Detecção de autoanticorpos de ilhotas humanas usando um ensaio de eletroquimioluminescência

Para detectar autoanticorpos de ilhotas - um biomarcador de diabetes tipo 1 - pegue amostras de soro humano e adicione ácido acético para inibir os componentes interferentes.

Incube e adicione um tampão alcalino para neutralizar o ácido.

Transfira o soro tratado para uma placa de vários poços contendo uma mistura de autoantígenos de ilhotas humanas, incluindo captura biotinilada e antígenos conjugados com rutênio, cada um em uma concentração ideal para o ensaio.

O autoanticorpo da ilhota na amostra positiva faz a ponte entre o antígeno conjugado com rutênio e o antígeno de captura biotinilado, formando um complexo antígeno-anticorpo.

Transferir a mistura para uma placa de electroquimioluminescência revestida com estreptavidina, pré-tratada com um agente bloqueador e equipada com eléctrodos de trabalho e contra-eléctrodos.

Incubar para permitir interações complexas biotiniladas com a estreptavidina ligada e depois lavar.

Adicione um tampão contendo tripropilamina ou TPA.

Em um instrumento de eletroquimioluminescência, a aplicação de tensão entre os eletrodos inicia a oxidação do rutênio e do TPA, gerando radicais TPA.

Os radicais TPA excitam complexos de rutênio, que emitem fótons enquanto retornam ao seu estado fundamental.

Uma alta quimioluminescência na amostra positiva indica a presença de autoanticorpos das ilhotas.

Misture o autoantígeno da ilhota humana com biotina ou sulfo-tag na proporção molar de 1:5 em um tubo e cubra o tubo com papel alumínio, pois ambos os tags são sensíveis à luz. Em seguida, incube o tubo por uma hora em temperatura ambiente. Enquanto isso, quando a incubação estiver em andamento, prepare a coluna de centrifugação com solução salina tamponada com fosfato duplo.

Em seguida, centrifugue a coluna a 1.000 vezes g por dois minutos de cada vez. Em seguida, centrifugue a mistura de etiquetas de autoantígeno na coluna de centrifugação a 1.000 vezes g por 2 minutos. Em seguida, alíquota e armazene o antígeno marcado a 80 graus Celsius negativos.

Em seguida, use a concentração racional do antígeno marcado com biotina sulfo-tag com base no ensaio quadriculado para o tampão de antígeno para preparar 3 mililitros de solução de antígeno por placa de 96 poços.

Em seguida, em cada poço, adicione 4 microlitros de soro e ajuste o volume final para 20 microlitros com solução salina tamponada com fosfato 1 vez. Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de antígeno marcada em cada poço e cubra a placa com papel alumínio para evitar a luz. Em seguida, transfira o prato para uma coqueteleira em temperatura ambiente por 2 horas.

Assim que o shaker parar, deixe o prato a 4 graus Celsius na geladeira por 18 a 24 horas. Agora, misture 15 microlitros de soro com 18 microlitros de ácido acético 0,5 molar para cada amostra e incube o mesmo em temperatura ambiente por 45 minutos.

Com base no ensaio quadriculado, use a concentração racional do antígeno marcado com biotina sulfo-tag para preparar a solução de antígeno.

Em seguida, alíquota de 35 microlitros do tampão antígeno em cada poço de uma nova placa de PCR. Pouco antes de o coro de incubação da mistura de soro ser concluído, adicione 3,8 microlitros de tampão Tris 1 molar a pH nove ao longo da lateral de cada poço na placa de antígeno.

Terminada a incubação, transfira rapidamente 25 microlitros do soro tratado com ácido acético em cada poço da placa de antígeno e agite a solução. Em seguida, cubra a placa de PCR com papel alumínio para evitar a luz e coloque em um shaker em temperatura ambiente por 2 horas. Uma vez feito isso, transfira o prato a 4 graus Celsius na geladeira e incube por 18 a 24 horas.

Remova a placa de estreptavidina da geladeira a 4 graus Celsius e deixe a placa atingir a temperatura ambiente. Depois que a placa de estreptavidina atingir a temperatura ambiente, adicione 150 microlitros de bloqueador A a 3% em cada poço, cubra a placa de PCR com papel alumínio e incube na geladeira durante a noite.

No dia seguinte, remova a placa de estreptavidina da geladeira e expulse o tampão dos poços. Em seguida, seque o prato colocando-o de cabeça para baixo em algumas toalhas de papel secas para que o tampão restante fique de molho. Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão PBST de 1 dobra para lavar o poço por três lavagens consecutivas.

Em seguida, transfira 30 microlitros de incubação de antígeno sérico em cada poço da placa de estreptavidina e cubra a placa com papel alumínio para evitar a luz. Em seguida, transfira o prato para uma coqueteleira em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, descarte o antígeno sérico incubado da placa e adicione 150 microlitros de tampão PBST 1 dobra para lavar o poço três vezes. Quando a lavagem terminar, adicione 150 microlitros de tampão de leitura a cada poço para ler em um leitor de placas.