidina. Incube por 24 horas a 37 graus Celsius para sincronizar as células na borda G1S. Após 24 horas, lave as células três vezes com PBS.

Em seguida, adicione o meio de crescimento padrão às células lavadas e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Primeiro, lave as células com 10 mililitros de PBS. Em seguida, adicione meio contendo 500 nanomolares Mps1 Inibidor reversina.

Incube por 12 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione o meio de crescimento padrão e devolva as placas à incubadora.

Aproximadamente 72 horas após a primeira mitose aberrante, lave as células com 10 mililitros de PBS. Em seguida, adicione um meio contendo 330 nanomolares de nocodazol. Incube por 12 horas a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, aspire o meio nocodazol. Em seguida, adicione três mililitros de PBS ao prato e bata na lateral do prato para sacudir as células mitóticas. Gire a placa entre cada torneira para permitir a remoção uniforme das células mitóticas.

Após a agitação inicial, aspire qualquer líquido aderido à tampa e à borda da placa. Em seguida, verifique a placa sob o microscópio com ampliação de 10X. Em seguida, lave as células com cinco mililitros de PBS.

Em seguida, adicione um meio contendo 330 nanomolares de nocodazol. Incube por 12 horas a 37 graus Celsius. Após a agitação final, adicione 10 mililitros de meio de crescimento padrão.

Incube as células por 12 a 24 horas a 37 graus Celsius antes de realizar os ensaios. As células restantes na placa são chamadas de presas com cariótipo complexo ou células ArCK. Este protocolo descreve um método simples para isolar células ArCK e várias características específicas das células ArCK são analisadas para confirmar seu isolamento.

As células ArCK mostram níveis aumentados de inibidores do ciclo celular p53, p21 e p16 na análise de immunoblot, enquanto as células de ciclo euploides e aneuploides não. Além disso, as células ArCK são positivas para beta-galactosidase associada à senescência, que cora azul-esverdeada, enquanto as células de controle euploides não. Os gráficos de segmentação revelam que as células ArCK são aneuploides, caracterizadas por múltiplos ganhos cromossômicos aleatórios e perdas cromossômicas.

Os gráficos de segmentação mostram o número de cópias de células individuais do cromossomo um para o X, em relação a uma escala de log dois de referência euploide. Ao tentar este procedimento, é importante certificar-se de remover todas as células mitóticas durante cada agitação. Após a realização deste procedimento, outros métodos, como ensaios de citocinas, podem ser realizados.

Esses ensaios ajudarão a responder a perguntas adicionais, como a capacidade das células ArCK de interagir com as células do sistema imunológico. Não se esqueça de que o nocodazol é perigoso. Equipamento de proteção individual apropriado deve ser usado durante o uso deste reagente.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para isolar eficientemente as células ArCK in vitro. Este procedimento pode ser feito em sete dias se realizado corretamente.