Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural, como a preparação de proteínas sensíveis, onde uma quantidade limitada de proteína está disponível. A principal vantagem dessa técnica é que, em comparação com os métodos padrão de preparação de amostras, apenas quantidades mínimas de amostra são necessárias e que nenhuma etapa de borramento de papel está envolvida. As implicações desta técnica se estendem à análise de células únicas por proteômica visual ou ao diagnóstico de doenças relacionadas a proteínas.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando tínhamos a tecnologia disponível para resolver estruturas de alta resolução com apenas cerca de 100.000 partículas individuais. Para começar, prepare o exemplo conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, monte o copo de etano, o suporte da caixa criogênica e a aranha.

E encha o recipiente de criogênio até a borda com nitrogênio líquido. Após alguns minutos, o copo estará frio e livre de nitrogênio líquido. Em seguida, abra a garrafa de gás etano e deixe lentamente o gás fluir para o copo de etano.

Deixe o copo encher com etano líquido até que o nível esteja dois a três milímetros abaixo do topo. Isso levará alguns minutos e requer cerca de cinco mililitros de etano líquido. Remova a aranha, coloque a tampa de poliestireno em cima e coloque o recipiente de criogênio na montagem do gravador criogênico.

Segure a grade EM descarregada de brilho com a pinça do gravador criogênico, dê um nó na pinça no eletroímã e aparafuse o micromanipulador para alinhar a grade plana no palco, com o lado do filme de carbono para cima. De volta ao software, clique duas vezes em grid_save. Em seguida, ajuste a posição microcapilar, de modo que a ponta fique aproximadamente 10 micrômetros acima da superfície da grade.

Certifique-se de que o microcapilar possa se mover livremente pela grade, sem tocá-lo em nenhum lugar. E se necessário, retire o microcapilar alguns micrômetros. Em seguida, traga-o para a posição de volta ao centro da grade e salve a nova posição como grade.

Mova o microcapilar de volta para a posição inicial. Em seguida, lave o microcapilar com algumas dezenas de nanolitros de líquido do sistema e use tecido sem fiapos para remover quaisquer gotas do microcapilar. Com tudo agora preparado, inicie o script de macro.

A macro primeiro se move para a posição e dispensa cinco nanolitros de líquido do sistema para remover quaisquer bolhas de ar na ponta e, em seguida, passa para a posição das amostras. Em seguida, aspira 65 nanolitros de amostra e, em seguida, infunde cinco nanolitros de volta no tubo de amostra. Isso leva em conta a folga do sistema e permite a gravação sincronizada.

Depois de se mover para a posição da grade, ele inicia um padrão de escrita, que fará com que o microcapilar se mova pela grade e dispense simultaneamente 45 nanolitros de amostra. Em seguida, ele move o microcapilar de volta para o centro da grade, abaixa-o mais 10 micrômetros e retira o excesso de líquido da amostra. Finalmente, a macro retira o microcapilar e desliga o eletroímã, que inicia o mecanismo de congelamento de mergulho.

Uma vez liberado do ímã, solte cuidadosamente o adaptador magnético do êmbolo e transfira rapidamente a grade do copo de etano para o recipiente de criogênio, contendo a caixa criogênica, colocando a grade em um slot livre. Para começar, prepare as células conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e monte a lâmina de óxido de índio e estanho no inserto do microscópio. Use dois parafusos para fixar a corrediça no inserto de alumínio e para garantir o contato elétrico entre o revestimento de óxido de índio e estanho da lâmina e a estrutura de alumínio eletricamente aterrada.

Em seguida, remova o meio de cultura de células do poço e lave as células duas vezes com 300 microlitros de tampão de eletroporação. Após a última lavagem, mantenha as células no tampão de eletroporação. Em seguida, coloque a inserção de alumínio que está segurando a lâmina de óxido de índio e estanho no estágio da incubadora de células vivas, na configuração.

Usando o microscópio, localize a cultura de células e escolha uma área sem células. Aproxime-se da ponta microcapilar na superfície da lâmina e toque-a suavemente. Em seguida, retire a ponta em 100 micrômetros e salve a posição como células.

Agora saia rapidamente da cultura de células e lave a ponta microcapilar com algumas dezenas de nanolitros de líquido do sistema e, em seguida, coloque-a na cultura de células novamente. Dispense alguns nanolitros durante a imersão no poço PDMS para garantir que nenhuma bolha de ar fique presa na ponta. Clique duas vezes na posição da célula e aproxime-se suavemente da superfície da lâmina de óxido de índio e estanho e, ao entrar em contato, retraia a ponta em 10 micrômetros.

Neste ponto, selecione uma célula próxima para lise. e coloque a ponta do microcapilar acima da célula-alvo. Em seguida, inicie o script de macro para lise de célula única.

Uma vez iniciado, o script solicitará uma posição para a qual o microcapilar deve ser movido depois que uma célula for lisada com sucesso. Insira a posição desejada, por exemplo, grade, para a grade EM. A macro prosseguirá sem intervenção do usuário e começará movendo o estágio do microscópio em cultura de células 100 micrômetros para a esquerda, onde tira um instantâneo da célula-alvo.

Em seguida, 15 nanolitros de água bidestilada são dispensados do tubo microcapilar, deslocando e diluindo o tampão com alto teor de sal, aplicando pressão osmótica na célula. Em seguida, o estágio se move de volta para posicionar a ponta acima da célula de destino novamente. Lá, uma explosão de tensão predefinida é aplicada e, após 500 milissegundos, o sistema de bombeamento começa a aspirar três nanolitros de amostra a uma vazão de dois microlitros por minuto.

Finalmente, o palco se move para a esquerda novamente, o que permite que a célula seja inspecionada. Uma janela é exibida solicitando a entrada do usuário. Se a célula foi bem-sucedida, digite yes para tirar um instantâneo da célula lisada.

Em seguida, o microcapilar se desloca para o local endo, imerso no líquido do reservatório. Deixe o microcapilar imerso por oito a 12 minutos, dependendo da geometria do bico. Em seguida, dispense cinco nanolitros do lisado celular condicionado na grade.

Retire o microcapilar e deixe a amostra condicionada secar lentamente em um estágio de ponto de orvalho. Por fim, remova a grade do palco e armazene-a em temperatura ambiente em uma caixa de grade. Aqui são mostradas imagens criogênicas típicas de amostras congeladas usando a configuração do CryoWriter descrita.

Na visão geral da grade, a periferia do gelo vítreo pode ser vista claramente. Após um exame mais detalhado de uma fenda de grade com o filme de carbono furado contendo gelo vítreo, buracos brancos podem ser encontrados, indicando que nem todos os buracos foram preenchidos com tampão de amostra. Em uma das amostras contendo buracos de carbono, a cauda de um bacteriófago pode ser vista claramente com detalhes.

Usando o CryoWriter configurado para realizar proteômica visual de célula única, pode-se ver coisas como proteínas individuais, por exemplo, actina filamentosa e placas de membrana com proteínas anexadas. A imagem que você pode ver no painel 6b está manchada negativamente com uma mancha negativa de 2%, com base em um composto de organotungstênio. O painel c mostra um lisado de célula única preparado para crio EM. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar corantes negativos ou grades crio-EM, a partir de volumes totais de nanolitros de amostras de proteínas ou extratos de células únicas.

Não se esqueça de que trabalhar com etano líquido e nitrogênio pode ser extremamente perigoso, e precauções, como usar óculos de segurança e jaleco, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.