Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento
2 de junho de 2011
Dendríticas células antígenos captação e migrar para órgãos imunes a antígenos presentes processados às células T. Qdot nanocristais rotulagem fornece um sinal duradouro e estável fluorescente. Este permite o rastreamento de células dendríticas a diferentes órgãos, por microscopia fluorescente.
O objetivo geral deste procedimento é preparar células dendríticas para estudos de imagem utilizando nanocristais de ponto quântico. Isso é realizado primeiramente isolando células da medula óssea de fêmures e tíbias de camundongos. Em seguida, culturas de células da medula óssea são estabelecidas para facilitar a diferenciação celular em células dendríticas na presença de GM-CSF.
Em seguida, as células dendríticas são recuperadas dos cultivos de células da medula óssea após oito dias. O passo final do procedimento é corar as células com nanocristais fluorescentes Q. Por fim, células dendríticas intensamente coradas podem ser visualizadas por microscopia de fluorescência.
A principal vantagem do uso desta tecnologia em comparação com outros métodos, como o uso de células dendríticas marcadas com GFP, é que os nanocristais de ponto quântico (Q dot) mantêm sua fluorescência mesmo após coloração com solventes orgânicos como acetona. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais para biólogos de células dendríticas, como as propriedades de migração dessas células em diferentes doenças ou no contexto de diversas patologias. A demonstração do procedimento de coloração será realizada por Maria Ali, aluna de pós-graduação do meu laboratório.
Após a eutanásia, dissecar cuidadosamente a tíbia e os fêmures de dois camundongos sem cortar as extremidades dos ossos. Em seguida, usar papel-toalha para remover todos os tecidos aderidos aos ossos, tomando cuidado para não quebrá-los. Em uma cabine de segurança biológica.
Encha uma placa de Petri de 35 milímetros com etanol a 70% e, em seguida, imerja os ossos no etanol por 10 minutos. Após a esterilização dos ossos, recupere-os do etanol e deixe-os secar ao ar por cinco minutos em uma placa de Petri nova. Agora, corte o fêmur ao meio e a tíbia por sua extremidade mais fina.
Infunda o interior dos ossos com um mililitro de meio RPMI utilizando uma seringa estéril. Colete a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros e lave-a duas vezes com meio RPMI por meio de uma centrifugação de 10 minutos a 300 ×g a quatro graus Celsius em uma centrífuga com rotor de cesto oscilante. Após a última lavagem, ressuspenda as células em dois mililitros de tampão de lise de CK e incube por cinco minutos à temperatura ambiente para eliminar os glóbulos vermelhos.
Em seguida, adicione 13 mililitros de RPMI mais 10% de FBS e lave as células mais duas vezes neste meio com as mesmas configurações de centrífuga que antes. Conte as células e ajuste a concentração para duas vezes 10 à quinta células por mililitro. Com RPMI mais 10% de FBS, adicione G-M-C-S-F murino recombinante a uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro.
Em seguida, adicione 10 mililitros dessa suspensão a uma placa de Petri estéril de qualidade microbiológica com 10 centímetros de diâmetro e cultive a suspensão celular em uma incubadora de dióxido de carbono. Três dias depois, adicione outros 10 mililitros de RPMI contendo 10% de FBS com 20 nanogramas por mililitro de G-M-C-S-F murino recombinante a cada uma das placas preparadas.
Três dias depois, recupere 10 mililitros de suspensão celular de cada placa de Petri, centrifugue as células nas mesmas condições e ressuspenda o pellet no mesmo volume de RPMI acrescido de 10% de FBS, conforme recuperado das placas de Petri, e reponha com nova G-M-C-S-F murina recombinante. Por fim, devolva a suspensão celular a cada placa de Petri original e cultive as células por mais dois dias no incubador de dióxido de carbono. Após oito dias de cultivo, recupere as células flutuantes e fracamente aderentes lavando as placas de Petri com meio fresco.
Em seguida, marque as células coletadas com o kit de marcação de células Q tracker 655, seguindo rigorosamente as instruções do fabricante, para rotular cinco vezes 10 à sexta potência de DCs derivadas da medula óssea murina com nanocristais Q numa concentração de 10 nanomolar. Primeiro, misture cinco microlitros de cada um dos componentes do kit, A e B, em um tubo eppendorf, e incube a mistura por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de RPMI mais 10% de FBS e vortexe o tubo por 30 segundos.
Em seguida, adicione cinco vezes 10 à quinta potência de Dcs suspensas em 0,5 mililitros de RPMI mais 10% de FBS ao tubo einor e incube as células na solução D a 37 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, lave as células duas vezes em RPMI mais 10% de FBS nas mesmas condições que antes e re-suspenda o pellet em RPMI.
Esta figura mostra um exemplo de uma microfotografia fluorescente de dcs. Imediatamente após a marcação, uma gota de células marcadas foi depositada sobre uma lâmina de vidro e coberta com uma lamínula. Em seguida, as amostras foram avaliadas utilizando um microscópio fluorescente.
Nesta figura, pode-se observar uma microfotografia fluorescente de DCs após 48 horas, identificada como maturação in vitro. As DCs foram cultivadas durante 48 horas com 100 nanogramas por mililitro de LPS e 20 nanogramas por mililitro de TNF alfa em câmaras de cultura sobre lâminas, em incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, as amostras foram lavadas com PBS, fixadas com acetona, contra-coloridas com DPI e avaliadas utilizando microscópio fluorescente.
Dcs marcadas maduras em cultura foram analisadas por citometria de fluxo. Células coradas com Q dot apresentam um sinal forte no canal FL3. Células coradas e não coradas com Q dot foram adicionalmente coradas com anticorpos específicos contra marcadores de maturação, CD86 e CD40, e controles de isotipo. As células foram então analisadas por citometria de fluxo. Além disso, os níveis de IL-6 e óxido nítrico foram determinados nos sobrenadantes de dcs maduras coradas com Q dot e controles.
Aqui é mostrada uma figura representativa de DCs marcadas em um tecido dissecado. DCs maduras foram injetadas intravenosamente em camundongos C57BL/6. Três dias depois, os camundongos foram sacrificados e os baços foram coletados.
Cortes de oito mícrons embutidos em OCT e congelados rapidamente foram preparados utilizando um criostato. As amostras foram então fixadas com acetona, contra-coloridas com DPI e avaliadas usando um microscópio de fluorescência. Após esses procedimentos.
Outros métodos, como apresentação de antígenos ou maturação com diferentes estímulos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a migração de células dendríticas em resposta a diferentes estímulos de maturação.
Visão Geral
Este estudo descreve um procedimento para o preparo de células dendríticas para imagem utilizando nanocristais Qdot. O método permite a visualização de células dendríticas por microscopia de fluorescência, fornecendo informações sobre suas propriedades de migração.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Microscopia de Fluorescência
Contexto
- As células dendríticas desempenham um papel crucial na resposta imune ao apresentar antígenos às células T.
- Os nanocristais Qdot oferecem um sinal fluorescente estável para o rastreamento de células.
- Este método aprimora o estudo do comportamento das células dendríticas em diversos contextos de doenças.
- Os métodos tradicionais podem não fornecer o mesmo nível de estabilidade da fluorescência.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para marcação de células dendríticas com nanocristais Qdot.
- Facilitar o rastreamento de células dendríticas in vivo.
- Explorar as propriedades de migração de células dendríticas em diferentes modelos de doenças.
Métodos Utilizados
- Isolamento de células da medula óssea de camundongos.
- Cultivo celular com GM-CSF para diferenciação em células dendríticas.
- Coloração de células dendríticas com nanocristais Qdot.
- Visualização utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.
Resultados Principais
- Células dendríticas rotuladas com sucesso exibiram sinais de fluorescência intensos.
- Demonstrou a estabilidade dos nanocristais Qdot em comparação com as marcas GFP.
- Visualizou a maturação e migração de células dendríticas in vitro e in vivo.
- Forneceram informações sobre os mecanismos de resposta imune envolvendo células dendríticas.
Conclusões
- A técnica de marcação com Qdot é eficaz para estudar a dinâmica das células dendríticas.
- Este método pode aprimorar a compreensão do comportamento das células dendríticas em diversas doenças.
- Estudos futuros podem utilizar esta abordagem para investigar diferentes estímulos de maturação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A marcação de células dendríticas com nanocristais Qdot permite fluorescência estável e de longa duração para o rastreamento da migração de células imunes em modelos pré-clínicos. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de imunoterapias, fornecendo visualização confiável da dinâmica de células apresentadoras de antígenos. O método aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, permitindo a observação direta do comportamento de células dendríticas em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das vias de migração e apresentação de antígenos por células dendríticas em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Fornece um marcador fluorescente estável que persiste após fixação e exposição a solventes, reduzindo a perda de sinal durante o processamento de tecidos.
- Valor Preditivo: Apoia a validação funcional de biológicos baseados em células dendríticas por meio do rastreamento da localização in vivo e do estado de maturação.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras de fluorescência quantificáveis para avaliar os estados de maturação e ativação de células dendríticas.
- Valor Operacional: Compatível com plataformas de citometria de fluxo e microscopia, permitindo triagem de alto conteúdo de compostos imunomoduladores.
- Prontidão do Ensaio: Produz lotes padronizados e marcados de células dendríticas adequados para ensaios reprodutíveis de perfil imunológico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o rastreamento da migração de células dendríticas de tecidos periféricos para órgãos linfoides, modelando a vigilância imunológica.
- Valor Operacional: Permite estudos de imagem longitudinal em modelos murinos para avaliar respostas imunes induzidas por vacinas ou adjuvantes.
- Continuidade Translacional: Apoia estudos alinhados a biomarcadores ao correlacionar a localização das células dendríticas com desfechos imunes funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao fluxo de trabalho de descoberta desde a validação inicial do alvo até o perfil imunológico pré-clínico, permitindo a visualização da dinâmica das células dendríticas como uma leitura funcional na triagem imunomodulatória.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função das células dendríticas na captura de antígenos, migração e ativação de linfócitos T.
- Triagem: Permite a preparação padronizada de células dendríticas marcadas para triagem de compostos e caracterização de imunomoduladores.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de fluorescência e citometria de fluxo para comparar a maturação e ativação de células dendríticas em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o comportamento de células dendríticas in vitro com padrões de tráfego in vivo em modelos murinos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para marcação de células imunes, aplicável em diversos projetos de descoberta de imunoterapias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista nas respostas imunes mediadas por células dendríticas por meio de rastreamento estável e de longo prazo.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade entre laboratórios por meio de um protocolo padronizado de marcação e variabilidade mínima entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento de imunoterapias ao fornecer evidência visual direta do engajamento do alvo e do tráfego de células imunes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em perfis validados de modulação e migração de células dendríticas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células primárias, técnica estéril e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso a kits de marcação com Qdot, citômetros de fluxo e equipamento de criostato para corte de tecidos.
- Necessita padronização do tempo de diferenciação celular e da concentração de marcação entre diferentes usuários.
- A adaptação a modelos de células dendríticas humanas pode exigir otimização das condições de citocinas e da eficiência de marcação.
- As limitações práticas incluem a possível agregação dos Qdots em altas concentrações e a necessidade de titulação cuidadosa para evitar citotoxicidade.
