Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

O objetivo geral desta técnica é usar o isolamento imunomagnético para selecionar oligodendrócitos O4 positivos de filhotes de camundongos recém-nascidos para sua análise de cultura in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ciência neural relacionadas ao estudo de doenças que afetam a mielina e a mielinização. A principal vantagem desta técnica é que ela facilita a preparação da cultura final de oligodendrócitos com pureza superior a 80% em cerca de horas-hora.

Comece usando uma pequena tesoura de dissecação para cortar a pele ao longo da linha média do couro cabeludo de um camundongo do quinto ao sétimo dia pós-natal. Retraia a aba de pele para expor o crânio e corte-o cuidadosamente ao longo da linha média, desde a abertura nas costas até a área frontal. A partir da abertura na parte de trás do crânio, corte em direção a cada órbita ocular ao longo da base do osso e use uma pinça fina para afastar suavemente os córtices do mesencéfalo.

Em seguida, transfira os córtices para uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros contendo sete mililitros de meio B-27 Neurobasal A. Quando todos os cérebros tiverem sido coletados, transfira os córtices para uma nova placa de cultura de tecidos de 60 milímetros contendo cinco mililitros de tampão de dissociação e use uma lâmina de bisturi número 15 para cortar os córtices em pedaços de um milímetro cúbico. Incube os pedaços de cérebro em uma incubadora de 37 graus Celsius 5% CO2 por 20 minutos.

Em seguida, adicione um mililitro de Soro de Crescimento Bovino para interromper a reação enzimática. Usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, transfira a pasta de tecido para um tubo cônico de 15 mililitros e dissocie suavemente o tecido cerebral de seis a oito vezes com pipetagem. Deixe os pedaços de tecido dissociados assentarem por dois a três minutos.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, adicione três mililitros de meio Neurobasal A, suplementado com soro de crescimento bovino e DNase I aos tecidos, e use uma pipeta de cinco mililitros para dissociar suavemente os tecidos com mais pipetagem. Veja bem, a força de pipetagem apropriada é crucial para garantir um alto rendimento de células viáveis.

Se a pipetagem for muito difícil, a viabilidade pode ser baixa. Considerando que, se a pipetagem for muito suave, o rendimento celular pode ser baixo. Deixe os pedaços de tecido assentarem por mais dois a três minutos.

Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo e adicione três mililitros de meio Neurobasal A fresco, suplementado com soro de crescimento bovino e DNase I ao tecido. Dissocie suavemente o tecido cerebral com uma ponta de pipeta P-1000 até que não haja um grande pedaço de tecido, tomando cuidado para evitar bolhas. Use uma pipeta de 10 mililitros para filtrar a solução celular através de um filtro de células de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros e traga o volume final da suspensão de célula única para 30 mililitros com meio Neurobasal A fresco, suplementado com soro de crescimento bovino e DNase I. Divida a suspensão celular em dois tubos cônicos de 15 mililitros, e peletizar as células neurais por centrifugação.

Remova todos, exceto os últimos cinco a 10 microlitros de sobrenadante turvo e adicione três mililitros de meio neurobasal A suplementado com soro de crescimento bovino às células. Ressuspenda cuidadosamente o pellet de células e aumente o volume final para 15 mililitros com meio Neurobasal A fresco contendo 10% de soro de crescimento bovino. Filtre a solução celular através de um filtro de células de 40 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros e aumente o volume final para 30 mililitros com meio Neurobasal A fresco contendo 10% de soro de crescimento bovino.

Em seguida, divida a suspensão de células filtradas entre dois tubos cônicos de 15 mililitros para centrifugação. e ressuspenda os pellets em 2,5 mililitros de tampão de classificação de células magnéticas geladas antes de agrupar as células. Após a contagem, centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em 90 microlitros de tampão de classificação de células magnéticas fresco por um vezes 10 para as sete células.

Em seguida, adicione 10 microlitros de contas anti-04 por um vezes 10 às sete células e misture a solução celular com movimentos suaves. Após 15 minutos a quatro graus Celsius com um movimento suave a cada cinco minutos, adicione suavemente dois mililitros de tampão de classificação de células magnéticas por um vezes 10 às sete células para uma lavagem por centrifugação e descarte o sobrenadante por aspiração cuidadosa a vácuo. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de classificação de células magnéticas fresco para cada uma vezes 10 a sete células e coloque uma coluna de classificação de esferas magnéticas de tamanho apropriado em seu separador magnético correspondente.

Coloque um filtro de 40 mícrons na coluna e pré-enxágue o filtro com três mililitros de tampão de classificação de células magnéticas, deixando o amortecedor passar pela coluna sem deixar a coluna secar. Adicione as células ao filtro, seguido por uma lavagem de um mililitro com o tampão magnético de classificação de células. Lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de classificação de células magnéticas por lavagem e uma vez com meio de proliferação de oligodendrócitos.

Em seguida, transfira a coluna para um tubo de 15 mililitros e use o êmbolo para lavar imediatamente cinco mililitros de meio de proliferação de oligodendrócitos fresco através da coluna. Após a contagem, dilua as células até uma densidade de revestimento apropriada e substitua a laminina de lamínulas pré-revestidas em uma placa de 24 poços com 100 microlitros de meio de proliferação de oligodendrócitos. Incube os oligodendrócitos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por não mais de 45 minutos para promover a adesão dos oligodendrócitos às lamínulas.

Em seguida, inunde cada poço da placa de 24 poços com 500 microlitros de meio de proliferação de oligodendrócitos para uma incubação de 24 horas. No dia seguinte, substitua os sobrenadantes por meio de diferenciação de oligodendrócitos e devolva as células à incubadora até que estejam prontas para fixação. 24 horas após o plaqueamento, as células parecem ser bi ou tripolares sob microscopia de contraste de fase, uma característica do oligodendrócito proliferante em estágio inicial.

A coloração por imunofluorescência mostra que 24 horas após o plaqueamento, a maioria desses pré-oligodendrócitos também demonstra marcação de NG2 e O4, enquanto a marcação com GFAP e anticorpo anti-01 é muito menos comum, sugerindo que a maioria das células neste estágio são pré-oligodendrócitos com poucos oligodendrócitos imaturos ou maduros. Às 72 horas, a morfologia dos oligodendrócitos parece ser mais complexa do que às 24 horas, e há uma frequência muito menor de células positivas para o marcador inicial de oligodendrócitos, NG2. Além disso, a maioria das células demonstra marcação de O4, e quase metade das células coradas para 01 anticorpo nesta fase, sugerindo que as células estão se diferenciando em um fenótipo mais maduro.

Notavelmente, a presença de astrócitos permanece extremamente baixa. Esses resultados indicam que, ao longo do tempo, os oligodendrócitos imunomagneticamente isolados são capazes de se diferenciar in vitro no Estágio Três de maturação com muito pouca contaminação de outros tipos de células, como os astrócitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar oligodendrócitos primários de filhotes de camundongos neonatais usando isolamento imunomagnético.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro horas, se for executada corretamente. Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.