Name: Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a caracterizar complexos proteicos oligoméricos em lisados celulares usando eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Este método acessível permite analisar a proteína MxA em células A549 sem necessidade de purificação.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência da Suíça (Grant nr. 31003A_143834) para JP.

NOTA: Este protocolo é baseado no não desnaturante protocolo de PAGE publicado anteriormente 12. Neste estudo, o estado oligomérico da proteína MxA foi avaliada utilizando quer de células Vero ou de células que sobre-expressam MxA A549 IFN-ct-estimuladas expressam MxA endógena. O protocolo abaixo descrito pode ser utilizado para analisar o estado oligomérico da proteína em qualquer além MxA. No entanto, uma maior optimização pode ser necessária. 1. Preparação de lisado celular para PAGE não desnaturante NOTA: Para analisar o estado oligomérico da proteína MxA humana tanto em células Vero ou A549, 1,0 x 10 6 células foram colhidas. Dependendo do tipo de célula ou a abundância da proteína a analisar, o número de células deve ser ajustado. É também importante para proteger o tampão de lise da exposição à luz, logo que a iodoacetamida sensível à luz é adicionado. <ol><li> Semente de 0,3 x 10 6 ou Vero A549 células por poço em6 bem-pratos. Manter as células em 2 ml de meio de crescimento por poço (ver Tabela 1). Incubar as células durante a noite numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Colher as células por lavagem com 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS) e separar por adição de 0,5 ml de 0,25% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 x solução durante aproximadamente 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Assim que as células destacar do prato, adicionar 0,5 ml de meio de crescimento e mistura-se cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo. </li><li> Transferir as células de cada poço para um tubo de 2 mL e o pellet-los usando uma centrifugadora de bancada (5000 x g, 4 ° C, 5 min). </li><li> remover cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem sem perturbar o sedimento celular. </li><li> Lavam-se as células com PBS, 1 ml de gelo-frio, pipetando cuidadosamente a suspensão de células para cima e para baixo. </li><li> células de pelotas em uma centrífuga de bancada (5.000 x g, 4 ° C, 5 min). </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem without separar o sedimento celular. </li><li> Ressuspender as células em 200 de tampão gelado lise ul (ver Tabela 1) por pipetagem cima e para baixo e colocar no gelo. </li><li> Imediatamente, proteger lisado proveniente de luz, cobrindo os tubos utilizando folha de alumínio e incubar durante 30 min em gelo. NOTA: Após a incubação durante 30 min em gelo, já não é essencial para proteger o lisado proveniente de exposição à luz, uma vez que a protecção dos grupos tiol livres é irreversível. </li><li> Remover os detritos celulares por centrifugação numa centrifugadora de bancada de pré-arrefecida (13000 xg, 4 ° C, 20 min). </li><li> Equilibrar colunas de diálise em tampão de diálise (Tabela 1) na câmara fria a 4 ° C durante 20 min durante o passo de centrifugação. Utilizar uma coluna com um peso molecular de corte de 10.000. <ol><li> Fixe as colunas a uma bóia flutuante e colocá-los num copo cheio com tampão de diálise. Para assegurar agitação suave, usar um agitador magnético. Não toque na membrana. NOTA: Dialysé colunas podem ser comprados ou preparados a partir de tubos de 1,5 ml de acordo com o protocolo descrito por Fiala e colegas de trabalho 19. </li></ol></li><li> Remover as colunas do tampão de diálise e a bóia flutuante. Transfira os lisados ​​límpidos para a coluna de diálise preparados por pipetagem sem tocar na membrana. Fixe as colunas a uma bóia flutuante e colocá-los de volta para o copo cheio com tampão de diálise. </li><li> Dialisar o lisado num copo contendo tampão de diálise gelada (Tabela 1) durante pelo menos 4 horas (durante a noite ou, de preferência), a 4 ° C enquanto agitando cuidadosamente utilizando um agitador magnético. Utilize pelo menos 100 ml de tampão de diálise por um ligado de 200 mL. </li><li> Transfira a amostra de dialisado para um tubo de 1,5 ml. Remover os precipitados por centrifugação numa centrífuga de bancada (13000 xg, 4 ° C, 20 min). Para evitar que a dissociação da proteína oligomérica complexos continuar com o protocolo (seção 2) imediatamente após a diálise. Não congeleos lisados ​​preparados. </li></ol> 2. Eletroforese NOTA: A electroforese foi realizada conforme descrito antes, com algumas modificações 22. No protocolo descrito abaixo, foram utilizados geles de gradiente pré-fundidos (4-15% gradiente). Alternativamente, os géis podem ser preparados em laboratório. É muito importante excluir qualquer agente desnaturante, como SDS para evitar a dissociação dos complexos de proteínas oligoméricas. Tempo de electroforese foi optimizada para diferentes estados oligoméricos da proteína MxA humano. No entanto, pode variar para outras proteínas, dependendo do tamanho do complexo oligomérico, bem como o intervalo de separação que é suposto ser alcançado para analisar o complexo. Portanto, o tempo óptimo de electroforese deve ser determinada empiricamente. Para melhor resolução dos oligómeros a ser analisado a corrente não deve ser superior a 25 mA. <ol><li> Montar o gel PAGE não-desnaturante em gel da câmara. Encha tele câmara interior e exterior com tampão de operação de pré-arrefecida (Tabela 1). </li><li> Pré-correr o gel com o tampão de corrida previamente arrefecido a 25 mA por gel durante 15 minutos numa câmara fria a 4 ° C. </li><li> Misturar 15 ul dos lisados preparados acima com 5 ul de tampão de amostra 4x (Tabela 1). Não ferva a amostra. </li><li> Carregar 15 ul de amostra e um padrão de proteína nativa de escolha no gel. Submeter o gel a 25 mA durante 4 horas na câmara fria a 4 ° C. NOTA: Para a análise semi-quantitativa de um protocolo de quantificação de proteínas (por exemplo, um ensaio de proteína de Bradford 23) pode ser realizada a fim de garantir um carregamento de quantidades iguais de proteína total por pista. </li></ol> 3. Western Blot NOTA: descrito abaixo é o protocolo de um sistema de transferência de western molhado. Qualquer membrana de mata-borrão pode ser usado. Ative fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas em 100% de metanol antes de equilíbrio no mata-borrão buffer. A técnica de Western blot semi-seco pode ser usado como alternativa, mas tem que ser optimizado para grandes complexos oligoméricos. <ol><li> Desmontar o gel e transferi-la cuidadosamente em tampão de SDS (Tabela 1). </li><li> Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente enquanto agitando suavemente. </li><li> Prepare 2 esponjas, 4 folhas de papel de filtro de celulose e uma membrana absorvente por gel. Mergulhe-os em tampão de transferência (Tabela 1). </li><li> Montar o sanduíche como se segue (de baixo para cima): uma esponja, duas folhas de papel de filtro de celulose, membranas, gel, duas folhas de papel de filtro de celulose, uma esponja. </li><li> Coloque o sanduíche para o tanque blotting. Certifique-se de que a membrana enfrenta o pólo positivo, enquanto o gel enfrenta o pólo negativo. </li><li> Encha o tanque mata-borrão com tampão de blotting pré-refrigerados. </li><li> Seque a 90 mA durante a noite a 4 ° C para obter os melhores resultados de transferência de proteínas. </li><li> Desmontar a sanduíche e visualizar o padrão de proteína, por incubação da membrana em Poncsolução eau S durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Destain a membrana com cuidado lavando fora do Ponceau S com água deionizada até que você pode ver claramente as bandas do padrão de proteína. </li><li> Marcar as bandas do padrão de proteína, usando uma caneta. NOTA: residual Ponceau S pode interferir com a imunocoloração. Para evitar isso, a membrana pode ser descorada adicional por incubação em NaOH 0,1 M durante 1 min e subsequente lavagem com água desionizada. </li><li> Bloquear a membrana com tampão de bloqueio (ver Tabela 1) durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Visualizar proteína (s) de interesse por imunocoloração utilizando anticorpos dirigidos contra a proteína a ser analisada. NOTA: A proteína humana MxA foi visualizada usando o anticorpo policlonal de coelho específico para Mx1 humano diluído 1: 1000 em tampão de bloqueio (Tabela 1). A solução de anticorpo foi incubada durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, o anticorpo monoclonal umnti-MxA anticorpo (clone 143) pode ser utilizada (dados não mostrados) 24. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Descrevemos aqui um método simples que permite a determinação rápida do estado oligomérico de proteínas expressas em células de mamíferos por PAGE não desnaturante seguido por análise Western Blot. A principal vantagem desta abordagem é que o estado oligomérico de uma dada proteína pode ser determinada a partir de lisados ​​de células inteiras sem purificação de proteína antes. Isto pode ser importante para proteínas que oligomerizar ou exercem a sua função em associação com factores auxiliares. Além disso, as proteínas...

A estrutura quaternária de uma proteína desempenha um papel crucial em muitos processos celulares. Vias de sinalização, a expressão do gene e enzima de activação / desactivação todos contam com a montagem adequada de complexos de proteínas 1-4. Este processo também conhecido como homo- ou hetero-oligomerização é devido à covalente irreversível ou interacções proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversíveis. A oligomerização não só diversifica os diferentes processos celulares sem aumentar o tamanho do genoma, mas também fornece uma estratégia para construir proteínas de complexos estáveis que são mais resistentes à desnaturação e degradação no sentido 5. Defeitos na oligomerização ter um impacto sobre a função de proteínas e pode levar ao desenvolvimento de doenças. Por exemplo, a enzima fenilalanina hidroxilase forma um complexo tetramérico. Algumas mutações dentro do complexo de proteína pode enfraquecer a formação tetrâmero e conduzir à doença fenilcetonúria 6. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A proteína MxA humano é um interferão (IFN) induzida por proteína efectora antiviral exercendo uma ampla actividade antiviral contra diversos ARN, bem como vírus de ADN 7. Ela pertence à superfamília de grandes GTPases dinamina semelhante e tem a capacidade para formar grandes estruturas oligoméricas 8 in vitro. A oligomerização tem sido sugerido para proteger da degradação rápida MxA 9,10. Apesar dos intensos esforços por vários grupos de pesquisa, o mecanismo molecular de ação permanece difícil e o papel do estado de oligomerização de MxA para a sua função antiviral está em debate 9,11,12. A este respeito, Gao e colegas propuseram um modelo onde MxA exerce a sua actividade antiviral, interagindo com nucleoproteínas virais em forma de grandes estruturas oligoméricas em forma de anel 11. No entanto, mais recentemente, demonstrou-se que os dímeros MXA exibem actividade antiviral e interagir com a nucleoproteína do vírus influenza A 12. Bduziu sobre a estrutura de cristal de MxA, Gao e colaboradores identificaram vários resíduos de aminoácidos nas regiões de interface que são críticos para a sua oligomerização in vitro e a sua função antiviral 11,13. Portanto, a fim de elucidar qual oligomérica estado de MxA exerce atividade antiviral, procurou-se estabelecer um protocolo simples para determinar rapidamente o estado oligmeric de mutantes de interface MXA expressos em células humanas, bem como endógena MxA expressa após a estimulação IFN. Embora existam muitas técnicas que são comumente usados para investigar a interação entre proteínas, tais como a proteína split-Verde Fluorescente (split-GFP) ensaio de complementação 14, ressonância de plasma de superfície 15 e Förster transferência de energia de ressonância (FRET) 16, eles não fornecem informações da estequiometria exacta de um complexo de proteína oligomérica. Para a investigação deste aspecto particular, tal como técnicasmulti-ângulo de espalhamento de luz (MALS) 17 e 18 de ultracentrifugação analítica são muito úteis. Geralmente, as proteínas analisadas usando estes métodos são proteínas purificadas. processos de oligomerização pode também depender de outros fatores celulares. Se estes factores são desconhecidas, a análise é mais difícil. Além disso, algumas proteínas são difíceis de expressar em E. coli e de purificar. Por conseguinte, estes métodos não são a escolha óptima para analisar a oligomerização de proteínas no meio celular. Além disso, essas técnicas exigem instrumentos dispendiosos que não estão facilmente disponíveis. Não electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE), cromatografia de exclusão por tamanho ou por reticulação química convencional seguido de dodecil sulfato de sódio (SDS) -Página são ferramentas úteis para a caracterização da formação de oligómeros a partir de lisados de células 2,19,20. Estes métodos não requerem equipamento especializado e podem ser facilmente PErformed num laboratório padrão. Nós inicialmente avaliados vários protocolos químicos de reticulação que invariavelmente levaram a agregação e precipitação de MxA não específica. Portanto, o próximo testados protocolos PRINCIPAL não desnaturante. Como não-PAGE desnaturante exclui a utilização de SDS, a migração das proteínas depende da sua carga nativa. PAGE nativa utiliza-Azul de Coomassie G250 azul brilhante para carregar proteínas com uma carga global negativa, semelhante a SDS, mas não desnaturar a proteína de 21. Infelizmente, precipitados coomassie azul brilhante na presença de altas sais e catiões divalentes (por exemplo, Mg 2+) que são muitas vezes incluídos em tampões de lise. Dependendo dos tampões utilizados, pode ser difícil de analisar a amostra sem mais passos de optimização que podem ter um efeito sobre o complexo de proteína oligomérica. Aqui é apresentado um protocolo simples baseado num método anteriormente publicado em 22 para determinar de oligomerizaçãoproteína MxA humana derivada a partir de lisados ​​celulares usando não desnaturante PAGE.

<table><tbody><tr><td>Unidades de Diálise Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Pré-equilíbrio em tampão de diálise (se a remoção de Glicerol for desejada) Pode ser feito por conta própria de acordo com Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados, 10 poços,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Pré-corrida em buffer de corrida para ajustar o sistema de buffer</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, livre de EDTA</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>use 1 comprimido por 50 ml</td></tr><tr><td>de PBS, pH 7.4&nbsp; garrafa de 500 ml Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Solução Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>TOXIC use luvas e proteja os olhos</td></tr><tr><td>Padrão de Proteína Não Manchada NativeMark&nbsp; 50 &micro; l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>carga 5 &micro; células</td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>Crescem em meio de crescimento (ver Tabela 1)</td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>Crescem em meio de crescimento (ver anticorpo anti-Mx1 Tabela 1)</td></tr><tr><td>anti-Mx1</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>Use em uma diluição de 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL Anti-rabbit IgG, anticorpo inteiro ligado à peroxidase de rábano (de burro)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Use a uma diluição de 1:10.000</td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA (1x)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida&nbsp; &nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>estoque&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen&nbsp; Estreptococos 100 x&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Stock, 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, Dialisado, Origem US 500 ml Lote Gibco:42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro de celulose</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF blotting&nbsp; membrana</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>fluoreto de sódio (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS solução a 10%</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>ortovanadato de sódio (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Glicerophospate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó</td><td>Migros/Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de magnésio (MgCl2)</td> <td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sódio (NaOH)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando mxa não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

A formação de complexos oligoméricos é um pré-requisito crucial para a estrutura e função adequadas de muitas proteínas. A proteína efetora antiviral induzida por interferon MxA exerce uma ampla atividade antiviral contra muitos vírus. MxA é uma GTPase semelhante à dinamina e tem a capacidade de formar estruturas oligoméricas de ordem superior. No entanto, se a oligomerização de MxA é necessária para sua atividade antiviral é uma questão de debate. Descrevemos aqui um protocolo simples para avaliar o estado oligomérico de MxA expressa endogena ou ectopicamente na fração citoplasmática de linhagens celulares humanas por eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante (PAGE) em combinação com análise de Western blot. Uma etapa crítica do protocolo é a escolha de detergentes para evitar a agregação e/ou precipitação de proteínas particularmente associadas a membranas celulares como MxA, sem interferir em sua atividade enzimática. Outro aspecto crucial do protocolo é a proteção irreversível dos grupos tióis livres de resíduos de cisteína pela iodoacetamida para evitar interações artificiais da proteína. Este protocolo é adequado para uma avaliação simples do estado oligomérico de MxA e, além disso, permite uma correlação direta da atividade antiviral dos mutantes da interface MxA com seus respectivos estados oligoméricos.

Usando não-PAGE desnaturante, analisou-se o estado oligomérico do tipo selvagem humana MxA, os mutantes diméricas de interface MxA (R640A) e MxA (L617D), bem como o mutante de interface monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares 12. As células foram lisadas num tampão contendo 1% de octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) e iodoacetamida para assegurar a solubilização da proteína e a protecção dos grupos tiol livres (ver Figura 1). Conforme descrito antes, sal e pequenos metabólitos fora...

Este artigo descreve um protocolo simples e rápido para avaliar o estado oligomérico da proteína GTPase MxA semelhante à dinamina de lisados de células humanas usando uma combinação de PAGE não desnaturante com análise de western blot.

Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

O objetivo geral deste experimento é determinar o número de subunidades em complexos proteicos homooligoméricos em lisados celulares utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio não desnaturante. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia celular, como o estado oligomérico de proteínas envolvidas em processos celulares essenciais. A principal vantagem desta técnica é que ela não exige a purificação dos complexos proteicos homooligoméricos nem equipamentos especializados e caros.Portanto, pode ser realizado na maioria dos laboratórios. Este experimento utiliza dois tipos de células: células A549 que expressam a proteína Myxovirus resistance A endógena, ou MxA; e virocélulas que superexpressam MxA.Semeie as células A549 e as virocélulas em placas de seis poços com dois mililitros de meio de crescimento por poço. Incube as células durante a noite em um incubador de cultura celular. No dia seguinte, colete as células.Lave cada poço com um mililitro de PBS e desprenda as células adicionando 0,5 mililitros de solução de Tripsina-EDTA 0,25% por aproximadamente cinco minutos à temperatura ambiente. Assim que as células se desprenderem do recipiente, adicione 0,5 mililitros de meio de crescimento e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo. Transfira as células de cada poço para um tubo de dois mililitros e pelote-as utilizando uma centrífuga de bancada.Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem sem perturbar o pellet celular. Lave as células adicionando um mililitro de PBS frio e pipetando suavemente a suspensão celular para cima e para baixo. Pelotize as células em uma centrífuga de bancada.Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem sem destacar o pellet celular. Adicione 200 microlitros de tampão de lise gelado, ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo e, em seguida, coloque no gelo. Proteja imediatamente o lisado da luz cobrindo os tubos com papel-alumínio, pois a iodoacetamida no tampão de lise é sensível à luz.Incube na gelo por 30 minutos. O uso de iodoacetamida é crucial porque a iodoacetamida protege de forma irreversível o grupo tiol de cisteínas livres, formando uma ligação tioéter, e evita a agregação proteica artificial. Em seguida, remova os detritos celulares por centrifugação em uma centrífuga de bancada pré-resfriada.Durante a centrifugação, prepare colunas de diálise com corte de peso molecular de 10.000. Fixe as colunas de diálise a uma bóia flutuante e coloque-as em um béquer contendo tampão de diálise previamente resfriado para equilibrar as colunas. Não toque na membrana.Coloque um agitador magnético em um béquer e transfira o béquer para a câmara fria. Usando o agitador magnético para garantir uma agitação suave, equilibre por 20 minutos a quatro graus Celsius. Após 20 minutos, remova as colunas do tampão de diálise e da bóia flutuante.Transfira os lisados clarificados para as colunas de diálise preparadas por pipetagem, sem tocar na membrana. Fixe as colunas a uma boia flutuante. Coloque-as novamente no béquer contendo tampão de diálise e, em seguida, transfira o béquer para a câmara fria.Dialise o lisado por pelo menos quatro horas a quatro graus Celsius, agitando cuidadosamente com um agitador magnético para remover pequenos metabólitos e sais que poderiam interferir na eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Quando a diálise estiver concluída, transfira cada amostra dialisada para um tubo de 1,5 mililitro. Remova os precipitados por centrifugação em uma centrífuga de bancada.A eletroforese deve ser realizada imediatamente após a diálise dos lisados para evitar a dissociação dos complexos proteicos oligoméricos. Encha as câmaras gel interna e externa com tampão de corrida pré-resfriado. Faça a pré-corrida do gel de poliacrilamida não desnaturante com tampão de corrida pré-resfriado a 25 miliampères por gel durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Misture 15 microlitros do lisado preparado com cinco microlitros de tampão amostral 4X. Carregue um padrão de proteína nativa de escolha e 15 microlitros da amostra no gel. Execute o gel a 25 miliampères por quatro horas a quatro graus Celsius.Quando a eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante estiver concluída, desmonte o gel e transfira-o cuidadosamente para o tampão de SDS. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Prepare duas esponjas, quatro folhas de papel filtro de celulose e uma membrana de transferência para cada gel e mergulhe-as no tampão de transferência.Monte o sanduíche na seguinte ordem, de baixo para cima: uma esponja, duas folhas de papel filtro de celulose, uma membrana de transferência, o gel, duas folhas de papel filtro de celulose e uma esponja. Coloque o sanduíche no tanque de eletrotransferência, certificando-se de que a membrana fique voltada para o polo positivo e o gel voltado para o polo negativo.Encha o tanque de eletrotransferência com tampão de eletrotransferência pré-resfriado. Para obter os melhores resultados de transferência proteica, realize a eletrotransferência a 90 miliampères durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, desmonte o "sanduíche".Incube a membrana na solução de Ponceau S por cinco minutos à temperatura ambiente para visualizar o padrão proteico. Desmarine a membrana colocando-a em água desionizada e lavando-a. Após transferir a membrana para uma bandeja, marque as bandas do padrão proteico usando uma caneta.Bloqueie a membrana com o tamp&atilde;o de bloqueio por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Posteriormente, as prote&iacute;nas de interesse s&atilde;o visualizadas por imunomarca&ccedil;&atilde;o utilizando um anticorpo policlonal de coelho direcionado contra MxA conforme descrito no protocolo textual. Viroc&eacute;lulas que n&atilde;o possuem MxA end&oacute;gena foram transfectadas com MxA do tipo selvagem recombinante e com variantes de MxA monom&eacute;rica e dim&eacute;rica.A migração da variante recombinante MxA em seu peso molecular esperado confirmou seu estado oligomérico. A MxA do tipo selvagem expressa ectopicamente migrou como um tetrâmero. Essas proteínas recombinantes foram então utilizadas para avaliar o estado oligomérico da proteína MxA humana endógena derivada de células A549 estimuladas com interferon-alfa.O resultado revelou que o tamanho da MxA em lisados de células A549 estimuladas com interferon-alfa corresponde a um tetrâmero. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia e meio, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não congelar e descongelar as amostras durante todo o procedimento, pois isso poderia destruir interações proteicas ou causar agregações proteicas.Além disso, ao trabalhar com reagentes sensíveis à luz, como iodoacetamida, é importante proteger as amostras da luz durante a etapa de lise. Após a eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante, outros métodos como extração de proteínas em gel e atividade enzimática AsiS ou uma eletroforese bidimensional podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a atividade enzimática e a caracterização de possíveis complexos heterooligoméricos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia celular explorarem a composição de complexos proteicos oligoméricos em células cultivadas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar lisados celulares a partir de culturas celulares para estudar proteínas oligoméricas em análises de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Não se esqueça de que o trabalho com iodoacetamida pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de luvas e proteção ocular, devem sempre ser tomadas.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Este vídeo demonstra uma técnica de separação desnaturante baseada em poliacrilamida para proteínas. Essa técnica auxilia na identificação preliminar de proteínas com base em seus pesos moleculares.

Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio para análise de proteínas: uma técnica para separar e visualizar proteínas com base no peso molecular

Este vídeo descreve o PAGE multimérico para separar complexos de proteínas nativas de homogeneizados de tecidos. A técnica é um híbrido das técnicas PAGE e SDS-PAGE nativas azuis. Os complexos separados podem ser caracterizados e estudados por seu papel no funcionamento celular.

Multimer-PAGE para separação de complexos de proteínas nativas: uma técnica de separação híbrida que consiste em Blue Native-PAGE e SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas do lisado tecidual

Neste vídeo, demonstramos um método de eletroforese em gel bidimensional que separa proteínas individuais de uma mistura complexa de proteínas obtida de tecidos tumorais de adenoma hipofisário humano não funcional (NFPA). As proteínas são separadas com base em sua carga elétrica na primeira dimensão e posteriormente separadas com base em pesos moleculares na segunda dimensão.

Eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional: uma técnica de separação para análise de proteínas em mistura de proteínas complexas com base na carga e no peso molecular

Mucinas são glicoconjugados de alto peso molecular, com tamanho variando de 0,2 a 200 megadalton (MDa). Como resultado de seu tamanho, as mucinas não penetram nos géis convencionais de poliacrilamida e requerem poros maiores para separação. Fornecemos um protocolo detalhado para eletroforese em gel de mucina agarose para avaliar a quantificação relativa e estudar a montagem do polímero.

Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

Um protocolo para a elucidação da planta tilacoides proteína complexa organização e composição com poliacrilamida nativa azul gel eletroforese (BN-página) e 2D-SDS-PAGE é descrito. O protocolo é otimizado para a Arabidopsis thaliana, , mas pode ser usado para outras espécies de plantas com pequenas modificações.

Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Este protocolo descreve a combinação de cromatografia de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiangulares (SEC-MALS) para caracterização absoluta de proteínas e complexos em solução. SEC-MALS determina o peso molecular e o tamanho de proteínas puras, oligomers nativos, heterocomplexos e proteínas modificadas como glicoproteínas.

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Aprenda a caracterizar complexos proteicos oligoméricos em lisados celulares usando eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante. Este método acessível permite analisar a proteína MxA em células A549 sem necessidade de purificação.

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Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

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