Determinação do nível de expressão da proteína em pilhas cultivadas por imunocitoquímica em blocos de parafina

O objetivo geral deste procedimento é analisar a expressão de marcadores de proliferação de interesse por meio de análises imunocitoquímicas e histológicas de aglomerados de tecido embebidos em blocos de células plasmáticas de tromboplastina. Este método pode ajudar a responder à questão-chave sobre a patologia clínica do bloqueio celular pelos tecidos. A principal vantagem deste método alternativo para análise imunocitoquímica de blocos celulares embebidos em parafina é a simplicidade técnica dos procedimentos.

Quando uma placa de 100 milímetros de cultura de células HeLa atingir a confluência, substitua o sobrenadante por 10 mililitros de meio de cultura de células HeLa sem FBS e retorne a placa à incubadora de cultura de células. Após 48 horas, lave as células com dois mililitros de PBS seguido de incubação em dois mililitros de 0,25% de EDTA mais tripsina por dois a três minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células se separarem, pare a reação com cinco mililitros de meio completo e transfira a solução celular para um tubo cônico de 15 mililitros.

Colete as células por centrifugação seguida de duas lavagens em dois mililitros de PBS frio por lavagem. Após a segunda lavagem, substitua o sobrenadante por um mililitro de etanol a 95% e misture o pellet por vórtice. Em seguida, coloque as células fixas no gelo.

Para preparar um bloco de células de parafina, após coletar plasma EDTA de sangue de doador saudável, centrifugue as amostras e transfira alíquotas de plasma sobrenadante de 200 a 400 microlitros para tubos de microcentrífugas individuais. Em seguida, adicione cerca de 200 microlitros de plasma, cerca de 200 microlitros de tromboplastina e cerca de 200 microlitros de cloreto de cálcio 025 molar às células HeLa fixadas. Deixar as misturas formarem coágulos celulares à temperatura ambiente durante dez minutos e, em seguida, lavar os coágulos duas vezes com um mililitro de PBS, decantando totalmente os coágulos em pedaços individuais de papel de filtro umedecido em formalina após a segunda lavagem.

Enrole os coágulos no papel de filtro e use um conjunto de alfinetes para colocar os panos em de tecido individuais no centro de quatro outros pedaços de papel umedecido com formalina. Em seguida, coloque os de tecido em potes de vidro contendo 50 mililitros de formalina tamponada para fixação noturna de formalina a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, coloque os em um processador de tecidos para remoção de água durante a noite e condicionamento de células fixas.

Pelo menos uma hora antes do final do procedimento de processamento, ligue uma estação de incorporação aquecida para derreter a parafina. Quando a estação de incorporação e o coágulo estiverem prontos, confirme a presença de parafina fundida no molde de metal e transfira um coágulo celular formado para a parafina. Coloque um novo de tecido sem a tampa no molde de metal e cubra o com mais parafina derretida.

Deixe a parafina solidificar em uma placa fria por 30 a 60 segundos. Em seguida, separe o de tecido do molde de metal. Para preparar seções para análise imunocitoquímica, localize o coágulo celular em um bloco de células de parafina e use um micrótomo para cortar o bloco em fatias de três a quatro micrômetros de espessura.

Coloque seções de parafina em lâminas de vidro revestidas com solução salina e coloque-as em um forno a 37 graus Celsius por 30 minutos. Quando os cortes tiverem aderido às lâminas, desparafinizar as lâminas em 15 mililitros de xileno por quatro minutos, seguido de desidratação dos cortes com incubações sequenciais de etanol descendente de dois minutos. Após a incubação de 80% de etanol, enxágue as seções em água corrente por 10 minutos e ferva as lâminas em uma jarra contendo 40 mililitros de tampão de recuperação de tris-EDTA por 30 minutos.

No final da incubação, lave as lâminas recuperadas do antígeno em água corrente, seguida de uma incubação de 10 minutos em etanol a 95% a quatro graus Celsius. Após a secagem ao ar, use uma caneta hidrofóbica para circundar a área de coloração celular em cada lâmina. Lave as lâminas em TBS-T seguido de incubação em bloco de peróxido de hidrogênio por 15 minutos em temperatura ambiente para remover qualquer atividade remanescente da peroxidase.

Lave as lâminas três vezes em TBS-T por dois minutos a cada lavagem e, em seguida, rotule as seções com 100 microlitros de mistura de anticorpos primários do kit de coloração imunocitoquímica de interesse por uma hora, seguida de cinco lavagens de TBS-T de dois minutos. Após a última lavagem, incubar as lâminas em intensificador de anticorpos primário do kit durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. No final da incubação, lave as seções quatro vezes em TBS-T adicionando cerca de 200 microlitros de anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano após a última lavagem para uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente.

Lave as seções aprimoradas cinco vezes em TBS-T fresco, seguido pela adição de 100 microlitros de solução de diaminobenzidina por seção por três minutos. Lave as lâminas duas vezes em TBS-T e rotule as seções com 100 microlitros de solução de hematoxilina por um minuto. Em seguida, lave as lâminas mais uma vez em TBS-T e incube as lâminas em etanol a 95% por dois minutos, seguido de um mergulho em etanol fresco a 95% e dois mergulhos em etanol a 100%.

Incubar as seções desidratadas com etanol em 40 mililitros de xileno em uma jarra de vidro por cinco minutos e deixar as lâminas secarem ao ar. Em seguida, monte uma lamínula em cada lâmina e observe as amostras sob um microscópio óptico. A coloração de hematoxilina e eosina do tecido embebido em parafina, como acabamos de demonstrar, revela principalmente núcleos de tato e citoplasma, sugerindo uma excelente preservação morfológica das amostras de células por este método.

Blocos de células mal preparados, no entanto, exibem uma morfologia pobre e rotulagem irregular, mesmo que as amostras sejam coradas adequadamente. A proteína dois associada ao citoesqueleto é tipicamente observada na cromatina condensada, no fuso mitótico e no citoplasma. Apenas as células com coloração da proteína dois associada ao citoesqueleto na cromatina condensada são células mitóticas, enquanto poucas células positivas da proteína dois associadas ao citoesqueleto são encontradas na população de cultura de células HeLa faminta por soro.

A maioria das células HeLa altamente mitóticas também são positivas para Ki-67 e a coloração Ki-67 é observada nos núcleos celulares. Apenas cerca de metade das células HeLa famintas de soro expressam esse marcador de proliferação. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de diluir as células para uma densidade apropriada para fazer um bom coágulo. Seguindo este procedimento, outro método, como a análise por citometria de fluxo das células fixas, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais sobre a fase do ciclo celular durante a sincronização. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para um futuro no campo da patologia hepática para explorar o perfil de expressão em linhagens celulares, preservando informações morfológicas em células cultivadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imunocitoquímica e preparar blocos de tromboplastina plasmática a partir das células cultivadas. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes perigosos como o xileno pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar luvas e jaleco devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.