Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento
2 de junho de 2011
Dendríticas células antígenos captação e migrar para órgãos imunes a antígenos presentes processados às células T. Qdot nanocristais rotulagem fornece um sinal duradouro e estável fluorescente. Este permite o rastreamento de células dendríticas a diferentes órgãos, por microscopia fluorescente.
O objetivo geral deste procedimento é preparar células dendríticas para estudos de imagem usando nanocristais de pontos Q. Isso é feito isolando primeiro as células da medula óssea de murns, fêmures e tíbias. Em seguida, as culturas de células da medula óssea são configuradas para facilitar a diferenciação celular em células dendríticas na presença de GM CSF.
Em seguida, as células dendríticas são recuperadas das culturas de células da medula óssea após oito dias. A etapa final do procedimento é corar as células com nanocristais Q fluorescentes. Em última análise, as células dendríticas brilhantemente coradas podem ser visualizadas por microscopia de fluorescência.
A principal vantagem de usar essa tecnologia em comparação com outros métodos, como o uso de células dendríticas GFP, é que os nanocristais de ponto Q retêm sua fluorescência mesmo após a coloração com solventes orgânicos como a acetona. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biólogos de células dendríticas, como propriedades de migração dessas células em diferentes doenças ou no contexto de diferentes doenças. Demonstrando o procedimento de coloração estará Maria Ali, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Após o sacrifício, disseque cuidadosamente a tíbia e os fêmures de dois camundongos sem cortar as extremidades ósseas. Em seguida, use papel de seda para limpar todos os tecidos presos dos ossos, tomando cuidado para não quebrá-los. Em um capuz de biossegurança.
Encha uma placa de Petri de 35 milímetros com etanol a 70% e, em seguida, mergulhe os ossos no etanol por 10 minutos. Depois que os ossos forem esterilizados, recupere-os do etanol e deixe-os secar ao ar por cinco minutos em uma nova placa de Petri. Agora, corte o fêmur no meio e a tíbia pela ponta mais fina.
Infundir o interior dos ossos com um mililitro de meio RPMI usando uma seringa estéril. Recolha a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros e lave-a duas vezes com meio RPMI por centrifugação de 10 minutos a 300 vezes G a quatro graus Celsius em uma centrífuga com rotor de caçamba oscilante. Após a última lavagem, resus suspenda as células em dois mililitros de lise CK, tampone e incube por cinco minutos em temperatura ambiente para eliminar os glóbulos vermelhos.
Em seguida, adicione 13 mililitros de RPMI mais 10% FBS e lave as células mais duas vezes neste meio com as mesmas configurações de centrífuga de antes. Conte as células e ajuste a concentração para duas vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Com RPMI mais 10% FBS, adicione o murino recombinante G-M-C-S-F a uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro.
Em seguida, adicione 10 mililitros desta suspensão a uma placa de Petri de 10 centímetros de qualidade microbiológica estéril e cultura. A suspensão celular em uma incubadora de dióxido de carbono. Três dias depois, adicione mais 10 mililitros de RPMI mais 10% FBS com 20 nanogramas por mililitro de G-M-C-S-F murino recombinante a cada uma das placas preparadas.
Mais três dias depois, recupere 10 mililitros de suspensão celular de cada placa de Petri, centrifugue as células nas mesmas condições e ressuspenda o pellet no mesmo volume de RPMI mais 10% FBS recuperado das placas de Petri e reabasteça com novo murino recombinante G-M-C-S-F. Finalmente, retorne a suspensão celular para cada placa de Petri original e cultive as células por mais dois dias na incubadora de dióxido de carbono. Após oito dias em cultura, recuperar as células flutuantes e frouxamente aderentes lavando as placas de Petri com meio fresco.
Em seguida, rotule as células coletadas com o kit de rotulagem de células Q tracker 6 55 seguindo rigorosamente as instruções do fabricante para rotular cinco vezes 10 elevado ao sexto dos dcs derivados da medula óssea murina com nanocristais Q em uma concentração de 10 nano molares. Primeiro misture cinco microlitros de cada um dos componentes do kit A e B em um tubo einor e incube a mistura por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de RPMI mais 10% FBS e vórtice o tubo por 30 segundos.
Em seguida, adicione cinco vezes 10 ao quinto. Dcs suspenso em 0,5 mililitros de RPMI mais 10% FBS no tubo einor e incubar as células na solução D a 37 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, lave as células duas vezes em RPMI mais 10% FBS nas mesmas condições de antes e ressuspenda o pellet em RPMI.
Esta figura mostra um exemplo de uma microfotografia fluorescente de dcs. Imediatamente após a rotulagem, uma gota de células marcadas foi depositada em uma lâmina de vidro e coberta por uma lamínula. Em seguida, as amostras foram avaliadas em microscópio fluorescente.
Nesta figura, uma microfotografia fluorescente de dcs após 48 horas, maturação in vitro pode ser vista rotulada. Dcs foram cultivados por 48 horas com 100 nanogramas por mililitro, LPS e 20 nanogramas por mililitro, TNF alfa em câmaras de cultura de lâminas em uma incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, as amostras foram lavadas com PBS fixado com acetona, contracoloração com DPI e avaliadas em microscópio fluorescente.
DCS marcados amadurecidos in vitro foram analisados por citometria de fluxo Q células coradas com pontos dão um sinal forte no FL três canais Q do corado e não corado. As DCS foram adicionalmente coradas com anticorpos específicos contra marcadores de maturação, CD 86 e CD 40, e as células de controle do isotipo foram então analisadas por citometria de fluxo. Além disso, os níveis de IL seis e óxido nítrico foram determinados em sobrenadantes de DCS de coloração Q madura e controles.
Aqui, uma figura representativa de DCS marcada em um tecido dissecado é mostrada marcada. DCS maduros foram injetados por via intravenosa em camundongos C 57 pretos de seis. Três dias depois, os camundongos foram sacrificados e os baços foram coletados.
Congelamento instantâneo embebido em OCT e seções de oito mícrons foram preparados usando um criostato. As amostras foram então fixadas com acetona, contracoloração com DPI e avaliadas em microscópio fluorescente. Seguindo este procedimento.
Outros métodos, como pose de antígeno ou maturação com diferentes estímulos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a migração de células dendríticas em resposta a diferentes estímulos de maturação.
Visão Geral
Este estudo descreve um procedimento para o preparo de células dendríticas para imagem utilizando nanocristais Qdot. O método permite a visualização de células dendríticas por microscopia de fluorescência, fornecendo informações sobre suas propriedades de migração.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Microscopia de Fluorescência
Contexto
- As células dendríticas desempenham um papel crucial na resposta imune ao apresentar antígenos às células T.
- Os nanocristais Qdot oferecem um sinal fluorescente estável para o rastreamento de células.
- Este método aprimora o estudo do comportamento das células dendríticas em diversos contextos de doenças.
- Os métodos tradicionais podem não fornecer o mesmo nível de estabilidade da fluorescência.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para marcação de células dendríticas com nanocristais Qdot.
- Facilitar o rastreamento de células dendríticas in vivo.
- Explorar as propriedades de migração de células dendríticas em diferentes modelos de doenças.
Métodos Utilizados
- Isolamento de células da medula óssea de camundongos.
- Cultivo celular com GM-CSF para diferenciação em células dendríticas.
- Coloração de células dendríticas com nanocristais Qdot.
- Visualização utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.
Resultados Principais
- Células dendríticas rotuladas com sucesso exibiram sinais de fluorescência intensos.
- Demonstrou a estabilidade dos nanocristais Qdot em comparação com as marcas GFP.
- Visualizou a maturação e migração de células dendríticas in vitro e in vivo.
- Forneceram informações sobre os mecanismos de resposta imune envolvendo células dendríticas.
Conclusões
- A técnica de marcação com Qdot é eficaz para estudar a dinâmica das células dendríticas.
- Este método pode aprimorar a compreensão do comportamento das células dendríticas em diversas doenças.
- Estudos futuros podem utilizar esta abordagem para investigar diferentes estímulos de maturação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A marcação de células dendríticas com nanocristais Qdot permite fluorescência estável e de longa duração para o rastreamento da migração de células imunes em modelos pré-clínicos. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de imunoterapias, fornecendo visualização confiável da dinâmica de células apresentadoras de antígenos. O método aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, permitindo a observação direta do comportamento de células dendríticas em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das vias de migração e apresentação de antígenos por células dendríticas em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Fornece um marcador fluorescente estável que persiste após fixação e exposição a solventes, reduzindo a perda de sinal durante o processamento de tecidos.
- Valor Preditivo: Apoia a validação funcional de biológicos baseados em células dendríticas por meio do rastreamento da localização in vivo e do estado de maturação.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras de fluorescência quantificáveis para avaliar os estados de maturação e ativação de células dendríticas.
- Valor Operacional: Compatível com plataformas de citometria de fluxo e microscopia, permitindo triagem de alto conteúdo de compostos imunomoduladores.
- Prontidão do Ensaio: Produz lotes padronizados e marcados de células dendríticas adequados para ensaios reprodutíveis de perfil imunológico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o rastreamento da migração de células dendríticas de tecidos periféricos para órgãos linfoides, modelando a vigilância imunológica.
- Valor Operacional: Permite estudos de imagem longitudinal em modelos murinos para avaliar respostas imunes induzidas por vacinas ou adjuvantes.
- Continuidade Translacional: Apoia estudos alinhados a biomarcadores ao correlacionar a localização das células dendríticas com desfechos imunes funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao fluxo de trabalho de descoberta desde a validação inicial do alvo até o perfil imunológico pré-clínico, permitindo a visualização da dinâmica das células dendríticas como uma leitura funcional na triagem imunomodulatória.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função das células dendríticas na captura de antígenos, migração e ativação de linfócitos T.
- Triagem: Permite a preparação padronizada de células dendríticas marcadas para triagem de compostos e caracterização de imunomoduladores.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de fluorescência e citometria de fluxo para comparar a maturação e ativação de células dendríticas em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o comportamento de células dendríticas in vitro com padrões de tráfego in vivo em modelos murinos relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para marcação de células imunes, aplicável em diversos projetos de descoberta de imunoterapias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista nas respostas imunes mediadas por células dendríticas por meio de rastreamento estável e de longo prazo.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade entre laboratórios por meio de um protocolo padronizado de marcação e variabilidade mínima entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento de imunoterapias ao fornecer evidência visual direta do engajamento do alvo e do tráfego de células imunes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em perfis validados de modulação e migração de células dendríticas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células primárias, técnica estéril e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso a kits de marcação com Qdot, citômetros de fluxo e equipamento de criostato para corte de tecidos.
- Necessita padronização do tempo de diferenciação celular e da concentração de marcação entre diferentes usuários.
- A adaptação a modelos de células dendríticas humanas pode exigir otimização das condições de citocinas e da eficiência de marcação.
- As limitações práticas incluem a possível agregação dos Qdots em altas concentrações e a necessidade de titulação cuidadosa para evitar citotoxicidade.
