Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

O objetivo geral deste experimento é determinar o número de subunidades em complexos proteicos homooligoméricos em lisados celulares utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio não desnaturante. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia celular, como o estado oligomérico de proteínas envolvidas em processos celulares essenciais. A principal vantagem desta técnica é que ela não exige a purificação dos complexos proteicos homooligoméricos nem equipamentos especializados e caros.

Portanto, pode ser realizado na maioria dos laboratórios. Este experimento utiliza dois tipos de células: células A549 que expressam a proteína Myxovirus resistance A endógena, ou MxA; e virocélulas que superexpressam MxA.

Semeie as células A549 e as virocélulas em placas de seis poços com dois mililitros de meio de crescimento por poço. Incube as células durante a noite em um incubador de cultura celular. No dia seguinte, colete as células.

Lave cada poço com um mililitro de PBS e desprenda as células adicionando 0,5 mililitros de solução de Tripsina-EDTA 0,25% por aproximadamente cinco minutos à temperatura ambiente. Assim que as células se desprenderem do recipiente, adicione 0,5 mililitros de meio de crescimento e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo. Transfira as células de cada poço para um tubo de dois mililitros e pelote-as utilizando uma centrífuga de bancada.

Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem sem perturbar o pellet celular. Lave as células adicionando um mililitro de PBS frio e pipetando suavemente a suspensão celular para cima e para baixo. Pelotize as células em uma centrífuga de bancada.

Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem sem destacar o pellet celular. Adicione 200 microlitros de tampão de lise gelado, ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo e, em seguida, coloque no gelo. Proteja imediatamente o lisado da luz cobrindo os tubos com papel-alumínio, pois a iodoacetamida no tampão de lise é sensível à luz.

Incube na gelo por 30 minutos. O uso de iodoacetamida é crucial porque a iodoacetamida protege de forma irreversível o grupo tiol de cisteínas livres, formando uma ligação tioéter, e evita a agregação proteica artificial. Em seguida, remova os detritos celulares por centrifugação em uma centrífuga de bancada pré-resfriada.

Durante a centrifugação, prepare colunas de diálise com corte de peso molecular de 10.000. Fixe as colunas de diálise a uma bóia flutuante e coloque-as em um béquer contendo tampão de diálise previamente resfriado para equilibrar as colunas. Não toque na membrana.

Coloque um agitador magnético em um béquer e transfira o béquer para a câmara fria. Usando o agitador magnético para garantir uma agitação suave, equilibre por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após 20 minutos, remova as colunas do tampão de diálise e da bóia flutuante.

Transfira os lisados clarificados para as colunas de diálise preparadas por pipetagem, sem tocar na membrana. Fixe as colunas a uma boia flutuante. Coloque-as novamente no béquer contendo tampão de diálise e, em seguida, transfira o béquer para a câmara fria.

Dialise o lisado por pelo menos quatro horas a quatro graus Celsius, agitando cuidadosamente com um agitador magnético para remover pequenos metabólitos e sais que poderiam interferir na eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Quando a diálise estiver concluída, transfira cada amostra dialisada para um tubo de 1,5 mililitro. Remova os precipitados por centrifugação em uma centrífuga de bancada.

A eletroforese deve ser realizada imediatamente após a diálise dos lisados para evitar a dissociação dos complexos proteicos oligoméricos. Encha as câmaras gel interna e externa com tampão de corrida pré-resfriado. Faça a pré-corrida do gel de poliacrilamida não desnaturante com tampão de corrida pré-resfriado a 25 miliampères por gel durante 15 minutos a quatro graus Celsius.

Misture 15 microlitros do lisado preparado com cinco microlitros de tampão amostral 4X. Carregue um padrão de proteína nativa de escolha e 15 microlitros da amostra no gel. Execute o gel a 25 miliampères por quatro horas a quatro graus Celsius.

Quando a eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante estiver concluída, desmonte o gel e transfira-o cuidadosamente para o tampão de SDS. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Prepare duas esponjas, quatro folhas de papel filtro de celulose e uma membrana de transferência para cada gel e mergulhe-as no tampão de transferência.

Monte o sanduíche na seguinte ordem, de baixo para cima: uma esponja, duas folhas de papel filtro de celulose, uma membrana de transferência, o gel, duas folhas de papel filtro de celulose e uma esponja. Coloque o sanduíche no tanque de eletrotransferência, certificando-se de que a membrana fique voltada para o polo positivo e o gel voltado para o polo negativo.

Encha o tanque de eletrotransferência com tampão de eletrotransferência pré-resfriado. Para obter os melhores resultados de transferência proteica, realize a eletrotransferência a 90 miliampères durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, desmonte o "sanduíche".

Incube a membrana na solução de Ponceau S por cinco minutos à temperatura ambiente para visualizar o padrão proteico. Desmarine a membrana colocando-a em água desionizada e lavando-a. Após transferir a membrana para uma bandeja, marque as bandas do padrão proteico usando uma caneta.

Bloqueie a membrana com o tampão de bloqueio por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Posteriormente, as proteínas de interesse são visualizadas por imunomarcação utilizando um anticorpo policlonal de coelho direcionado contra MxA conforme descrito no protocolo textual. Virocélulas que não possuem MxA endógena foram transfectadas com MxA do tipo selvagem recombinante e com variantes de MxA monomérica e dimérica.

A migração da variante recombinante MxA em seu peso molecular esperado confirmou seu estado oligomérico. A MxA do tipo selvagem expressa ectopicamente migrou como um tetrâmero. Essas proteínas recombinantes foram então utilizadas para avaliar o estado oligomérico da proteína MxA humana endógena derivada de células A549 estimuladas com interferon-alfa.

O resultado revelou que o tamanho da MxA em lisados de células A549 estimuladas com interferon-alfa corresponde a um tetrâmero. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia e meio, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não congelar e descongelar as amostras durante todo o procedimento, pois isso poderia destruir interações proteicas ou causar agregações proteicas.

Além disso, ao trabalhar com reagentes sensíveis à luz, como iodoacetamida, é importante proteger as amostras da luz durante a etapa de lise. Após a eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante, outros métodos como extração de proteínas em gel e atividade enzimática AsiS ou uma eletroforese bidimensional podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a atividade enzimática e a caracterização de possíveis complexos heterooligoméricos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia celular explorarem a composição de complexos proteicos oligoméricos em células cultivadas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar lisados celulares a partir de culturas celulares para estudar proteínas oligoméricas em análises de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Não se esqueça de que o trabalho com iodoacetamida pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de luvas e proteção ocular, devem sempre ser tomadas.