Name: Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a preparar amostras miniaturizadas para microscopia eletrônica de transmissão sem etapas de papel-blotting. Esta técnica reduz perdas amostrais e permite análise de lisados de célula única para proteômica visual.

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Os autores gostaria de agradecer a oficina do Biozentrum da Universidade de Basileia para seu apoio, S. A. Müller para discussões críticas e para ler cuidadosamente o manuscrito, A. Fecteau-LeFebvre para assistência técnica com EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann para proteína de membrana testar amostras (todos da C-CINA, Universidade de Basileia, Biozentrum) e r. Engel, emérito Universidade de Basileia para suas conversas inspiradoras. Amostras de teste foram gentilmente cedidas por P. Ringler, M.-A. Mahi e T. Schwede (Biozentrum, Universidade de Basileia), p. Leiman (laboratório de biologia estrutural e biofísica, EPFL) e R. Diaz-Avalos (centro de biologia estrutural de Nova York, EUA). O projeto foi apoiado pelo Instituto suíço de nanociência (SNI, projeto P1401, projeto ARGOVIA MiPIS) e o Swiss National Science Foundation (SNF, projeto 200021_162521).

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Os autores Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg e Thomas Braun declaram o interesse financeiro concorrente seguinte: O conceito de cryoWriter é parte do pedido de patente PCT / EP2015/065398 e EP16194230.

O instrumento de 'cryoWriter' e os protocolos necessários à elaboração de grades de amostra para NS - e cryo-EM volumes de nL tamanho total da amostra e evitar completamente a etapa clássica de papel-mancha são apresentados. Microfluidic princípios e um sistema Micromecânico são combinados na cryoWriter para tornar isto possível.
Nossa experiência mostra que, quando são usados os métodos miniaturizados apresentados neste manuscrito, o espaço de parâmetro para a preparação de EM-grade é maior do que para os métodos clássicos e sob o mais rigoroso controle de usuário. Importante, a maior reprodutibilidade alcançada torna possível pré-selecionar com sistema de tampão de amostra, complementado com uma proteína de teste prontamente disponível, para determinar os parâmetros ideais antes que a experiência é realizada. Isto mantém o consumo da amostra de interesse para o absoluto mínimo e é altamente recomendado. Passos críticos para a preparação de grade ambos EM NS - e cryo-são: (i) preparação do sistema de bomba; para subnanolitros dosear o volume, o líquido do sistema (água) deve ser desgaseificado e bubble livre. (ii) um controle preciso do brilho da descarga ou plasma limpeza passo; as características de superfície da grade EM são cruciais para obter resultados reprodutíveis. (iii) condicionamento de amostra; o tempo necessário para o condicionamento, por exemplo, com NS, depende o tipo de buffer, o teor de sal e a concentração (Figura 3), bem como sobre a geometria do bocal do conta24. (iv) taxas de evaporação para preparações de NS-EM para EM quantitativos; o efeito do café-anel pode proibir a análise quantitativa das preparações de NS-EM e deve ser suprimido por taxas de evaporação lenta, controladas pela DP-fase.
Diferentes aspectos dos métodos de preparação de grade apresentados podem ser combinados livremente permitindo o desenvolvimento de protocolos versátil para amostras específicas. Exemplos típicos seria a remoção de uma substância que impede EM alta resolução, por exemplo, glicerol, por uma etapa de condicionamento antes da preparação de grade para cryo-i; a introdução de moléculas de mediador, tais como ligantes, por condicionamento antes que as grelhas estão preparadas; ou o exame de uma única célula lisado por NS ou cryo-EM - (Figura 6).
O uso de microfluídica e quantidades de amostra mínima nos métodos apresentados remove completamente a necessidade de etapas de papel-mancha. Isto é uma grande vantagem, porque a mancha de papel é um tratamento severo para proteínas, potencialmente contaminar a amostra com íons indesejáveis e inerentemente levando a perda de massa da amostra. Por outro lado, efeitos potencialmente provocados pela interface ar-água do filme fino amostra formado quando EM crio-as amostras são preparadas da maneira clássica não são evitados quando o cryoWriter é usado. Apropriado para cryo-EM grades podem ser preparados com um tempo de espera menos de 0.2 s entre o aplicativo de exemplo e vitrificação (dados não mostrados). No entanto, como proteínas viajam alguns décimos de um nanômetro em alguns nanossegundos por difusão, ainda há tempo suficiente para que eles colidem com a interface ar-água de uma película de espessura da amostra 100 nm várias vezes. No entanto, a quantidade de proteínas, aderindo a interface ar-água pode ser reduzida significativamente por estes intervalos de tempo curto e pode evitar a desnaturação de proteína ou restrito a orientação das partículas. Outra abordagem promissora que pode proteger as proteínas sensíveis através da interface ar-água é para cobrir o filme de amostra por substâncias activas de superfície de baixo peso molecular. Estes compostos poderiam ser introduzidos rapidamente por uma etapa de condicionamento no cryoWriter antes de preparação de grade. O elevado rácio de superfície e o volume dos sistemas microfluídicos é uma limitação adicional da cryoWriter, como amostra potencialmente podem ser perdidos por adsorção inespecíficas à superfície conta e perturbar a análise quantitativa pela contagem de partículas. O problema é abordado de duas maneiras: primeiro, a amostra não viajar longas distâncias dentro da conta. Com efeito, o volume de amostra de nanolitros permanece na ponta capilar em todo o processamento. Segundo, a superfície a relação entre o volume é reduzida ainda mais usando microcapilares com diâmetros internos relativamente grandes, por exemplo, 180 µm. em terceiro lugar, as superfícies da microcapilares podem ser facilmente passivadas, se necessário, por exemplo, tratando-os com glicóis de etanol polylysine comercialmente disponíveis (PLL-PEG).
A análise de alta resolução de proteínas pela abordagem única partícula usada EM requer apenas 100.000 para algumas imagens de milhões de partículas de proteínas individuais. Isto significa que técnicas microfluidic podem fornecer bastante complexos de proteínas para a investigação estrutural. Um método de imuno-precipitação miniaturizado para o isolamento rápido de complexos de proteínas (cerca de 1 hora) de quantidades mínimas de célula (cerca de 40.000 células) foi desenvolvido no início28. Esse método será agora diretamente vinculado à fase de preparação de amostra miniaturizada do cryoWriter. O objetivo final é desenvolver um encanamento microfluidic integrado para proteína ultra rápido isolamento e cryo-EM grade preparação que requer menos de duas horas em todos. Além disso, conforme demonstrado pela Figura 6, a pequena quantidade e volume de material necessário para a preparação da amostra e o condicionado quase sem perdas e procedimento de preparação de grade alcançado usando o cryoWriter, que permitam estudar a proteína complexos de células individuais. Juntos, o método imuno-precipitação miniaturizados e a cryoWriter lançar as bases de um novo método de proteômica, chamado "única célula proteomics visual", como nós recentemente demonstrado por experimentos de calor-choque24. Algoritmos de análise de dados voltados para a análise de imagens de "visual proteomics" estão sendo testados atualmente.

Hardware e software de análise estrutural de complexos de proteínas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) maciçamente tem avançado nos últimos anos. As melhorias feitas pavimentaram o caminho para uma "revolução de resolução"1,2 e mudaram fundamentalmente pesquisa estrutural. A revolução começou com o advento do cryo-elétron microscopia (cryo-EM)3,4, que permite a preparação de amostras biológicas sob perto condições fisiológicas enquanto diminuindo a sensibilidade de radiação e prevenção evaporação da amostra no alto vácuo do microscópio eletrônico de transmissão5. Nos anos seguintes, o progresso tecnológico incremental aumentou gradualmente realizáveis a resolução. Entre estas inovações foram a aplicação de armas de emissão de campo6,7e, mais recentemente, melhorou a algoritmos de análise de dados, tais como métodos de máxima verossimilhança8,9. Elétron direto detector câmeras10,11,12,13, imagens do filme-mode e o acompanhamento software desenvolvimentos14,15, 16 , 17, desde que o avanço final necessário para atingir resolução atômica para amostras biológicas por análise de partícula única (para uma revisão, ver Cheng, Grigorieff, et al 18). a importância da cryo-EM foi recentemente reconhecida pela atribuição do prémio Nobel da química para três dos pioneiros.
Para uma amostra biológica pela TEM de imagem, o método usado para carregar a grade EM com amostra (posteriormente referida como "preparação de grade") deve garantir que a camada resultante de amostra (i) é fina o suficiente (&lt; 100 nm) evitar ruído extensivo por inelástica ou multiplicar espalhados elétrons, (ii) suporta o alto vácuo do microscópio de elétron, e (iii) protege as biomoléculas de danos de radiação. Dois métodos principais são usados para cumprir estes pré-requisitos: mancha negativa(NS)19,20 procedimentos (Figura 1A) fixar a amostra a uma película fina de carbono, incorporar as biomoléculas em amorfo de heavy metal e então permitir que o assembly secar no ar. Isto é simples e rápido, e as grades de EM carregado (posteriormente referidas como "grades de amostra") são fáceis de armazenar e podem ser mantidos por longos períodos de tempo (geralmente anos). Na temperatura, as preparações apresentam alto contraste devido a NS e toleram doses maiores de elétron de cryo-preparações, mas a resolução é limitada a cerca de 20 procedimentos Å. Cryo-EM (Figura 1B) empregam holey carbono suporta. Uma película fina de solução da amostra é atravessada através dos furos e a grade EM é mergulhada em um cryogen, etano geralmente liquefeito, para resfriá-lo rapidamente abaixo-150 º C. O resultado é um amorfo, vitrificados, 50 a 100 nm de espessura filme da solução nos furos do suporte. Esta película fina, amorfa resiste o alto vácuo no microscópio eletrônico e, no caso ideal, preserva estruturas biológicas em seu estado nativo. O procedimento permite que amostras biológicas para criação da imagem em alta resolução. No entanto, a grade de amostra deve ser mantida em temperaturas abaixo-150 º C em todos os momentos para evitar desvitrificação. Isso pode ser fotografado usando doses de elétrons relativamente elevado devido a baixa temperatura, mas o contraste e a relação sinal-ruído, no entanto, é baixa. Portanto, técnicas de amostragem são empregadas para aumentar o contraste e, desde que a amostra é fotografada de ângulos diferentes, mapa de alta resolução tridimensional (3D) pode ser reconstruído. O mais comumente usado e altamente bem sucedido método de reconstrução 3D a partir de agora é a abordagem única partícula. Para uma recente revisão, consulte Cheng em Al.18.
Mancha negativa TEM (NS-EM) é importante para o rastreio e controle de qualidade, quando o alto contraste é necessário ou quando apenas uma quantidade limitada de amostra está disponível (adsorção para o filme de carbono geralmente concentra-se a amostra). Única partícula cryo-EM é o método padrão-ouro se destinam-se para reconstruções 3D de alta resolução da estrutura da proteína.
<img alt="Diagrama de técnicas de micro-manipulação; inclui deposição de gotículas, extração de nanoestrutura e transferência." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: princípios de TEM grade preparação e comparação entre o clássico (painel A, B) e uma abordagem microfluidic (painel C, D). A) preparação de grade NS-EM clássico: sobre 3 µ l de amostra são pipetado à mão para um grid EM coberto com uma película de carbono contínuo (posteriormente referida como um 'grade EM NS-') (i). Após incubação por aproximadamente 10 s, papel de filtro é utilizado para borre fora o excesso de líquido do lado, (ii), deixando as biomoléculas adsorvidas em uma película fina de água. Posteriormente, a proteína é incubada em uma solução de sal de metal pesado, por exemplo, 2% de acetato de uranilo, para 20 s (iii) e novamente o líquido é removido pela mancha do lado usando papel de filtro (iv). Finalmente, a EM-grade é deixada para secar ao ar. B) preparação de grade cryo-EM clássico: sobre 3 µ l de amostra são pipetado por uma mão em um filme de carbono holey. Para formar uma película fina de amostra, o líquido excedente é removido pelo papel-mancha rosto-de um ou de ambos os lados (ii). Finalmente, a grade é rapidamente mergulhou etano líquido para vitrificação (iii). C) preparação de NS-EM grade usando a configuração de cryoWriter: volume A 5 nL é aspirado do estoque de amostra usando uma conta de (i). Para amostra de condicionamento, a ponta de conta é imerso na solução de condicionamento, por exemplo, 2% de acetato de amónio. Íons e pequenas moléculas são trocadas por difusão (ii). Observe que as dimensões da conta assegurar que todo o processo é conduzido de difusão. As proteínas têm muito baixa constantes de difusão do que íons de sal e não são significativamente perdeu24. Finalmente, a amostra é dispensada na grade e deixa-se secar (iii). D) princípios de preparação de cryo-EM grade usando o método baseado em cryoWriter: EM um grid coberto com uma película de carbono holey é colocado na superfície de uma plataforma de controlo de temperatura e mantido por uma pinça. A temperatura da plataforma é controlada em um deslocamento da temperatura de ponto de orvalho do ambiente grade. A grade é movido em relação a conta que contém a amostra e a conta é abaixada até é alguns micrômetros acima da grade. Posteriormente, alguns nanoliters da amostra são dispensados a partir dele enquanto o palco é movido em um padrão espiral; excesso de líquido é re-aspirado (i). Depois da grade de EM aprontar, a conta é retirada e grade permanece na temperatura controlada plataforma (posteriormente denominada ponto de orvalho (DP) palco) por um tempo curto permitir que uma quantidade controlada de amostra para evaporar. Para mergulho a congelar, a grade é rapidamente retirado do palco usando uma pinça (ii), capotou por 90° para a posição vertical e mergulhado em um banho de cryogen (iii) (posteriormente referido como mecanismo de 'escolher-e-mergulhar'). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Infelizmente, os métodos de preparação de grade usados para NS e cryo-EM não melhoraram significativamente desde que foram inventados. Atuais inconvenientes são o consumo elevado de amostra (aprox. 3 µ l de proteína 1 mg/mL) e a grande quantidade (&gt; 99%) da amostra perdeu (Figura 1A, B). Além disso, o método clássico utilizado para preparar grades para cryo-EM é um procedimento duro para proteínas: primeiro, que envolve um extensivo rosto-no papel-mancha passo (Figura 1B, ii), e, em segundo lugar, a proteína é exposta para o interface ar-água para uma quantidade significativa de tempo21. Aqui, um método alternativo para amostra pré-condicionamento, preparação da amostra grade e pós-processamento (grade de secagem ou vitrificação) para NS-EM (Figura 1C) ou cryo-EM (Figura 1D) é apresentado. A configuração construída in-house, chamada "cryoWriter", usa amostra miniaturizada manipulação tecnologia e microfluidic princípios para aspirar, condição e dispensar a amostra, evitando papel mancha completamente e fornecer métodos alternativos para amostras finas para Cryo-EM. Significativamente reduz o consumo de amostra e melhora o controle de usuário sobre a preparação da amostra como um todo. Além disso, o método permite que novos aplicativos experimentais; tais como a preparação dos componentes biológicos isolados de células individuais em uma abordagem denominada "única célula visual proteomics"22,23,24,25.

<table><tbody><tr><td><forte>Manuseio de líquidos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponta microcapilar</td><td>Novo Objective</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>Pontas de Sílica 30 &micro; ID da ponta m, 100 &micro; m ID, pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>Pontas de Sílica 30 &micro; ID da ponta m, 150 &micro; m ID, pk. 20</td></tr><tr><td>Manga condutora</td><td>Nova Objetiva</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>Elastômero condutor para contato HV, 12" de comprimento</td></tr><tr><td>Tubo de sílica fundida</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Tubo FS padrão, 150 &micro; m ID, 363 e micro; m OD, conector PressFit de 5 metros</td></tr><tr><td></td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. Conector PressFit 0.25 a 0.25 mm ID, pk. 25&nbsp;</td></tr><tr><td>Seringa 10 &micro; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Ponta Luer (agulha não incluída)&nbsp;</td></tr><tr><td>Controlador de bomba de seringa</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>e controlador MESYS</td></tr><tr><td>Unidade de dosagem de bomba de seringa</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>unidade de dosagem MESYS</td></tr><tr><td><forte>Controle de temperatura</forte>Sensor de ponto de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>orvalho</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT Sensor de</td><td>umidade/temperatura, cálculo do ponto de orvalho, USB e DLL embutido</td></tr><tr><td>Temperatura sensor</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Sensor de temperatura montável em superfície Pt1000</td></tr><tr><td>Controlador Peltier</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>Controlador de temperatura PID para ativação de sistemas acionados por Peltier com saída de tensão constante</td></tr><tr><td>Elemento Peltier</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Bloco de resfriamento de água</td> <td>-</td><td></td> <td>Bloco de resfriamento de água para elemento peltier de 40x40 mm, base de cobre</td></tr><tr><td>Digitec.ch de</td><td>bomba de água</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 Bomba de reservatório de 5,25 baías Bloco de</td></tr><tr><td>trocador de calor de água</td> preto <td>V4 -</td> <td>Bloco de trocador de calor de água com 2 ventiladores para resfriar a água circulante</td><td></td></tr><tr><td>Pequenos refrigeradores de água</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td></tr><tr><td>Pequenos elementos peltier</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &deg; C, 2 pcs</td></tr><tr><td>Mechanics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estágio linear eixo z</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Estágio translacional de precisão de alta carga, faixa de deslocamento de 50 mm, motor DC</td></tr><tr><td>Controlador de estágio</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury Servo Controller</td></tr><tr><td>Microscópio estágio de eixo xy Estágio</td> motorizado <td>H117EIL5</td> da <td>Prior Scientific</td><td>para Zeiss Axiovert 200 microscópio invertido</td></tr><tr><td>Pequenos ímãs permanentes</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Ímã de haste &Oslash; 5 mm, altura 8,47 mm, neodímio, N45, niquelado, pk. 10</td></tr><tr><td>Eletroímã pequeno</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Eletroímã 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Eletroímã controlador</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Placa PCB de controle de eletroímã</td></tr><tr><td>Cubo</td> <td>solenóideDistrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini pinças</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Tipo 5 mini, pontas super finas</td></tr><tr><td>Várias peças optomecânicas</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Várias peças mecânicas</td><td>Oficina Biozentrum, Universidade Basel-Placas</td><td></td> <td>adaptadoras, suportes, etc. com design personalizado, consulte os arquivos CAD em anexo</td></tr><tr><td><forte>Óptica</forte></td>Diodo laser Thorlabs CPS780S módulo de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>diodo laser de 780 nm 2,5 mW</td></tr><tr><td>Fotodetector</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Detector de ganho comutável, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>EM grids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>durasin film tem emsdiasum.com</td><td></td><td>DTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; membranas de nitreto de silício para TEM, pacote de 5</td></tr><tr><td>Quantifoil 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp; SIGMA</td><td>Dulbecco' s Fosfato tampolado solução salina</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Coloração negativa à base de vanádio</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Coloração negativa à base de tungstênio</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>A estrutura openBEB 2 está disponível mediante solicitação, a versão 3 poderá ser baixada</td></tr><tr><td>no controle CryoWriter software (plugin openBEB)</td><td></td><td>Disponível mediante solicitação, taxas extras para software de driver de terceiros podem ser aplicadas.</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Devido a recentes progressos tecnológicos, microscopia cryo-elétron (cryo-EM) está rapidamente se tornando um método padrão para a análise estrutural dos complexos de proteína para resolução atômica. No entanto, técnicas de isolamento de proteínas e métodos de preparação de amostra para EM permanecem um gargalo. Um número relativamente pequeno (100.000 para alguns milhões) de partículas de proteínas individuais precisa ser fotografada para a análise de alta resolução de proteínas pela partícula única abordagem EM, fazer a amostra miniaturizada manipulação microfluidic princípios e técnicas viável.
Um miniaturizados, papel-mancha-livre EM grade método de preparação para pré-condicionamento de amostra, escorva de grade EM e pós-processamento que consome apenas nanolitros-volumes da amostra é apresentado. O método usa um sistema de distribuição com precisão subnanolitros a absorção líquida de controle e preparação de grade EM, uma plataforma para controlar a temperatura de grade, determinando, assim, a umidade relativa do ar acima da grade EM e um escolha-e-mergulho-mecanismo para amostra vitrificação. Para cryo-EM, uma grade EM é colocado no palco temperatura controlada e a amostra é aspirada em um capilar. A ponta capilar é posicionada em proximidade com a superfície da grade, a grade é carregado com a amostra e excesso é re-aspirado para a conta. Posteriormente, o filme de amostra é estabilizado e ligeiramente diluído por evaporação de água controlada, regulada pelo deslocamento da temperatura da plataforma em relação ao ponto de orvalho. Em um determinado ponto é acionado o mecanismo de escolha-e-mergulho, rapidamente, transferindo a grade EM aprontada em etano líquido para vitrificação de amostra. Alternativamente, métodos de condicionamento de amostra estão disponíveis para preparar mancha negativa (NS) EM volumes de amostra tamanho de nanolitros.
As metodologias extremamente reduzem o consumo de amostra e evitar abordagens potencialmente prejudiciais às proteínas, tais como a mancha de papel de filtro utilizado em métodos convencionais. Além disso, a minúscula quantidade de amostra necessária permite romance estratégias experimentais, tais como rápida amostra condicionado, combinação com lise de célula única para "proteomics visual", ou "sem perdas" preparação da amostra total de análise quantitativa de amostras complexas.

É apresentado um instrumento e métodos para a preparação dos volumes de nanolitros de tamanho de amostra para microscopia eletrônica de transmissão. Sem papel-mancha passos são necessários, evitando assim as consequências prejudiciais que isso pode ter para proteínas, reduzindo a perda de amostra significativamente e permitindo a análise do lisado para proteômica visual única célula.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia estrutural, como a preparação de proteínas sensíveis, onde uma quantidade limitada de proteína está disponível. A principal vantagem dessa técnica é que, em comparação com os métodos padrão de preparação de amostras, apenas quantidades mínimas de amostra são necessárias e que nenhuma etapa de borramento de papel está envolvida. As implicações desta técnica se estendem à análise de células únicas por proteômica visual ou ao diagnóstico de doenças relacionadas a proteínas.Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando tínhamos a tecnologia disponível para resolver estruturas de alta resolução com apenas cerca de 100.000 partículas individuais. Para começar, prepare o exemplo conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, monte o copo de etano, o suporte da caixa criogênica e a aranha.E encha o recipiente de criogênio até a borda com nitrogênio líquido. Após alguns minutos, o copo estará frio e livre de nitrogênio líquido. Em seguida, abra a garrafa de gás etano e deixe lentamente o gás fluir para o copo de etano.Deixe o copo encher com etano líquido até que o nível esteja dois a três milímetros abaixo do topo. Isso levará alguns minutos e requer cerca de cinco mililitros de etano líquido. Remova a aranha, coloque a tampa de poliestireno em cima e coloque o recipiente de criogênio na montagem do gravador criogênico.Segure a grade EM descarregada de brilho com a pinça do gravador criogênico, dê um nó na pinça no eletroímã e aparafuse o micromanipulador para alinhar a grade plana no palco, com o lado do filme de carbono para cima. De volta ao software, clique duas vezes em grid_save. Em seguida, ajuste a posição microcapilar, de modo que a ponta fique aproximadamente 10 micrômetros acima da superfície da grade.Certifique-se de que o microcapilar possa se mover livremente pela grade, sem tocá-lo em nenhum lugar. E se necessário, retire o microcapilar alguns micrômetros. Em seguida, traga-o para a posição de volta ao centro da grade e salve a nova posição como grade.Mova o microcapilar de volta para a posição inicial. Em seguida, lave o microcapilar com algumas dezenas de nanolitros de líquido do sistema e use tecido sem fiapos para remover quaisquer gotas do microcapilar. Com tudo agora preparado, inicie o script de macro.A macro primeiro se move para a posição e dispensa cinco nanolitros de líquido do sistema para remover quaisquer bolhas de ar na ponta e, em seguida, passa para a posição das amostras. Em seguida, aspira 65 nanolitros de amostra e, em seguida, infunde cinco nanolitros de volta no tubo de amostra. Isso leva em conta a folga do sistema e permite a gravação sincronizada.Depois de se mover para a posição da grade, ele inicia um padrão de escrita, que fará com que o microcapilar se mova pela grade e dispense simultaneamente 45 nanolitros de amostra. Em seguida, ele move o microcapilar de volta para o centro da grade, abaixa-o mais 10 micrômetros e retira o excesso de líquido da amostra. Finalmente, a macro retira o microcapilar e desliga o eletroímã, que inicia o mecanismo de congelamento de mergulho.Uma vez liberado do ímã, solte cuidadosamente o adaptador magnético do êmbolo e transfira rapidamente a grade do copo de etano para o recipiente de criogênio, contendo a caixa criogênica, colocando a grade em um slot livre. Para começar, prepare as células conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e monte a lâmina de óxido de índio e estanho no inserto do microscópio. Use dois parafusos para fixar a corrediça no inserto de alumínio e para garantir o contato elétrico entre o revestimento de óxido de índio e estanho da lâmina e a estrutura de alumínio eletricamente aterrada.Em seguida, remova o meio de cultura de células do poço e lave as células duas vezes com 300 microlitros de tampão de eletroporação. Após a última lavagem, mantenha as células no tampão de eletroporação. Em seguida, coloque a inserção de alumínio que está segurando a lâmina de óxido de índio e estanho no estágio da incubadora de células vivas, na configuração.Usando o microscópio, localize a cultura de células e escolha uma área sem células. Aproxime-se da ponta microcapilar na superfície da lâmina e toque-a suavemente. Em seguida, retire a ponta em 100 micrômetros e salve a posição como células.Agora saia rapidamente da cultura de células e lave a ponta microcapilar com algumas dezenas de nanolitros de líquido do sistema e, em seguida, coloque-a na cultura de células novamente. Dispense alguns nanolitros durante a imersão no poço PDMS para garantir que nenhuma bolha de ar fique presa na ponta. Clique duas vezes na posição da célula e aproxime-se suavemente da superfície da lâmina de óxido de índio e estanho e, ao entrar em contato, retraia a ponta em 10 micrômetros.Neste ponto, selecione uma célula próxima para lise. e coloque a ponta do microcapilar acima da célula-alvo. Em seguida, inicie o script de macro para lise de célula única.Uma vez iniciado, o script solicitará uma posição para a qual o microcapilar deve ser movido depois que uma célula for lisada com sucesso. Insira a posição desejada, por exemplo, grade, para a grade EM. A macro prosseguirá sem intervenção do usuário e começará movendo o estágio do microscópio em cultura de células 100 micrômetros para a esquerda, onde tira um instantâneo da célula-alvo.Em seguida, 15 nanolitros de água bidestilada são dispensados do tubo microcapilar, deslocando e diluindo o tampão com alto teor de sal, aplicando pressão osmótica na célula. Em seguida, o estágio se move de volta para posicionar a ponta acima da célula de destino novamente. Lá, uma explosão de tensão predefinida é aplicada e, após 500 milissegundos, o sistema de bombeamento começa a aspirar três nanolitros de amostra a uma vazão de dois microlitros por minuto.Finalmente, o palco se move para a esquerda novamente, o que permite que a célula seja inspecionada. Uma janela é exibida solicitando a entrada do usuário. Se a célula foi bem-sucedida, digite yes para tirar um instantâneo da célula lisada.Em seguida, o microcapilar se desloca para o local endo, imerso no líquido do reservatório. Deixe o microcapilar imerso por oito a 12 minutos, dependendo da geometria do bico. Em seguida, dispense cinco nanolitros do lisado celular condicionado na grade.Retire o microcapilar e deixe a amostra condicionada secar lentamente em um estágio de ponto de orvalho. Por fim, remova a grade do palco e armazene-a em temperatura ambiente em uma caixa de grade. Aqui são mostradas imagens criogênicas típicas de amostras congeladas usando a configuração do CryoWriter descrita.Na visão geral da grade, a periferia do gelo vítreo pode ser vista claramente. Após um exame mais detalhado de uma fenda de grade com o filme de carbono furado contendo gelo vítreo, buracos brancos podem ser encontrados, indicando que nem todos os buracos foram preenchidos com tampão de amostra. Em uma das amostras contendo buracos de carbono, a cauda de um bacteriófago pode ser vista claramente com detalhes.Usando o CryoWriter configurado para realizar proteômica visual de célula única, pode-se ver coisas como proteínas individuais, por exemplo, actina filamentosa e placas de membrana com proteínas anexadas. A imagem que você pode ver no painel 6b está manchada negativamente com uma mancha negativa de 2%, com base em um composto de organotungstênio. O painel c mostra um lisado de célula única preparado para crio EM. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar corantes negativos ou grades crio-EM, a partir de volumes totais de nanolitros de amostras de proteínas ou extratos de células únicas.Não se esqueça de que trabalhar com etano líquido e nitrogênio pode ser extremamente perigoso, e precauções, como usar óculos de segurança e jaleco, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cryo Electron Microscópios, ou de varredura (MEV) ou de transmissão (TEM), são amplamente utilizados para a caracterização de amostras biológicas ou outros materiais com alto teor de água 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) é usado para identificar características de interesse em amostras e extrair, uma lamela elétron-fina e transparente de transferência para um crio-TEM.

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