Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Dendríticas células antígenos captação e migrar para órgãos imunes a antígenos presentes processados ​​às células T. Qdot nanocristais rotulagem fornece um sinal duradouro e estável fluorescente. Este permite o rastreamento de células dendríticas a diferentes órgãos, por microscopia fluorescente.

O objetivo geral deste procedimento é preparar células dendríticas para estudos de imagem usando nanocristais de pontos Q. Isso é feito isolando primeiro as células da medula óssea de murns, fêmures e tíbias. Em seguida, as culturas de células da medula óssea são configuradas para facilitar a diferenciação celular em células dendríticas na presença de GM CSF.

Em seguida, as células dendríticas são recuperadas das culturas de células da medula óssea após oito dias. A etapa final do procedimento é corar as células com nanocristais Q fluorescentes. Em última análise, as células dendríticas brilhantemente coradas podem ser visualizadas por microscopia de fluorescência.

A principal vantagem de usar essa tecnologia em comparação com outros métodos, como o uso de células dendríticas GFP, é que os nanocristais de ponto Q retêm sua fluorescência mesmo após a coloração com solventes orgânicos como a acetona. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biólogos de células dendríticas, como propriedades de migração dessas células em diferentes doenças ou no contexto de diferentes doenças. Demonstrando o procedimento de coloração estará Maria Ali, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Após o sacrifício, disseque cuidadosamente a tíbia e os fêmures de dois camundongos sem cortar as extremidades ósseas. Em seguida, use papel de seda para limpar todos os tecidos presos dos ossos, tomando cuidado para não quebrá-los. Em um capuz de biossegurança.

Encha uma placa de Petri de 35 milímetros com etanol a 70% e, em seguida, mergulhe os ossos no etanol por 10 minutos. Depois que os ossos forem esterilizados, recupere-os do etanol e deixe-os secar ao ar por cinco minutos em uma nova placa de Petri. Agora, corte o fêmur no meio e a tíbia pela ponta mais fina.

Infundir o interior dos ossos com um mililitro de meio RPMI usando uma seringa estéril. Recolha a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros e lave-a duas vezes com meio RPMI por centrifugação de 10 minutos a 300 vezes G a quatro graus Celsius em uma centrífuga com rotor de caçamba oscilante. Após a última lavagem, resus suspenda as células em dois mililitros de lise CK, tampone e incube por cinco minutos em temperatura ambiente para eliminar os glóbulos vermelhos.

Em seguida, adicione 13 mililitros de RPMI mais 10% FBS e lave as células mais duas vezes neste meio com as mesmas configurações de centrífuga de antes. Conte as células e ajuste a concentração para duas vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Com RPMI mais 10% FBS, adicione o murino recombinante G-M-C-S-F a uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro.

Em seguida, adicione 10 mililitros desta suspensão a uma placa de Petri de 10 centímetros de qualidade microbiológica estéril e cultura. A suspensão celular em uma incubadora de dióxido de carbono. Três dias depois, adicione mais 10 mililitros de RPMI mais 10% FBS com 20 nanogramas por mililitro de G-M-C-S-F murino recombinante a cada uma das placas preparadas.

Mais três dias depois, recupere 10 mililitros de suspensão celular de cada placa de Petri, centrifugue as células nas mesmas condições e ressuspenda o pellet no mesmo volume de RPMI mais 10% FBS recuperado das placas de Petri e reabasteça com novo murino recombinante G-M-C-S-F. Finalmente, retorne a suspensão celular para cada placa de Petri original e cultive as células por mais dois dias na incubadora de dióxido de carbono. Após oito dias em cultura, recuperar as células flutuantes e frouxamente aderentes lavando as placas de Petri com meio fresco.

Em seguida, rotule as células coletadas com o kit de rotulagem de células Q tracker 6 55 seguindo rigorosamente as instruções do fabricante para rotular cinco vezes 10 elevado ao sexto dos dcs derivados da medula óssea murina com nanocristais Q em uma concentração de 10 nano molares. Primeiro misture cinco microlitros de cada um dos componentes do kit A e B em um tubo einor e incube a mistura por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de RPMI mais 10% FBS e vórtice o tubo por 30 segundos.

Em seguida, adicione cinco vezes 10 ao quinto. Dcs suspenso em 0,5 mililitros de RPMI mais 10% FBS no tubo einor e incubar as células na solução D a 37 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, lave as células duas vezes em RPMI mais 10% FBS nas mesmas condições de antes e ressuspenda o pellet em RPMI.

Esta figura mostra um exemplo de uma microfotografia fluorescente de dcs. Imediatamente após a rotulagem, uma gota de células marcadas foi depositada em uma lâmina de vidro e coberta por uma lamínula. Em seguida, as amostras foram avaliadas em microscópio fluorescente.

Nesta figura, uma microfotografia fluorescente de dcs após 48 horas, maturação in vitro pode ser vista rotulada. Dcs foram cultivados por 48 horas com 100 nanogramas por mililitro, LPS e 20 nanogramas por mililitro, TNF alfa em câmaras de cultura de lâminas em uma incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, as amostras foram lavadas com PBS fixado com acetona, contracoloração com DPI e avaliadas em microscópio fluorescente.

DCS marcados amadurecidos in vitro foram analisados por citometria de fluxo Q células coradas com pontos dão um sinal forte no FL três canais Q do corado e não corado. As DCS foram adicionalmente coradas com anticorpos específicos contra marcadores de maturação, CD 86 e CD 40, e as células de controle do isotipo foram então analisadas por citometria de fluxo. Além disso, os níveis de IL seis e óxido nítrico foram determinados em sobrenadantes de DCS de coloração Q madura e controles.

Aqui, uma figura representativa de DCS marcada em um tecido dissecado é mostrada marcada. DCS maduros foram injetados por via intravenosa em camundongos C 57 pretos de seis. Três dias depois, os camundongos foram sacrificados e os baços foram coletados.

Congelamento instantâneo embebido em OCT e seções de oito mícrons foram preparados usando um criostato. As amostras foram então fixadas com acetona, contracoloração com DPI e avaliadas em microscópio fluorescente. Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como pose de antígeno ou maturação com diferentes estímulos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a migração de células dendríticas em resposta a diferentes estímulos de maturação.