Visualização da ativação de caspase em macrófagos derivados de monócitos humanos

Nas células imunológicas, a caspase-1, uma caspase inflamatória, é um componente imuno-responsivo chave que existe em uma forma inativa. Essas formas inativas consistem em um pró-domínio fundido com um domínio catalítico e tornam-se ativas por dimerização induzida por proximidade.

Para visualizar a ativação da caspase in vivo, comece com uma cultura de macrófagos derivados de monócitos humanos transfectados expressando proteínas fluorescentes vermelhas e um par de proteínas repórteres de complementação fluorescente. As proteínas repórter contêm um pró-domínio da caspase-1 fundido com fragmentos não fluorescentes da proteína de Vênus, Vênus-N ou Vênus-C.

Trate as células com um meio de imagem contendo lipopolissacarídeos - um estimulante inflamatório derivado de bactérias e ionóforos de potássio - nigericina.

Os lipopolissacarídeos interagem com os receptores de reconhecimento de padrões no macrófago, iniciando a montagem de um complexo inflamassoma.

As moléculas de nigericina entram na célula e se ligam aos íons potássio, causando seu efluxo no meio extracelular e diminuindo a concentração intracelular de íons potássio. Isso leva ao priming de proteínas sensoras do inflamassoma com proteínas adaptadoras - uma proteína de ponte entre a proteína sensora e a procaspase-1, formando o complexo.

Os pró-domínios contendo fragmentos de Vênus interagem com as proteínas adaptadoras do complexo. Isso aproxima os dois fragmentos, forçando-os a se redobrar e fluorescer.

Visualize as células sob um microscópio de epifluorescência.

As células transfectadas aparecem vermelhas com manchas verdes de fluorescência, confirmando a ativação da caspase.

Pegue um microtubo estéril de 1,5 mililitro por transfecção e adicione o plasmídeo repórter apropriado e os plasmídeos caspase-BiFC no capô. Coloque a estação de pipeta, o dispositivo, as pontas, os tubos de eletroporação e a pipeta em uma capela de fluxo laminar estéril. Conecte e ligue o dispositivo de nucleofecção.

Insira os parâmetros de transfecção na tela de inicialização exibida. Pressione Voltage, digite 1,000 e pressione Done para configurá-lo para 1000 volts. Pressione Largura, digite 40 e pressione Concluído para definir o pulso para 40 milissegundos. Por fim, pressione # Pulsos, digite dois e pressione Concluído para definir o número de pulsos elétricos para 2.

Pegue um dos tubos de eletroporação e encha-o com três mililitros de tampão eletrolítico E à temperatura ambiente. Insira o tubo de eletroporação no suporte da pipeta na estação de pipeta, certificando-se de que o eletrodo na lateral do tubo esteja voltado para dentro e que um som de clique seja ouvido quando o tubo for inserido.

Pegue o pellet celular e adicione 10 microlitros de tampão R de ressuspensão pré-aquecido para cada 1 a 2 vezes 10 às quintas células e misture suavemente com uma micropipeta P20. Adicione 10 microlitros da suspensão celular a cada tubo de transfecção e misture delicadamente com uma micropipeta P20. Insira uma ponta na pipeta pressionando o botão Push até a segunda parada, garantindo que o clamp pega completamente a haste de montagem do pistão na ponta.

Em seguida, pressione o botão Push na pipeta até a primeira parada e mergulhe no primeiro tubo contendo a mistura de DNA de célula ou plasmídeo para aspirar a amostra. Insira a pipeta com a amostra com muito cuidado no porta-pipetas, certificando-se de que a pipeta se encaixa e é colocada adequadamente. Pressione Iniciar na tela sensível ao toque e aguarde até que os pulsos elétricos sejam entregues.

Lentamente, remova a pipeta da estação e adicione imediatamente a suspensão de células transfectadas no poço correspondente com o meio pré-aquecido e livre de antibióticos, pressionando lentamente o botão Push até a primeira parada. Balance suavemente a placa com células transfectadas e incube por uma a três horas em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de cultura pré-aquecido a cada poço.

Coloque o prato na incubadora e aguarde pelo menos 24 horas para a expressão gênica. No dia seguinte, inspecione a viabilidade celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio de epifluorescência.

Remova o meio das células cuidadosamente com uma micropipeta P1000 e adicione 500 microlitros da solução de estímulo na lateral do poço. Para executar poços de controle não tratados, adicione um meio de imagem sem o estímulo.

Para visualizar as células usando um microscópio de epifluorescência ou confocal, ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente, seguindo as instruções do fabricante. Selecione a objetiva de 10 ou 20 vezes e coloque a placa de cultura no microscópio stage.

Encontre células sob o filtro de 568 nanômetros com a ocular e concentre-se nas células que expressam os glóbulos vermelhos repórteres. Conte todos os glóbulos vermelhos no campo visual. Enquanto estiver no mesmo campo visual, mude para os filtros 488 ou 512. Conte o número de glóbulos vermelhos que também são verdes. Conte pelo menos 100 glóbulos vermelhos de no mínimo três campos.