Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas
July 27th, 2018
Aqui, descrevemos um protocolo para o decellularization de veia safena, usando detergentes e recellularization por perfusão de sangue periférico e o médio endotelial.
Este método explica um procedimento detalhado para a engenharia de tecidos da veia safena. Também demonstramos a preparação de configurações de descelularização e biorreator para recelularização usando aparelhos simples. A principal vantagem dessa técnica é que uma simples amostra de sangue é necessária para a recelularização, eliminando assim a coleta dolorosa da medula óssea e os demorados procedimentos de cultura de células.
Para perfusão e lavagem do Triton-X 100, prepare a configuração de descelularização um. Em uma câmara de dois litros, cole todos os três pedaços de tubo A.Cole um tubo na parede onde a borda toca o fundo da câmara para a entrada do detergente. Prenda os outros dois tubos na parede oposta com uma distância de cinco a 10 centímetros entre eles, dependendo do comprimento da veia.
Pelo menos cinco centímetros desses tubos também devem ser colados no chão da câmara. Conecte o tubo de entrada do detergente ao tubo B usando os conectores de isca macho e fêmea. Em seguida, conecte o tubo B ao tubo F e o tubo F ao tubo C. Conecte o tubo C à entrada da veia.
Agora, coloque o tubo F no da bomba peristáltica. Pegue outro tubo C e conecte uma extremidade à saída da veia. Coloque a outra extremidade em uma jarra de vidro equipada com uma saída de mangueira inferior e posicionada 45 centímetros acima da câmara e prenda-a com fita adesiva.
Isso serve como saída de detergente. Em seguida, empurre uma extremidade do tubo G na saída da mangueira do frasco de vidro e coloque a outra extremidade na câmara das veias. Em seguida, prepare a configuração de descelularização dois para perfusão de TnBP, conforme detalhado no protocolo de texto.
Prepare também a configuração de descelularização três para a perfusão do DNA, conforme detalhado no texto, e coloque-a a 37 graus Celsius. Para preparar o biorreator de recelularização, insira o tubo H em uma porta de uma tampa de quatro portas para servir como saída da veia. Na segunda porta, insira o tubo I para servir como entrada de mídia.
E na terceira porta, insira o tubo J para a entrada da veia. Em seguida, insira a outra extremidade do tubo H na quarta porta para servir como meio de comunicação. Conecte os conectores redutores às extremidades internas dos tubos H e J. Dobre a outra extremidade do tubo J em forma de U e amarre-o com uma sutura.
Agora, coloque um tubo de 60 mililitros com uma base plana em um copo de 250 mililitros. Em seguida, conecte uma extremidade do tubo K à entrada da veia e conecte a outra extremidade ao tubo E.Conecte o tubo E a um segundo tubo K e, em seguida, à entrada do meio. Em seguida, coloque a configuração da tampa preparada no tubo presente na garrafa.
Finalmente, esterilize o biorreator por autoclavagem. Execute dois ciclos de congelamento e descongelamento em uma veia safena humana, conforme detalhado no protocolo de texto, antes de cortar uma biópsia de dois milímetros de comprimento com uma tesoura. Fixe a biópsia em formaldeído por 24 a 48 horas em temperatura ambiente.
Amarre cada extremidade da veia às farpas de um conector de isca macho e fêmea com uma sutura. Conecte a veia à configuração de descelularização um e encha a câmara com um litro da solução dois. Agora, perfunda por 15 minutos a 35 mililitros por minuto e esvazie o conteúdo da configuração.
Em seguida, adicione um litro de solução quatro e perfunda por quatro horas a 35 mililitros por minuto. Esvazie o conteúdo, adicione 500 mililitros da solução dois, perfunda por cinco minutos e esvazie novamente o conteúdo. Desconecte a veia da configuração de perfusão um e conecte-a à configuração de perfusão dois.
Em seguida, adicione um litro da solução cinco, ligue o agitador e perfunda por quatro horas a 35 mililitros por minuto. Desconecte a veia da configuração de perfusão dois e lave a parte externa da veia duas vezes com 20 mililitros de água ultrapura. Em seguida, use uma seringa para lavar o interior da veia duas vezes com 20 mililitros de água ultrapura por cinco a 10 minutos.
Após a perfusão com a configuração de perfusão três, conforme descrito no protocolo de texto, conecte a veia à configuração de perfusão um. Encha um litro da solução dois e perfunda durante a noite a 35 mililitros por minuto. Repita o processo de perfusão quatro vezes para remover completamente o material nuclear.
Após a perfusão, esvazie a configuração, encha um litro da solução dois e perfunda por 24 horas a 35 mililitros por minuto. Após 24 horas, esvazie a configuração novamente e encha com um litro de água ultrapura. Perfunda por mais 24 horas a 35 mililitros por minuto.
Por fim, repita a perfusão nas mesmas condições, mas com a solução sete. Após a verificação da descelularização conforme descrito no protocolo de texto, esterilizar a veia colocando-a em um tubo de 50 mililitros contendo 50 mililitros da solução oito. Agite a 80 rotações por minuto em uma coqueteleira por uma hora a 37 graus Celsius.
Trabalhando em um gabinete de fluxo laminar para manter a esterilidade, agora use uma pinça estéril para transferir a veia estéril para um novo tubo de 50 mililitros contendo 50 mililitros de solução estéril sete, contendo 500 microlitros de anti anti. Agite a veia como antes por 12 horas, trocando a solução sete pelo menos duas vezes entre elas. Usando uma pinça estéril, transfira a veia para um novo tubo de 50 mililitros, adicione 50 mililitros de meio endotelial e agite por 11 horas.
Agora, conecte a veia amarrando-a à entrada e saída da veia do biorreator com sutura e pinça estéreis e aperte a configuração da tampa ao frasco de 250 mililitros. Encha o biorreator com o mesmo meio endotelial. Adicione heparina a 50 unidades por mililitro e perfunda por uma hora a dois mililitros por minuto na incubadora.
Colete 15 a 25 mililitros de sangue fresco do doador em tubos vacutainer revestidos com heparina e dilua-o um a um com solução de steen. Mais tarde, adicione o fator de crescimento endotelial vascular derivado da glândula endócrina, o fator de crescimento fibroblástico básico e um ácido salicílico sutil. Depois de esvaziar o meio endotelial do biorreator, adicione o sangue a ele e perfunda por 48 horas a dois mililitros por minuto em uma incubadora a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono.
Aproximadamente 12 horas depois, trabalhe no gabinete de fluxo laminar para remover uma gota de sangue do biorreator e medir a glicose usando um dispositivo de monitoramento de glicose no sangue. Se o nível for inferior a três milimoles por litro, adicione glicose para colocá-lo na faixa de sete a nove milimoles por litro. Após 48 horas de volta à incubadora, drene o sangue do biorreator no gabinete de fluxo laminar.
Adicione 30 mililitros de solução estéril sete, perfunda por cinco minutos e escorra a solução. Repita esse processo até que a cor vermelho-sangue seja perdida. Por fim, adicione 30 a 45 mililitros de meio endotelial e perfunda por 96 horas na incubadora a dois mililitros por minuto.
Desconecte a veia recelularizada do biorreator no gabinete de fluxo laminar, corte as bordas de cinco milímetros da veia usando uma tesoura e descarte. Faça uma biópsia como antes, coloque em formaldeído e realize a verificação da recelularização conforme descrito no protocolo de texto. A morfologia macroscópica de uma veia normal parece vermelha brilhante.
A cor vermelha é perdida em ciclos progressivos de descelularização e, após cinco ciclos de tratamento, parece pálida e branca. A veia recelularizada por perfusão de sangue periférico e meio endotelial novamente parecia vermelha brilhante. Aqui é mostrada uma imagem representativa de coloração de hemotaxilina e eosina de veia normal mostrando a presença de muitos núcleos azuis.
No entanto, núcleos azuis não foram observados na coloração de hemotaxilina e eosina da veia descelularizada. Na veia recelularizada perfundida com sangue e meio endotelial, a coloração de hemotaxilina e eosina mostrou a presença de fixação celular no lúmen. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar a descelularização da veia safena por detergentes e a recelularização com sangue periférico e meio endotelial.
Esta técnica de descelularização usando perfusão de Triton-X 100, TnBP e DNA's sob pressão foi bem-sucedida e reprodutível na remoção de núcleos de veias safenas humanas. Embora essa técnica leve 20 dias para ser concluída, armazenar a veia descelularizada como um produto pós-prateleira diminuirá o tempo do procedimento para oito dias. A recelularização das veias usando o sangue periférico do receptor pode ser considerada clinicamente relevante.
As veias recelularizadas com protocolo semelhante mostraram-se promissoras no transplante clínico, fornecendo um suprimento sanguíneo funcional após a operação. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser usado para qualquer tipo de veia e como enxerto personalizado em clínicas para todas as cirurgias vasculares.
Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo detalhado para a descelularização da veia safena utilizando detergentes e sua subsequente recelularização através da perfusão com sangue periférico e meio endotelial. O método simplifica o processo utilizando uma simples amostra de sangue, evitando assim procedimentos mais invasivos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de Tecidos
- Medicina Regenerativa
- Biologia Vascular
Fundo
- A descelularização é crucial para a criação de scaffolds na engenharia de tecidos.
- Métodos tradicionais frequentemente requerem técnicas complexas de cultura celular.
- O uso de amostras de sangue para recelularização pode reduzir o desconforto do paciente.
- Meios endoteriais desempenham um papel significativo na regeneração de tecidos vasculares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simples para a descelularização da veia safena.
- Facilitar a recelularização usando amostras de sangue facilmente obtidas.
- Aprimorar a eficiência das técnicas de engenharia de tecidos.
Métodos Utilizados
- Preparação de configurações de descelularização usando Triton-X 100 e outras soluções.
- Uso de um biorreator para o processo de recelularização.
- Técnicas de perfusão para garantir uma descelularização completa e subsequente semeadura celular.
- Monitoramento dos níveis de glicose para avaliar a viabilidade do tecido recelularizado.
Principais Resultados
- O protocolo descelularizou com sucesso a veia safena.
- A recelularização com sangue e meios endoteriais foi alcançada.
- O monitoramento da glicose indicou atividade metabólica no tecido recelularizado.
- O método provou ser eficiente e menos invasivo em comparação com técnicas tradicionais.
Conclusões
- Este protocolo oferece uma alternativa viável para a engenharia de tecidos vasculares.
- O uso de amostras de sangue simplifica o processo de recelularização.
- O método tem potenciais aplicações na medicina regenerativa.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Decellularization and recellularization of human saphenous veins enable the generation of patient-specific vascular grafts, reducing reliance on allogeneic or synthetic conduits that carry risks of immunosuppression and poor patency. This approach supports predictive confidence in graft functionality by using autologous peripheral blood, thereby de-risking translational pathways in vascular tissue engineering. The method provides a scalable platform for preclinical evaluation of personalized grafts, aligning with enterprise goals of risk-adjusted advancement in regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular graft biocompatibility and thrombogenicity using autologous blood-derived cells.
- Operational Value: Reduces need for invasive cell sourcing, simplifying hypothesis testing in vascular regeneration models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, decellularized scaffolds with quantifiable extracellular matrix retention for consistent seeding efficiency.
- Operational Value: Supports reproducible perfusion-based recellularization assays using simple blood samples, enabling high-throughput viability screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates luminal endothelialization and metabolic activity via glucose monitoring, supporting functional graft assessment.
- Operational Value: Facilitates preconditioning and maturation in bioreactors, improving readiness for implantation studies.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted prioritization of graft candidates through measurable recellularization outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a reusable platform for vascular graft development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-scaffold interactions and extracellular matrix integrity using decellularized human veins.
- Screening: Enables standardized recellularization assays with perfusion-defined shear stress and nutrient delivery for reproducible endothelial coverage.
- Analytics: Glucose monitoring and histological staining provide quantitative readouts for metabolic activity and cellular attachment, enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects discovery-phase scaffold optimization to preclinical validation through autologous cell seeding and functional maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for generating patient-specific vascular grafts across multiple vein types, reducing dependency on custom cell culture.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in graft functionality by demonstrating endothelialization and metabolic activity in recellularized veins.
- Operational Value: Standardizes decellularization and perfusion workflows, improving reproducibility across runs and laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage development by enabling autologous graft testing prior to clinical use.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantifiable recellularization metrics and graft patency indicators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, perfusion systems, and sterile cell handling.
- Dependent on bioreactor infrastructure, peristaltic pumps, and controlled incubation environments.
- Necessitates standardization of perfusion parameters, solution formulations, and glucose monitoring protocols.
- Adaptation to other vein types may require optimization of decellularization cycles and recellularization conditions.
- Practical limitations include the 20-day timeline for full processing and the need for aseptic maintenance throughout.
