Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos
31 de maio de 2018
Aqui apresentamos, e contraste dois protocolos usados para decellularize de tecidos vegetais: uma abordagem baseada em detergente e uma abordagem livre de detergente. Ambos os métodos deixam a matriz extracelular dos tecidos da planta utilizada, que pode então ser utilizada como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.
Esses métodos podem ajudar a abordar questões-chave no campo de biomateriais, como o desenvolvimento de um andaime com excelentes capacidades de transferência de fluidos com ultraestruturas sofisticadas e fabricação escalável. A principal vantagem dessas técnicas é que elas podem ser aplicadas à maioria das plantas para tecidos do caule sem a necessidade de equipamentos especializados. Primeiro, colete amostras frescas ou congeladas de folhas de F.hispida.
Armazene qualquer amostra fresca restante a menos 20 graus Celsius para uso futuro. Deixe a folha permanecer emersa em água deionizada a 20 a 25 graus Celsius. Use um punção de biópsia limpa para cortar a folha em discos de oito milímetros de diâmetro.
Em seguida, para lavar as amostras de folhas, incube-as em uma placa vibratória em baixa velocidade por cinco a 10 minutos, imersas em água deionizada. Em seguida, prepare 10% em peso por volume de SDS em água deionizada. Depois de preparar a solução SDS, coloque as amostras de folhas em um prato de plástico.
Em seguida, adicione a solução SDS para cobrir completamente as amostras. Coloque as amostras de folhas emersas SDS, cobertas, em uma placa vibratória para evitar a evaporação. Em seguida, incube a amostra de folhas em temperatura ambiente por cinco dias.
Após cinco dias de incubação, substitua a solução de SDS por água deionizada. Incubar as amostras embebidas em água deionizada durante 10 a 15 minutos numa placa vibratória. Em seguida, misture cinco mililitros de surfactante não iônico com 50 mililitros de alvejante.
Adicione esta mistura a 445 mililitros de água deionizada. Em seguida, mergulhe as amostras na solução de alvejante surfactante não iônico recém-preparada. Continue trocando a solução de alvejante surfactante não iônico a cada 24 horas até que as amostras sejam limpas.
Em seguida, deixar as amostras limpas emersas em água desionizada durante dois minutos numa placa vibratória. Para descelularização sem detergente, prepare alvejante a cinco por cento volume por volume em solução de bicarbonato de sódio a 3% em peso por volume. Em seguida, aqueça a solução a 60 a 70 graus Celsius em uma placa quente dentro de uma capela de exaustão.
Assim que a solução atingir a temperatura desejada, molhe as amostras de folhas. Em seguida, reduza a velocidade da placa de agitação para evitar danificar as amostras e procure as amostras visivelmente limpas e transfira-as do banho com cuidado. Por fim, incubar as amostras em água deionizada durante um a dois minutos.
Como todas as amostras são intrinsecamente diferentes, é recomendável verificar o progresso da descelularização aproximadamente a cada 15 minutos para garantir que as amostras não estejam sendo danificadas. Os parâmetros MTM, SAF e UTS são estudados primeiro para investigar as propriedades únicas de andaimes descelularizados das espécies de P.aquatica e F.hispida. De fato, todos os três parâmetros exibem propriedades mecânicas semelhantes usando os métodos de descelularização à base de detergente e sem detergente.
No entanto, a propriedade mecânica UTS de F. hispida mostra um valor médio significativamente maior usando SDS em vez de alvejante para descelularização. O conteúdo de DNA genômico das espécies de plantas desmatadas estudadas também é significativamente reduzido após a descelularização quando comparado às amostras não descelularizadas. Em seguida, a atividade metabólica dos tireoblastos dérmicos humanos também é medida na presença de scaffolds descelularizados de P. aquatica ou Garcinia.
Curiosamente, os andaimes à base de detergente provocaram um impacto reduzido na atividade metabólica celular, mas a lavagem com tampão trishidroclorido, seguido de meio sem soro após a limpeza do SDS, diminui o impacto na atividade metabólica celular quando comparado à lavagem apenas com água deionizada. Finalmente, o crescimento das células-tronco mesenquimais coradas com calcina na superfície da estrutura foliar de F. hispida é mostrado aqui. Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser concluídas de cerca de sete dias a apenas 15 minutos quando executadas corretamente.
Ao realizar esses procedimentos, é importante lembrar de monitorar as amostras à medida que elas se descelularizam, pois as amostras podem variar de lote para lote, o que pode resultar em diferentes tempos de limpeza. Após este procedimento, outros métodos, como desquantificação ou testes mecânicos, podem ser aplicados para responder a perguntas adicionais, como até que ponto as amostras são limpas e com quais outros tecidos as amostras são mecanicamente semelhantes. Após seu desenvolvimento, essa técnica ajudou a pavimentar o caminho para pesquisadores no campo da engenharia de tecidos fabricarem andaimes perfusíveis.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como descelularizar tecidos vegetais para uso como andaimes. Não se esqueça de que trabalhar com detergentes e vapores de alvejante pode ser perigoso e precauções como usar equipamentos de proteção adequados e usar um exaustor devem sempre ser tomadas durante a execução desses procedimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta e compara dois protocolos para descelularização de tecidos vegetais: uma abordagem baseada em detergente e uma abordagem sem detergente. Ambos os métodos preservam a matriz extracelular, que pode servir como scaffolds para aplicações em engenharia de tecidos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biomateriais
- Engenharia de Tecidos
- Biologia Vegetal
Fundamento
- Técnicas de descelularização são cruciais para criar scaffolds.
- Scaffolds podem melhorar as capacidades de transferência de fluidos.
- Métodos podem ser aplicados a vários tecidos de caules de plantas.
- Não é necessário equipamento especializado para essas técnicas.
Objetivo do Estudo
- Comparar métodos de descelularização baseados em detergente e sem detergente.
- Avaliar o potencial das matrizes extracelulares vegetais como scaffolds.
- Abordar desafios no desenvolvimento de scaffolds para engenharia de tecidos.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de folhas frescas ou congeladas de F.hispida.
- Armazenamento das amostras a -20 graus Celsius.
- Imersão das folhas em água desionizada a 20 a 25 graus Celsius.
- Corte das folhas em discos de oito milímetros de diâmetro usando um punção de biópsia.
Principais Resultados
- Ambos os métodos de descelularização preservam efetivamente a matriz extracelular.
- Os scaffolds criados podem ser utilizados em várias aplicações de engenharia de tecidos.
- As capacidades de transferência de fluidos dos scaffolds foram melhoradas.
- Os métodos são escaláveis e aplicáveis à maioria das espécies de plantas.
Conclusões
- Técnicas de descelularização fornecem scaffolds viáveis para engenharia de tecidos.
- Ambos os métodos têm vantagens distintas e podem ser escolhidos com base em necessidades específicas.
- Pesquisas futuras podem explorar aplicações adicionais de scaffolds derivados de plantas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
