Name: Geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprenda a gerar e isolar células ArCK com cariótipos complexos usando sincronização com timidina e nocodazol. Este método permite estudar aneuploidia e interações com o sistema imune em pesquisas de biologia celular.

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Este trabalho foi financiado em parte com o apoio do Instituto de Koch Grant P30-CA 14051 (núcleo) do Instituto Nacional de câncer, pelos institutos nacionais de Grant saúde (22-CA206157 e GM118066) e Curt mármore Cancer Research Fund de Angelika Amon. Angelika Amon também é um investigador do Howard Hughes Medical Institute e o Glenn Foundation para investigação biomédica. S. S. foi apoiado pelo americano italiano Cancer Foundation (AICF), por uma bolsa de pesquisa do câncer de acções Marie Curie e a associação italiana para pesquisa de câncer (AIRC) e por uma bolsa de pesquisa de câncer quinquenal do KI. E.M. foi apoiado por uma bolsa do Howard Hughes Medical Institute.

Condição de cultura
Linhagem de células de RPE-1 hTERT foi cultivada na modificado Eagle suplementado de Dulbecco (Tabela de materiais) com 10% de soro Fetal bovino, 2 mM L-glutamina e 100 U/ml penicilina/estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C com 5% CO2 em um ambiente umidificado. O protocolo descrito a seguir foi desenvolvido usando pratos de 10 cm e todos os detalhes técnicos relatados referem-se os pratos. Se usando pratos diferentes, escalar para cima ou para baixo em conformidade.
1. sincronização de células RPE-1
<ol><li>Use o recém descongeladas células que não tenham mais de 15 passagens para todos os experimentos. No dia 1, descongelar e dispensar ~2.5 - 5.0 x 105 RPE-1 hTERT células em um prato de cultura de tecido de 10 cm. Adicione 8 mL de meio de cultura padrão e incubar durante uma noite. Determine o número de célula, usando um contador de célula padrão (por exemplo, um hemocytometer). Nota: A densidade celular refere-se às condições de crescimento das células RPE-1. Condições de crescimento podem variar entre linhas de célula diferente; Considere-se ajustando-los adequadamente.</li>
	<li>No dia 2, sincronize pilhas na beira de G1/S por aspiração média de crescimento regular e adicionando meio de 8 mL contendo timidina de 5 mM. Nota: Concentração de timidina e duração do tratamento podem variar através das linhas de célula diferente. É aconselhável realizar experiências piloto para determinar as melhores condições para a linha de célula (s) a ser testado.</li>
	<li>No dia 3, 24 horas após a adição de timidina médio (etapa 1.2), lançamento do bloco de timidina por meio de aspiração e lavagem células três vezes com PBS 1x. Adicionar 8 mL do meio de crescimento regular e retornar as placas para a incubadora.</li>
</ol>2. geração de Aneuploid células por interferência com a atividade da quinase mitótica Mps1
<ol><li>No dia 3, 6h após o lançamento do bloco de timidina (etapa 1.3; isto é cerca de 3-6h antes que as células entrem na mitose), Aspire o meio, lave uma vez com PBS 1x e substituir com meio contendo 500 nM reversine (inibidor Mps1). Nota: As células de RPE-1 digite mitose 9-12 h após timidina wash-out10,11. No entanto, a cinética do ciclo celular variam entre linhagens celulares diferentes. Portanto, é crucial determinar esses cinética em experiências piloto, realizando análise de ciclo celular por métodos estabelecidos (por exemplo, medindo-se análise de conteúdo através de FACS DNA). Além disso, a concentração ideal de trabalho do inibidor de Mps1 pode variar entre linhas celulares. Experiências anteriores, utilizando células de RPE1 tem sido bem sucedidas usando reversine em uma concentração de trabalho de 500 nM10,11,12. É aconselhável realizar experiências piloto para determinar a concentração ideal para a linha de celular a ser testado.</li>
	<li>No dia 4, 12 h após o tratamento de reversine (cerca de 6 h depois de células em mitose), Aspire reversine médio e lavar as células três vezes com PBS 1x. Adicione 8 mL de meio de crescimento regular à placa e retornar as células para a incubadora.</li>
</ol>3. remoção de células de ciclismo Aneuploid e enriquecimento da população ArCK
<ol><li>No dia 6, cerca de 72 h após células entram a primeira mitose (passo 2.2; isto é cerca de 66 h após reversine wash-out, que corresponde a aproximadamente 2-3 ciclos de célula), Aspire médio, lave uma vez com PBS 1x e substituir com meio contendo 300 nM nocodazole. Nota: Trabalho recente mostrou que as células de RPE-1 abrigando cariótipos aneuploid genomically instáveis e prendam sua proliferação sobre ciclos de 2-3 célula após a primeira mitose defeituoso10. No entanto, esta cinética pode variar entre linhagens celulares diferentes. Portanto, é crucial realizar experiências piloto para determinar o momento adequado para a remoção de células de ciclismo aneuploid.</li>
	<li>No dia 7, 12 h após o tratamento nocodazole, Aspire médio e adicionar 3 mL de 1X PBS para a placa. Sacudi as células mitóticas tocando o lado da placa. Gire o prato entre cada torneira para permitir até mesmo remoção das células mitóticas.</li>
	<li>Para assegurar a completa remoção das células mitóticas, repita o processo de agitar-se por várias rodadas (3 - 5 vezes recomendadas), aspiração e adicionar 3 mL de 1X PBS entre cada rodada.</li>
	<li>Após agitação, delicadamente Aspire qualquer líquido que adere a tampa ou a borda da placa. Brevemente, verificar a placa sob um microscópio com ampliação de 10x. Certifique-se que algumas células mitóticas são observadas. Se mais de cinco células mitóticas são vistas ao abrigo do objectivo X 10, repita mais uma rodada de agitar-se. Nota: Células mitóticas apareceriam arredondadas e podem ser parcialmente desconectadas após agitar-se. É crucial assegurar a completa remoção das células mitóticas antes de expor as células para a próxima rodada de tratamento nocodazole. A não observância pode levar à morte celular mitótica e/ou resultar na geração de células tetraploide.</li>
	<li>Após agitar-off final, lave as células uma vez com 5 mL de 1X PBS. Adicione 8 mL de meio contendo 330 nM nocodazole a placa e incubar durante 12 h.</li>
	<li>Repeti nocodazole tratamento agitar-ro (passos 3.1-3.5) cada 12h até sem células mitóticas são observadas após a incubação. Geralmente, recomenda-se 4-5 rodadas de tratamento/agitar-se. Nota: As informações fornecidas aqui referir-se as células de RPE-1. O número de rodadas de tratamento agitar-ro pode variar entre linhagens celulares diferentes. Para evitar exposição desnecessária e prolongada, a nocodazole é crucial determinar cuidadosamente, em uma experiência piloto, o número de voltas necessárias para remoção eficiente e completa de células de ciclismo aneuploid.</li>
	<li>Depois de 4-5 rodadas de nocodazole tratamento agitar-ro (passos 3.1-3,6), adicionar 10 mL de meio de crescimento regular e incubar. Permitir que as células descansar por 12-24 h antes do uso futuro de manipulação ou ensaio. Nota: Após agitar-off final, as células restantes na placa são ciclo celular preso e, como mostrado recentemente10, abrigam cariótipos complexos. Estas células são denominadas células ArCK (preso com cariótipo complexo). É aconselhável realizar ensaios em populações de ArCK dentro de uma semana de isolamento.</li>
	<li>Opcionalmente, para avaliar a percentagem de células presas com cariótipos complexos, recolher e contar as células de cada shake-off usando um contador de célula padrão.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> Figura 1: esquemático geral do método usado para gerar e isolar aneuploid células com cariótipo complexo (ArCK) e imagens representativas. (A) esquema de ArCK células protocolo de geração e isolamento. (B) imagens representativas de células de hTERT RPE-1 em cada fase do tratamento. O último painel (esboçado em vermelho) representa as células isoladas de ArCK. Escala da barra 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Caracterização da população de ArCK
<ol><li>Confirme o sucesso isolamento da população ArCK realizando ensaios os seguintes.<ol>
<li>Bundas beta-galactosidase coloração (o marcador de senescência) usando um comercialmente disponível kit (veja a tabela de materiais).</li>
		<li>Medir a secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como CCL2, empregando kits comercialmente disponíveis (ver tabela de materiais).</li>
		<li>Confirme o aumento dos níveis do ciclo celular inibidores p53, p21, p16 por Western Blot. Nota: Para controlar adequadamente estes ensaios, ArCK populações devem ser comparadas às células de ciclismo euploid e aneuploid. É a primeira passagem baixa, selvagem-tipo RPE-1 hTERT células crescendo exponencialmente. Este último pode ser obtido por indução mis segregação de cromossomos em RPE-1 hTERT e colheita de células 72 h após a primeira mitose aberrante. Para fazer isso, siga o protocolo descrito acima de passo 1.1 colheita de células bem antes do primeiro tratamento de nocodazole (passo 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize o sequenciamento de célula única para avaliar o cariótipo das células presos. Nota: O sequenciamento de célula única é um método bem estabelecido para determinar alterações cromossômicas e sub cromossômicas em toda uma população celular na única célula nível13. Os procedimentos detalhados de como realizar o sequenciamento de célula única podem ser encontrados em outro lugar10.</li>
</ol>

<ol><li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li>
<li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer%3A+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li>
<li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li>
<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li>
<li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress%2C+senescence+and+cell+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li>
<li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668(2015).</li>
<li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754(2016).</li>
<li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).</li>
<li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li>
<li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li>
<li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este novo método para gerar e enriquecer para células presas com cariótipos complexos (ArCK) permite o estudo de células que possuem vários cromossomo ganhos ou perdas e deixam de dividir. A configuração do método foi projetada para facilitar o isolamento das células ArCK de forma rápida e confiável.
O passo mais crítico neste ensaio é controlar rigorosamente o cronograma de tratamento medicamentoso e, mais importante ainda, a remoção de células de ciclismo aneuploid. Para obter melhores resultados, o tempo do tratamento nocodazole e agitar-off é de particular importância para garantir que as células de ciclismo são removidas da placa enquanto eles ainda são arredondadas e mitótica, impedindo a possibilidade de morte celular mitótica ou derrapagem em G1, potencialmente, criando uma população tetraploide. Não se recomenda que o timing de agitar-se afasta-se mais de duas horas de incubação recomendada 12-h nocodazole.
Futuros estudos sobre ArCK células têm o potencial de facilitar uma compreensão mais profunda de como complexo cariótipos afetam a fisiologia celular. Em particular, um estudo recente demonstrou que as células do sistema imunológico são capazes de interagir com e gatilho imune apuramento de ArCK células10. O método descrito aqui fornece um excelente ponto de partida para a caracterização adicional das células ArCK, incluindo o esclarecimento dos mecanismos moleculares subjacentes a autorização imune em células sem transformação e o estudo da transformação oncogênica como pode contornar este mecanismo de vigilância, uma questão crucial no campo14,15.

Erros no processo de segregação do cromossomo levam a aneuploidia, uma condição caracterizada por um número de cromossomos que não é um múltiplo do haploide1,2,3,4. Cariótipos aneuploid stress de replicação de gatilho que gera ainda mais instabilidade genômica5,6,7,8,9,10, aumenta complexidade de cariótipo e, finalmente, leva a detenção do ciclo celular de uma subpopulação de células10. O objetivo do método apresentado aqui é gerar e separar tal uma subpopulação de células de ciclismo. Empregando-se técnicas de cultura de tecidos de baixo custo, este protocolo facilita o isolamento e caracterização de células aneuploid ciclo celular-preso com cariótipos complexos. Estas células são denominadas células ArCK (preso com cariótipo complexo) e os seus homólogos de ciclismo euploid como controles.
Este protocolo é o primeiro a ser criado para o efeito e permite o isolamento e um estudo mais aprofundado das linhas ArCK, incluindo, mas não limitado a, sua senescência induzida e o fenótipo secretor associada a senescência (SASP), seus pro-inflamatórios características e sua capacidade de envolver-se com células do sistema imunológico. O método aqui apresentado foi desenvolvido em células humanas sem transformação, imortalizadas, mas ainda não foi testado em linhas de câncer. Algumas células transformadas podem ser insensíveis à detenção do ciclo celular devido à supressão de um ou vários caminhos; Portanto, ainda mais validação deve ser executada em outras linhas de célula.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-p53</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-p21</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 anticorpo</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>Senescência b-Galactosidase Kit de Coloração</td> Tecnologia <td>de Sinalização Celular&nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler Kit de Matriz de Citocinas Humanas&nbsp;</td><td>R& D Sistemas</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Segregação de mis cromossomo leva à aneuploidia, uma condição na qual células abrigam um número de cromossomas desequilibrado. Várias linhas de evidência indicam fortemente que aneuploidia provoca instabilidade do genoma, em última análise, gerando células com cariótipos complexos que prendam sua proliferação. Isolamento e caracterização de células abrigando cariótipos complexos são cruciais para estudar o impacto de um número de cromossomas desequilibrado na fisiologia celular. Até à data, não há métodos foram criados para isolar confiantemente tais células aneuploid. Este documento fornece um protocolo para o enriquecimento e a análise de células aneuploid com cariótipos complexos utilizando técnicas de cultura de tecidos de padrão, barato. Este protocolo pode ser usado para analisar várias características de células aneuploid com cariótipos complexos, incluindo seu fenótipo de secretora associada a senescência induzido, Propriedades pró-inflamatórias e capacidade de interagir com células do sistema imunológico. Porque as células cancerosas muitas vezes abrigam desequilíbrios no número de cromossomas, é crucial decifrar como aneuploidia impacta fisiologia celular em células normais, com o objetivo de desvendar os seus pro e anti tumorigenic efeitos.

Este método utiliza um sistema de cultura de tecidos em vitro para isolar células aneuploid com cariótipos complexos que prendam sua proliferação. Esta população é referida como células ArCK (preso com cariótipos complexos). A figura 1A mostra o esquema do experimento. Selvagem-tipo ciclismo RPE-1 hTERT células são sincronizadas na beira de G1/S com timidina e tratadas com um inibidor de Mps1 para induzir a segregação mis cromossomo. O eixo nocodazole veneno é adicionado às células 72 h após a indução da segregação mis cromossomo. 12 h após o tratamento de nocodazole, as células aneuploid que ainda são capazes de proliferar entre mitose e estão presos neste estágio do ciclo celular devido à interferência com a polimerização do microtúbulo. Estas preso células são então facilmente removidas por agitação suave. O processo de agitação é repetido 3 - 5 vezes para assegurar a remoção completa de células de ciclismo. A figura 1B mostra as imagens representativas de células RPE-1 em cada fase do tratamento.
ArCK células exibem aumento dos níveis de inibidores do ciclo celular, como a p21, p53 e p16 em comparação com euploid e aneuploid ciclismo células, como mostrado na Figura 2A. Além disso, a Figura 2B mostra β-galactosidase positivo mancha nas células ArCK em comparação com células de controle euploid, um marcador bem estabelecido para a senescência celular.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> Figura 2: resultados representativos, utilizando células de ArCK. (A) Western blot avaliação níveis de inibidor do ciclo celular em células ArCK, aneuploid ciclismo e euploid. Os níveis de p53, p21, p16 e foram determinados por análise ocidental do borrão. Actina serviu como um controle de carregamento. (B) β-galactosidase, manchando a avaliação do nível de senescência em células ArCK. Atividade associada a senescência β-galactosidase (β-Gal) determinou-se em células euploid e células de ArCK. Escala da barra 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Esta detenção do ciclo celular é uma característica proeminente de células aneuploid com cariótipos complexos, como demonstrado pela análise do cariótipo representativo de célula única sequenciamento na Figura 3, em que células de ArCK exibem Múltiplo, cromossomo aleatório de ganhos e perdas. Esta conclusão está em total acordo com anteriores relatórios10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> Figura 3: sequenciamento de célula única representante de células ArCK. Segmentação parcelas mostrando o cariótipo de seis células de ArCK representativos. Parcelas de segmentação mostram o número de cópia de todos os cromossomos de 1 a X em relação a uma referência euploid em uma escala de2 log (tipo selvagem RPE-1 é uma linhagem de células diploides de origem feminina). Ganhos do cromossomo são destacados em vermelho, perdas de cromossomo em verde. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aneuploidia leva à instabilidade do genoma, que eventualmente produz células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos. Este artigo fornece um método simples e conveniente para isolar células aneuploid com cariótipos complexos que deixam de dividir.

Geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método simples para gerar e isolar células presas pelo ciclo celular com cariótipos complexos. Este método pode fornecer respostas a questões-chave no campo da pesquisa de aneuploidia, como a interação do sistema imunológico com as células aneuploides. A principal vantagem dessa técnica é que ela gera uma população de células que abriga apenas cariótipos complexos.Para iniciar a sincronização das células RPE-1 hTERT, use células recém-descongeladas e distribua-as em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros usando oito mililitros de meio de crescimento padrão. Em seguida, use um hemocitômetro para determinar o número de células. Em seguida, incube as células durante a noite.No dia seguinte, substituir o meio de cultura padrão por um meio que contenha cinco milimolares de timidina. Incube por 24 horas a 37 graus Celsius para sincronizar as células na borda G1S. Após 24 horas, lave as células três vezes com PBS.Em seguida, adicione o meio de crescimento padrão às células lavadas e incube por seis horas a 37 graus Celsius. Primeiro, lave as células com 10 mililitros de PBS. Em seguida, adicione meio contendo 500 nanomolares Mps1 Inibidor reversina.Incube por 12 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione o meio de crescimento padrão e devolva as placas à incubadora.Aproximadamente 72 horas após a primeira mitose aberrante, lave as células com 10 mililitros de PBS. Em seguida, adicione um meio contendo 330 nanomolares de nocodazol. Incube por 12 horas a 37 graus Celsius.No dia seguinte, aspire o meio nocodazol. Em seguida, adicione três mililitros de PBS ao prato e bata na lateral do prato para sacudir as células mitóticas. Gire a placa entre cada torneira para permitir a remoção uniforme das células mitóticas.Após a agitação inicial, aspire qualquer líquido aderido à tampa e à borda da placa. Em seguida, verifique a placa sob o microscópio com ampliação de 10X. Em seguida, lave as células com cinco mililitros de PBS.Em seguida, adicione um meio contendo 330 nanomolares de nocodazol. Incube por 12 horas a 37 graus Celsius. Após a agitação final, adicione 10 mililitros de meio de crescimento padrão.Incube as células por 12 a 24 horas a 37 graus Celsius antes de realizar os ensaios. As células restantes na placa são chamadas de presas com cariótipo complexo ou células ArCK. Este protocolo descreve um método simples para isolar células ArCK e várias características específicas das células ArCK são analisadas para confirmar seu isolamento.As células ArCK mostram níveis aumentados de inibidores do ciclo celular p53, p21 e p16 na análise de immunoblot, enquanto as células de ciclo euploides e aneuploides não. Além disso, as células ArCK são positivas para beta-galactosidase associada à senescência, que cora azul-esverdeada, enquanto as células de controle euploides não. Os gráficos de segmentação revelam que as células ArCK são aneuploides, caracterizadas por múltiplos ganhos cromossômicos aleatórios e perdas cromossômicas.Os gráficos de segmentação mostram o número de cópias de células individuais do cromossomo um para o X, em relação a uma escala de log dois de referência euploide. Ao tentar este procedimento, é importante certificar-se de remover todas as células mitóticas durante cada agitação. Após a realização deste procedimento, outros métodos, como ensaios de citocinas, podem ser realizados.Esses ensaios ajudarão a responder a perguntas adicionais, como a capacidade das células ArCK de interagir com as células do sistema imunológico. Não se esqueça de que o nocodazol é perigoso. Equipamento de proteção individual apropriado deve ser usado durante o uso deste reagente.Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para isolar eficientemente as células ArCK in vitro. Este procedimento pode ser feito em sete dias se realizado corretamente.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Cariótipo é uma técnica simples e útil amplamente utilizado para detectar alterações genéticas. Descrevemos aqui um passo a passo protocolo para a preparação cromossomo disseminação de células estaminais embrionárias humanas para monitorar o estado cromossômica dessas células mantidas em cultura.

Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.

Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Este protocolo descreve o uso de centrífuga elutriation para separar as células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular.

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Este protocolo descreve um método fácil e conveniente para rotular e Visualizar ao vivo cromossomos em células mitóticas usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 label e um sistema de microscopia confocal de disco girando.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda a gerar e isolar células ArCK com cariótipos complexos usando sincronização com timidina e nocodazol. Este método permite estudar aneuploidia e interações com o sistema imune em pesquisas de biologia celular.

Geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos

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