Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

O objetivo geral deste experimento é determinar o número de subunidades em complexos proteicos homooligoméricos em lisados celulares usando eletroforese em gel de dodecossulfato de sódio-poliacrilamida não desnaturante. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como o status oligomérico de proteínas envolvidas em processos celulares fundamentais. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer purificação dos complexos proteicos homooligoméricos ou equipamentos especializados e caros.

Portanto, pode ser realizado na maioria dos laboratórios. Este experimento utiliza dois tipos de células. Células A549 que expressam resistência endógena ao mixovírus A proteína, ou MxA; e virocélulas que superexpressam MxA.

Semeie as células A549 e as virocélulas em seis placas de poços com dois mililitros de meio de crescimento por poço. Incube as células durante a noite em uma incubadora de cultura de células. No dia seguinte, colha as células.

Lave cada poço com um mililitro de PBS e conecte as células adicionando 0,5 mililitros de solução de tripsina-EDTA a 0,25% por aproximadamente cinco minutos em temperatura ambiente. Assim que as células se desprenderem do prato, adicione 0,5 mililitros de meio de crescimento e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo. Transfira as células de cada poço para um tubo de dois mililitros e pelete-as usando uma centrífuga de mesa.

Remova cuidadosamente o sobrenadante pipetando sem perturbar o pellet celular. Lave as células adicionando um mililitro de PBS gelado e pipetando cuidadosamente a suspensão da célula para cima e para baixo. Pulverize as células em uma centrífuga de mesa.

Remova cuidadosamente o sobrenadante pipetando sem separar o pellet da célula. Adicione 200 microlitros de tampão de lise gelado, ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo e coloque no gelo. Proteger imediatamente o lisado da luz, cobrindo os tubos com papel alumínio, uma vez que a iodoacetamida no tampão de lise é sensível à luz.

Incube no gelo por 30 minutos. O uso de iodoacetamida é crucial porque a iodoacetamida protege irreversivelmente o grupo tiol de cisteínas livres, formando uma ligação tioéter e evitando a agregação artificial de proteínas. Em seguida, remova os detritos das células por centrifugação em uma centrífuga de mesa pré-resfriada.

Durante a centrifugação, preparar colunas de diálise com um limite de peso molecular de 10 000. Fixe as colunas de diálise a uma bóia flutuante e coloque-as num copo cheio de tampão de diálise pré-arrefecido para equilibrar as colunas. Não toque na membrana.

Coloque um agitador magnético em um copo e transfira o copo para a câmara fria. Usando o agitador magnético para garantir uma agitação suave, equilibre por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após 20 minutos, remova as colunas do tampão de diálise e da bóia flutuante.

Transferir os lisados limpos para as colunas de diálise preparadas pipetando sem tocar na membrana. Prenda as colunas a uma bóia flutuante. Coloque-os de volta no copo cheio de tampão de diálise e, em seguida, transfira o copo para a câmara fria.

Dialisar o lisado por pelo menos quatro horas a quatro graus Celsius, mexendo cuidadosamente com um agitador magnético para remover pequenos metabólitos e sais que possam interferir na eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Quando a diálise estiver concluída, transfira cada amostra dialisada para um tubo de 1,5 mililitro. Remover precipitados por centrifugação numa centrífuga de mesa.

A eletroforese deve ser realizada imediatamente após a diálise dos lisados para evitar a dissociação dos complexos proteicos oligoméricos. Encha a câmara de gel interna e externa com tampão de corrida pré-resfriado. Pré-execute o gel de poliacrilamida não desnaturante com tampão de corrida pré-resfriado a 25 miliamperes por gel por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Misture 15 microlitros do lisado preparado com cinco microlitros de tampão de amostra 4X. Carregue um padrão de proteína nativa de sua escolha e 15 microlitros de amostra no gel. Execute o gel a 25 miliamperes por quatro horas a quatro graus Celsius.

Quando a eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante estiver concluída, desmonte o gel e transfira cuidadosamente para o tampão SDS. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Prepare duas esponjas, quatro folhas de papel de filtro de celulose e uma membrana de blotting por gel e mergulhe-as em tampão de blotting.

Monte o sanduíche da seguinte maneira de baixo para cima. Uma esponja, duas folhas de papel de filtro de celulose, uma membrana de borrão, o gel, duas folhas de papel de filtro de celulose e uma esponja. Coloque o sanduíche no tanque de mancha, certificando-se de que a membrana esteja voltada para o pólo positivo, enquanto o gel está voltado para o pólo negativo.

Encha o tanque de mancha com tampão de mancha pré-resfriado. Para obter os melhores resultados de transferência de proteínas, seque a 90 miliamperes durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, desmonte o sanduíche.

Incube a membrana em solução de Ponceau S por cinco minutos em temperatura ambiente para visualizar o padrão de proteína. Destain a membrana colocando-a em água deionizada e lavando-a. Depois de transferir a membrana para uma bandeja, marque as bandas do padrão de proteína usando uma caneta.

Bloqueie a membrana com tampão de bloqueio por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Posteriormente, as proteínas de interesse são visualizadas por imunocoloração usando um anticorpo policlonal de coelho direcionado contra MxA, conforme descrito no protocolo de texto. Virocélulas sem MxA endógena foram transfectadas com MxA do tipo selvagem recombinante e variância de MxA monomérica e dimérica.

A migração da variância MxA recombinante em seu peso molecular esperado confirmou seu estado oligomérico. O tipo selvagem expresso ectopicamente MxA migrou como um tetrâmero. Essas proteínas recombinantes foram então usadas para avaliar o estado oligomérico da proteína MxA humana endógena derivada de células A549 estimuladas por interferon-alfa.

O resultado revelou que o tamanho de MxA em lisados de células A549 estimuladas por interferon-alfa corresponde a um tetrâmero. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia e meio se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não congelar e descongelar as amostras durante todo o procedimento, pois isso pode destruir as interações proteicas ou causar agregações de proteínas.

Além disso, ao trabalhar com reagentes sensíveis à luz, como a iodoacetamida, é importante proteger as amostras da luz durante a etapa de lise. Após o SDS-PAGE não desnaturante, outros métodos como extração de gel de proteína e atividade enzimática AsiS ou um PAGE de segunda dimensão podem ser realizados para responder a questões adicionais como atividade enzimática e caracterização de potenciais complexos hetero-oligoméricos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biologia celular explorarem a composição de complexos proteicos oligoméricos em células cultivadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar lisados celulares a partir de culturas de células para estudar proteínas oligoméricas na análise PAGE não desnaturante. Não se esqueça de que trabalhar com iodoacetamida pode ser extremamente perigoso e precauções como usar luvas e proteção para os olhos devem sempre ser tomadas.