Name: Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprenda dois métodos de descelularização de tecidos vegetais para engenharia de tecidos usando Ficus hispida. Essas técnicas preservam a matriz extracelular e criam arcabouços com excelente capacidade de transferência de fluidos.

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Gostaríamos de agradecer a John Wirth dos jardins Olbrich para fornecer graciosamente as amostras utilizadas neste projeto. Este trabalho é apoiado em parte pela nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue (R01HL115282 a G.R.G.) Fundação Nacional de ciência (DGE1144804 J.R.G e G.R.G.) e o departamento de cirurgia da Universidade de Wisconsin e fundo Alumni (H.D.L.). Este trabalho também foi financiado em parte pela Agência de protecção ambiental (grant estrela n. º 83573701), o National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 e UH3TR000506) e o National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

1. decellularization do tecido de planta usando a abordagem baseada em detergente
<ol><li>
Use o fresco ou congelado F. hispida, amostras de folha. Congele não utilizadas amostras frescas em uma loja para uso futuro (até um ano) e congelador-20 ° C. Nota: Use tecido de tronco ou folha de quase qualquer planta desejada. Tempos de armazenagem prolongada podem causar danos aos tecidos.<ol>
<li>Determinar o tamanho e a forma de amostras a ser processados com base na utilização do exemplo (ou seja, amostras cortadas em tiras são adequadas para aplicações de testes mecânicas, entretanto, amostras de disco de 8 mm são úteis em aplicações de cultivo multi bem ). Corte a folha em discos de 8 mm com uma biópsia afiada, limpa soco enquanto submerso sob temperatura ambiente (20-25 ° C) água deionizada H2O. Nota: Este protocolo pode ser usado em caules e folhas de toda. No entanto, as amostras menores serão decellularize mais rápido.</li>
		<li>Incube as amostras durante 5-10 min à temperatura ambiente (20-25 ° C) água deionizada H2O em um conjunto de placa de agitação para uma configuração de baixa velocidade para lavar e/ou descongelá-los. Uso bastante água deionizada H2O para garantir que todas as amostras são completamente molhadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar uma solução de 10% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em desionizada H2O. lugar as amostras em um recipiente adequado (um copo ou prato plástico é ideal) e adicione solução de SDS para cobrir completamente as amostras. Incube as amostras por 5 dias em temperatura ambiente (20-25 ° C) em um conjunto de placa de agitar a baixa velocidade para evitar danos às amostras. Nota: Não sobrecarregar o contêiner como isso pode retardar o processo de decellularization e levar a um tratamento desigual por SDS. Durante esta etapa, as amostras devem adquirir uma tonalidade marrom.<ol>
<li>Depois de 5 dias, substitua a solução de SDS desionizada H2O. Incubar as amostras para um adicional 10-15 min na placa de agitação para enxaguar fora qualquer solução residual de SDS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare um tensoativo não-iônico de 1% (v/v) em solução 10% (v/v). Para fazer uma solução de 500 mL, misturar 5 mL de tensoativo não-iônico com 50 mL de água sanitária, em seguida, adicionar 445 mL de deionizada H2O. submergir amostras em solução recentemente preparada. Nota: A solução de tensoativo não-iônico/água sanitária não tem uma vida útil longa, portanto, deve ser usado dentro de 48 h de preparação.</li>
	<li>
Substitua a solução de tensoativo não-iônico/lixívia cada 24h até as amostras são completamente desmarcadas (consulte a figura 1A , para comparação visual). Então incube a amostra em água desionizada num prato de agitar por 2 min para enxaguar a excesso tensoativo não-iônico/lixívia solução. Coloque a placa de agitação para um baixo ajuste para não danificar as amostras. Nota: O tempo necessário para limpar as amostras utilizadas varia, dependendo do tipo e da espécie da planta. A descoloração completa das amostras é indicativo de decellularization completo (realizar a quantificação de DNA para garantir a limpeza completa).<ol>
<li>Lyophilize as amostras para armazená-los até um ano (flash congelamento com nitrogênio líquido é preferencial, congelar as amostras em-80 ° C também é aceitável) e armazená-los em temperatura ambiente (20-25 ° C) em baixa umidade.</li>
		<li>Reconstituir as amostras em Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) usando o suficiente para amostras de casaco. Lave as amostras 2 - 3 vezes em media serum-free suavemente utilizando uma micropipeta antes do uso (ou seja, uso de 150-300 µ l por enxágue, em um prato bem 24 padrão). Nota: Tampão Tris-HCl e media serum-free (ou seja, DMEM, mas qualquer célula básica cultura mídia pode ser substituída) é mais eficaz na redução do impacto de viabilidade celular das amostras de SDS tratada do que aqueles tratados com desionizada H2O sozinho.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação das amostras usando a abordagem de Decellularization livre de detergente
Nota: Os passos iniciais deste procedimento coincidem com passos 1.1-1.1.2 (veja acima).
<ol><li>Prepare uma lixívia 5% (v/v) (NaClO) e solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) de 3% (p/v). Aquecer a solução em uma coifa para 60-70 ° C para amostras de folha de F. hispida cortado em discos de 8 mm, agitando um prato quente. Nota: O bicarbonato de sódio pode ser substituído com carbonato de sódio (Na2CO3), ou hidróxido de sódio (NaOH). A temperatura varia muito (de temperatura de 90 ° C) e deve ser ajustada de acordo com as propriedades das amostras utilizadas.</li>
	<li>Uma vez que a solução atinja a temperatura desejada, mergulhe as amostras e reduzir a velocidade de agita para evitar danificá-los. Depois que as amostras são visivelmente limpas (consulte a figura 1B para comparação visual), retirar do banho com cuidado. Incube amostras uma vez em desionizada H2O para 1-2 min remover a solução de água sanitária em excesso. Nota: O tempo necessário para limpar as amostras pode variar amplamente. Por exemplo, corte de salsa pode ser cancelada em 10-15 min, enquanto amostras mais espessas e/ou maiores como todo folhas ou caules podem demorar horas em banhos de alta temperatura para limpar completamente.</li>
	<li>Lyophilize as amostras e armazená-los em temperatura ambiente (20-25 ° C) em baixa umidade.</li>
</ol>

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<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aligned+nanofibrous+collagen+scaffold+by+electrospinning+and+its+effects+on+in+vitro+fibroblast+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, dois métodos de decellularize de tecidos vegetais são descritos. Os resultados apresentados aqui, juntamente com os resultados de estudos prévios25, sugerem que os protocolos apresentados são prováveis aplicável a um amplo espectro de espécies de plantas e podem ser executadas em ambos os caules e folhas. Estes procedimentos são simples e não requer equipamento especializado, então decellularization de planta pode ser realizada na maioria dos laboratórios. Vale ressaltar que, após a decellul...

Engenharia de tecidos surgiu na década de 1980 para criar tecidos vivos substitutos e potencialmente endereço importantes órgãos e tecidos escassez1. Uma estratégia tem andaimes usados para estimular e orientar o corpo para regenerar tecidos ou órgãos. Embora avançado abordagens de fabricação, tais como impressão 3-d produziram andaimes com propriedades físicas originais, a capacidade de fabricar andaimes com uma variada gama de propriedades físicas e biológicas realizáveis permanece um desafio2 , 3. Além disso, devido à falta de uma rede vascular funcional, estas técnicas têm sido limitadas em regenerar tecidos 3-dimensional. A utilização de tecidos animais e humanos decellularized como andaimes tem auxiliado em contornar este problema,4,5,6,7. No entanto, custo elevado, lotes de variabilidade e disponibilidade limitada podem limitar a utilização generalizada de animal decellularized moldes8. Também existem preocupações sobre a transmissão de doença potencial aos pacientes e uma reação imunológica de alguns tecidos de mamíferos decellularized9.
Celulose, derivada da planta e fontes bacterianas, tem sido extensivamente usado para gerar biomateriais para uma ampla gama de aplicações na medicina regenerativa. Alguns exemplos incluem: osso10,11, cartilagem12,13,14 e15de cicatrização de feridas. Andaimes que são compostas de celulose têm um benefício adicional em que eles são duráveis e resistentes a ser discriminadas em células de mamíferos. Isto é devido ao fato de que células de mamíferos não produz as enzimas necessárias para quebrar as moléculas de celulose. Em comparação, andaimes produziram usando macromoléculas da matriz extracelular, como o colágeno, são facilmente quebrados16 em podem não ser adequados para aplicações de longo prazo. Andaimes de colágeno podem ser estabilizadas por químicos do cross-linking. No entanto, há um trade-off devido a toxicidade inerente dos cross-linkers que afetam a biocompatibilidade dos andaimes17. Por outro lado, a celulose tem o potencial de permanecem presentes no local da implantação por períodos prolongados de tempo porque é impermeável à degradação enzimática por pilhas mamíferas18,19,20. Isto pode ser alterado por meio do ajuste da taxa de degradação através de pré-tratamento de hidrólise e co entrega dos andaimes com cellulases21. A biocompatibilidade de celulose de origem vegetal decellularized andaimes na vivo também foi demonstrada em um estudo feito em ratos22.
Através de centenas de milhões de anos de evolução, as plantas refinaram sua estrutura e composição para aumentar a eficiência do transporte de fluidos e retenção. Planta vasculares vasos minimizam resistência hidráulica, ramificando em vasos menores, semelhantes da vasculatura mamíferos de acordo com Murray lei23. Depois da decellularization, complexa rede da planta de vasos e poros interconectados é mantida. Tendo em conta o vasto número de espécies de plantas distintas prontamente disponíveis, andaimes de origem vegetal têm potencial para superar as limitações de projeto atualmente afetando andaimes em tecido engenharia24,25. Por exemplo, Modulevsky et al demonstraram que angiogênese e célula de migração ocorreu quando apple decellularized tecido foi implantado por via subcutânea na parte de trás de um rato de22. Da mesma forma, Gershlak et al mostrou que as células endoteliais poderiam ser crescidas dentro da vasculatura de folhas decellularized24. Em um experimento separado, Gershlak et al também foram capazes de mostrar que cardiomyocytes poderiam ser cultivadas na superfície das folhas e foram capazes de contrato24.
Plantas também incluem a organização complexa do celular à escala macroscópica, que é difícil de alcançar, mesmo com as mais avançadas técnicas de fabricação desenvolvidas até à data. A complexa concepção hierárquica de tecidos vegetais torna-los mais forte do que a soma dos seus constituintes,26. Plantas possuem uma infinidade de propriedades mecânicas diferentes, que vão desde componentes rígidos e duros como hastes, para os muito mais flexíveis e maleáveis, tais como folhas de27. Folhas variam dependendo da espécie em termos de tamanho, forma, quebrar a força, o grau de vascularização e podem levar a diferentes graus de Hidrofilia. Em geral, essas propriedades da planta sugerem que plantas decellularized podem servir como únicos e altamente funcionais de dispositivos médicos, incluindo como andaimes de engenharia de tecidos.
Este protocolo centra-se em dois métodos de decellularize de tecidos vegetais, tais como folhas e caules, para utilização como andaimes em engenharia de tecidos. O primeiro método é uma técnica baseada em detergente que usa uma série de banhos para retirar DNA e matéria celular, que foi adaptada de uma técnica amplamente utilizada decellularize mamíferos e vegetais tecidos6,22,25 ,28,29,30. O segundo método é livre de detergente e é uma adaptação de um protocolo de "esqueletonização", geralmente usado para remover os tecidos moles de folhas31. Trabalhos anteriores mostraram que ferver as folhas em uma solução de água sanitária e bicarbonato de sódio facilitou a separação da vasculatura do tecido mole circundante31. Esta técnica pode ser citada para experiências realizadas nodia 17 e18 séculos, tais como o trabalho de Albertus Seba32 e Edward Parrish33 . Estas experiências centradas em torno de deixando matéria vegetal, como folhas e frutos, submersos em água por longos períodos de tempo (semanas ou meses) e permitindo que os tecidos mais macios à deterioração embora naturalmente. Aqui, a abordagem de "esqueletonização" é adaptada para usar condições mais leves, tais como tempos de incubação mais longos a temperaturas mais baixas, para remover resíduos celulares e para não perturbar significativamente a estrutura de tecido mole. Para os experimentos detalhados neste documento, foram utilizados três tipos de plantas: Ficus hispida, Pachira aquatica e uma espécie de Garcinia. Resultados de DNA quantificação, ensaios mecânicos e impacto sobre a atividade metabólica celular de ambos os métodos são descritos.

<table><tbody><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma Life Science</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>807426</td><td>Surfactante não iônico referenciado em papel. Reagente muito viscoso, pode ajudar a cortar a ponta da pipeta ao retirá-la.</td></tr><tr><td>Alvejante concentrado (hipoclorito de sódio a 8,25%)</td> <td>Clorox</td><td>Item #: 31009</td><td>Alvejante concentrado padrão.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Acros Organics</td><td>217120010</td><td>Pode ser substituído por hidróxido de sódio ou carbonato de sódio.</td></tr><tr><td>8 mm Biopunch</td><td>HealthLink</td><td>15111-80</td><td>Corta amostras que se encaixam bem em placa de 24 poços</td></tr><tr><td>Mesa Belly Dancer-Shake</td><td>Stovall Life Sciences</td><td>BDRAA115S</td><td>Use baixas velocidades para não danificar os tecidos. Pode usar qualquer modelo/marca de mesa vibratória.</td></tr><tr><td>Placa quente/agitadora Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pode usar qualquer estilo/marca de placa quente/agitada.</td></tr><tr><td>Copo</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Pode usar qualquer tamanho de copo, desde que caiba em suas amostras e não as superlote.</td></tr><tr><td>Hidrocloro Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT50003PC</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA ensaio</td><td>Life Technologies</td><td>P11496</td><td>Pode usar qualquer método de quantificação de dsDNA disponível.</td></tr></tbody></table>

dois métodos para decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Os enxertos autólogos, sintéticos e derivados de animais usados atualmente como andaimes para substituição de tecido têm limitações devido à baixa disponibilidade, pobre biocompatibilidade e custo. Tecidos vegetais têm características favoráveis que as tornam excepcionalmente adequado para usar como andaimes, tais como elevada área superficial, transporte de água excelente e retenção, porosidade interconectada, preexistente redes vasculares e uma vasta gama de mecânica Propriedades. Dois métodos bem sucedidos de decellularization planta para aplicações de engenharia de tecido são descritos aqui. O primeiro método é baseado em banhos de detergente para remover matéria celular, que é semelhante aos métodos estabelecidos anteriormente usados para limpar tecidos de mamíferos. O segundo é um método livre de detergente, adaptado de um protocolo que isola a vasculatura de folha e envolve o uso de uma lixívia aquecida e o banho de sal para limpar as folhas e caules. Ambos os métodos produzem andaimes com propriedades mecânicas comparáveis e baixo impacto metabólico celular, permitindo que o usuário selecione o protocolo que melhor se adapte às sua aplicação pretendida.

Ambos os métodos renderam andaimes que foram adequados para a cultura de células e tecidos, aplicações de engenharia. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho geral do processo de decellularization, usando uma folha intacta para o método baseado em detergente e cortadas amostras (8 mm de diâmetro) para o método livre de detergente. Decellularization bem sucedido dos tecidos Ficus hispida , ambos os métodos a seguir rendeu amostras claras e intactas (<st...

Aqui apresentamos, e contraste dois protocolos usados para decellularize de tecidos vegetais: uma abordagem baseada em detergente e uma abordagem livre de detergente. Ambos os métodos deixam a matriz extracelular dos tecidos da planta utilizada, que pode então ser utilizada como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.

Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Esses métodos podem ajudar a abordar questões-chave no campo de biomateriais, como o desenvolvimento de um andaime com excelentes capacidades de transferência de fluidos com ultraestruturas sofisticadas e fabricação escalável. A principal vantagem dessas técnicas é que elas podem ser aplicadas à maioria das plantas para tecidos do caule sem a necessidade de equipamentos especializados. Primeiro, colete amostras frescas ou congeladas de folhas de F.hispida.Armazene qualquer amostra fresca restante a menos 20 graus Celsius para uso futuro. Deixe a folha permanecer emersa em água deionizada a 20 a 25 graus Celsius. Use um punção de biópsia limpa para cortar a folha em discos de oito milímetros de diâmetro.Em seguida, para lavar as amostras de folhas, incube-as em uma placa vibratória em baixa velocidade por cinco a 10 minutos, imersas em água deionizada. Em seguida, prepare 10% em peso por volume de SDS em água deionizada. Depois de preparar a solução SDS, coloque as amostras de folhas em um prato de plástico.Em seguida, adicione a solução SDS para cobrir completamente as amostras. Coloque as amostras de folhas emersas SDS, cobertas, em uma placa vibratória para evitar a evaporação. E

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Decelularização perfusão é uma nova técnica para produzir scaffolds fígado inteiro que mantém a composição do órgão matriz extracelular e microarquitetura. Aqui, o método de preparação de andaimes órgão inteiro usando decelularização perfusão e repovoamento posterior com hepatócitos é descrito. Enxertos de fígado para transplante funcional e pode ser gerado usando esta técnica.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

Um método para rápida e completamente remover componentes celulares a partir de um coração porcino intacta através da perfusão retrógrada é descrito. Este método produz um sítio específico cardíaco matriz extracelular andaime que tem o potencial para uso em várias aplicações clínicas.

Procedimento para decelularização do Coração Suínos por perfusão coronariana retrógrada

O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas.

A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Aqui, descrevemos um protocolo para o decellularization de veia safena, usando detergentes e recellularization por perfusão de sangue periférico e o médio endotelial.

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Esse método permite a decellularization de um órgão complexo sólido usando um protocolo simples baseado em choque osmotic e perfusão de detergente iônico com o mínimo de órgão matriz de interrupção. É composto por uma técnica de novela decellularization para corações humanos dentro uma bolsa pressurizada com monitoramento em tempo real da saída de detritos de celular e dinâmica de fluxo.

Decellularization do coração humana dentro de uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida

Este protocolo introduz um método para desenvolver um andaime usando rins descelularizados. O protocolo inclui processos de descelularização e recelularização para confirmar a biodisponibilidade. A descelularização é realizada utilizando-se triton X-100 e sulfato de dodecyl de sódio.

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O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Neste estudo, detalhamos métodos de decelularização, caracterização física, imageamento e implantação in vivo de biomateriais de base vegetal, bem como métodos de semeadura e diferenciação celular nos scaffolds. Os métodos descritos permitem a avaliação de biomateriais de origem vegetal para aplicações em engenharia de tecido ósseo.

Scaffolds Decelularizados Derivados de Maçã para Engenharia de Tecido Ósseo In Vitro e In Vivo

Aprenda dois métodos de descelularização de tecidos vegetais para engenharia de tecidos usando Ficus hispida. Essas técnicas preservam a matriz extracelular e criam arcabouços com excelente capacidade de transferência de fluidos.

Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

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