Name: Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprenda a descellularização e recellularização de veias safenas humanas usando detergentes e sangue periférico. Este protocolo simplificado elimina procedimentos invasivos como punção de medula óssea, oferecendo uma alternativa viável para engenharia tecidual vascular e medicina regenerativa.

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Gostaríamos de agradecer o Professor Anders Jeppsson ajuda com o fornecimento de vasos sanguíneos utilizados nos experimentos. Este estudo foi financiado pela subvenção LUA ALF a SSH.

O tecido usado, e o protocolo deste trabalho segue as diretrizes éticas da Universidade de Gotemburgo.
1. tecido preparação e armazenamento
<ol><li>Corte o tecido circundante da veia safena obtida usando uma tesoura e pinça cirúrgica. Nota: A veia safena é dissecada do membro inferior dos humanos por cirurgiões vasculares. A veia safena utilizada neste trabalho é uma parte não utilizada após a cirurgia de bypass.</li>
	<li>Para evitar vazamentos durante a perfusão, ligate todos os ramos de lado em suas extremidades com suturas e fórceps.</li>
	<li>Manter a veia em um tubo de 50 mL contendo 40 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS). Lave a veia alterando PBS 2 - 3 vezes para remover o excesso de sangue. Armazenar a veia por congelamento a-80 ° C.</li>
</ol>2. preparação de Decellularization configurações e Recellularization Bioreactor
Nota: Usando uma tesoura, corte os tubos de silicone, como mostrado na tabela 1.
<ol><li>
Decellularization instalação 1 (para Triton X-100 perfusão e lavagem)
	<ol>
<li>Para um 2L de câmara (banheira de plástico), fita de todos os três pedaços de tubo A, como mostrado na figura 1A. Nota: Fita um tubo para uma parede onde a borda toca o fundo da câmara (entrada do detergente) e os outros dois tubos para a parede oposta com uma distância de 5 a 10 cm entre dependendo do comprimento da veia. Pelo menos 5 cm destes tubos também devem ser amarrado ao piso da câmara (de veia entrada e saída).</li>
		<li>Usando os conectores Luer machos e fêmeas, ligar em série da entrada do detergente tubo a tubo B seguido pelo tubo F, tubo C e finalmente para a entrada da veia. Lugar do tubo F, na gaveta da peristáltica bomba eu.</li>
		<li>Pegue outro tubo C e conecte uma extremidade à tomada da veia. Coloque a outra extremidade na jarra de vidro com saída de mangueira do fundo é colocado 45 cm acima da câmara (saída de detergente) e fita-lo para fixar. Leve o tubo G e empurra uma extremidade à tomada da mangueira da jarra de vidro e coloque a outra extremidade na câmara da veia. Nota: As fotos da instalação completa (setas vermelhas), câmara e direção de fluxo (setas brancas) são mostradas na figura 1A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization instalação 2 (TnBP para perfusão)
	<ol>
<li>Tomar um frasco de vidro de 1 L e coloque uma das extremidades do tubo C (entrada detergente) dentro do frasco até o tubo toca fundo do frasco.</li>
		<li>Conecte a outra extremidade ao tubo F seguido pelo tubo C. lugar a outra extremidade do tubo C na jarra até meia profundidade (entrada da veia). Coloque o tubo F na gaveta da bomba peristáltica eu.</li>
		<li>Pegue o tubo D... e coloque uma extremidade dentro do frasco (saída da veia) até a metade da profundidade e a outra extremidade na jarra de vidro com a mangueira inferior colocada a uma altura de 45 cm da entrada da veia (saída de detergente). Para fixar, fita tubos de entrada e saída do detergente.</li>
		<li>Colocar o frasco de vidro de 1L um agitador magnético e manter o ímã dentro da garrafa.</li>
		<li>Pegue o tubo G e empurrar uma ponta na saída de mangueira da jarra de vidro e coloque a outra extremidade no frasco de vidro de 1 L. Nota: As imagens de instalação completa (setas vermelhas), direção de fluxo e câmara (setas brancas) é mostrada na figura 1B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Decellularization configuração 3 (perfusão para DNase)
	<ol>
<li>Pegue uma garrafa de vidro de 250 mL e Coloque ambas as extremidades do tubo C. lugar área média do tubo na gaveta da bomba peristáltica II. Nota: Uma das extremidades do tubo é a entrada da solução e a outra extremidade do tubo é conectada à entrada da veia. Tomada da veia é deixada livre na solução.</li>
		<li>Coloque toda a configuração incluindo bomba a 37 ° C. As imagens de instalação completa e direção do fluxo é mostrada na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biorreator de recellularization
	<ol>
<li>Preparem todas as peças como mostrado na Figura 2A.</li>
		<li>Como mostrado na Figura 2B, tirar a tampa da 4 portas e inserir em cada porta, tubo H (saída da veia), eu (entrada de mídia) do tubo e tubo J (entrada da veia). Insira a outra extremidade do tubo H na porta 4th (meio de comunicação). Nota: A vista da PAC 4-Porto de cima é mostrada na Figura 2. Para fácil inserção dos tubos, cortar as bordas de um ponto afiado com uma tesoura.</li>
		<li>Dobre a outra extremidade do tubo J em forma de U e amarrá-lo com uma sutura. Ligue os conectores de redução para as extremidades internas dos tubos H & J.</li>
		<li>Coloque o tubo de 60ml com uma superfície plana para a garrafa de vidro de 250 mL e em seguida, coloque a configuração feita acima dentro do tubo, como mostrado na Figura 2D. Como mostrado na Figura 2E, conecte os tubos K, E e K em série. Conecte um tubo K à entrada da veia e outro tubo K para a entrada de mídia. Nota: O diagrama esquemático da configuração e direção de fluxo é visto na Figura 2F.</li>
		<li>Esterilize o biorreator em autoclave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação de soluções
<ol><li>Solução 1 (10 x água): para 1 L de água ultrapura, adicionar 2 g de azida de sódio e 18,6 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Mexa até sais são dissolvidos.</li>
	<li>Solução 2 (1 de água x): tomar 100 mL de solução 1 e adicionar 900 mL de água ultrapura.</li>
	<li>Solução 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL de água ultrapura, adicionar 50 mL de Triton X-100, 1 g de azida de sódio e 9,3 g de EDTA. Mexa até dissolver.</li>
	<li>Solução 4 (1 x X-100 Triton): tomar 200 mL de solução 3 e adicionar 800 mL de água ultrapura.</li>
	<li>Solução 5 (1 x TnBP): adicionar 10 mL de TnBP com uma pipeta de 10 mL a 990 mL de solução 2.</li>
	<li>Solução 6 (40 Kunitz unidades/mL DNase): Adicionar Kunitz de 2.000 unidades de DNaseI em 50 mL de tampão fosfato salino de Dulbecco contendo CaCl2 e MgCl2. Prepare fresco e usá-lo imediatamente.</li>
	<li>Solução 7 (PBS): Adicione 24 g de cloreto de sódio, 0,6 g de cloreto de potássio, 4,32 g de fosfato de sódio e 0,72 g de fosfato de potássio a 3 L de água ultrapura. Mexa até dissolver. Ajuste o pH para 7,4. Esterilizar a 1 L de PBS na autoclave e armazenar separadamente.</li>
	<li>Solução 8 (0,1% o ácido peracético): A 50 mL de solução estéril 7, adicionar 50 µ l de ácido peracético. Prepare fresco e usá-lo imediatamente.</li>
</ol>4. preparação de Medium endotelial
<ol><li>Adicione 5 mL de L-glutamina, 5 mL de anti-anti, 50 mL de soro humano AB e todos os componentes do kit de fator de crescimento EGM-2 exceto soro bovino fetal a 500 mL do meio de MCDB131 sob uma capa de estéril.</li>
</ol>5. decellularization da veia safena
<ol><li>Descongele a veia safena humana de-80 ° C à temperatura ambiente. Congelar-se novamente a-80 ° C e novamente descongelar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Uma biópsia de 2 mm de comprimento com uma tesoura de cortar e fixar em formaldeído por 24-48 h à temperatura ambiente. Amarre cada extremidade da veia para as farpas de um conector Luer macho e fêmea com uma sutura.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de decellularization 1 e preencher 1 L de solução 2. Perfundir para min 15 a 35 mL/min. esvaziar o conteúdo da instalação.</li>
	<li>Adicionar 1 L da solução 4 e perfundir por 4 h a 35 mL/min. esvaziar o conteúdo da instalação.</li>
	<li>Adicione 500 mL de solução 2 e perfundir por 5 min. esvaziar o conteúdo da instalação. Repita este passo. Desconecte a veia da configuração de perfusão 1 e conectar-se à instalação de perfusão 2.</li>
	<li>Adicionar 1 L de solução 5, ligar o agitador e perfundir por 4 h a 35 mL/min. Nota: Solução 5 parece nublada depois de ligar o agitador e ao longo da perfusão.</li>
	<li>Desconecte a veia da instalação de perfusão 2 e lavar a veia dentro e fora com seringa ou uma pipeta de 10 mL em 4 mudanças de água ultrapura para 5-10 min.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de perfusão 3, adicionar 50 mL de solução 6 e perfundir a 10 mL/min em uma câmara de 37 ° C por 4 h. esvaziar o conteúdo da instalação e desconecte o setup na veia.</li>
	<li>Conectar-se a veia para instalação de perfusão 1, encha 1 L de solução 2 e perfundir durante a noite a 35 mL/min. Repita o passo a passo 5.9 4 vezes (para um total de 5 ciclos) 5.4. Leve uma biópsia novamente como indicado no passo 5.2. Nota: Skip passo 5.8 segunda parte em ciclos de 1 e 3.</li>
	<li>Esvazie o conteúdo da instalação. Encha 1 L de solução 2 e perfundir por 24 h a 35 mL/min. solução de mudança 2 após 12 h. esvaziar o conteúdo da instalação. Encha 1L de água ultrapura e perfundir por 24 h a 35 mL/min. mudança da água ultrapura após 12 h.Empty o conteúdo da instalação. Encha 1 L de solução 7 e perfundir por 24 h a 35 mL/min. solução de mudança 7 após 12 h.</li>
</ol>6. verificação de Decellularization
<ol><li>Lave a formalina fixada biópsias em água ultrapura durante 15 min. processo em um processador de tecido seguindo protocolos padrão e incorporar em parafina22.</li>
	<li>Corte 5 µm seções usando um micrótomo e mancha com hematoxilina e 0,2% alcoólica eosina Meyer (H & E) seguindo protocolos padrão22.</li>
	<li>Ver os sob um microscópio para verificar se há perda de núcleos em tecido decellularized em relação ao tecido normal.</li>
</ol>7. recellularization
<ol><li>Esterilize a veia, colocando-o em um tubo de 50 mL contendo 50 mL de solução 8. Agitar em 80 rotações por minuto (rpm) no shaker para 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Lidar com a veia sob o fluxo laminar (LAF) de agora em diante, para manter a esterilidade. Transferi a veia utilizando Pinças esterilizadas para um novo tubo de 50 mL contendo 50 mL de solução estéril 7 e 500 µ l de anti-anti. Agite como acima por 12 h. mudança solução 7 pelo menos duas vezes no meio.</li>
	<li>Usando a pinça estéril, a veia de transferência para um novo tubo de 50 mL e adicionar 50 mL de mídia endotelial. Agite como acima de 11 h.</li>
	<li>Monte o biorreator usando luvas estéreis sob a LAF do armário. Amarre a veia para do biorreator veia entrada e saída com esterilizados para suturas e fórceps.</li>
	<li>Conectar-se a veia para o biorreator e encha com o mesmo meio. Adicionar a heparina em 50 UI/mL e perfundir para h 1 a 2 mL/min em 37 ° C.</li>
	<li>Coletar 15-25 mL de sangue fresco (dependendo do comprimento da veia) do doador em tubos vacutainer de heparina revestido e diluir 1:1 com solução de Steen. Depois, adicione derivado de glândula endócrina vascular fator de crescimento endotelial (VEGF-EG, 80 ng/mL), fator de crescimento básico de fibroblasto (FGF-b, 4 µ l/mL) e ácido acetil salicílico (5 µ g/mL).</li>
	<li>Mover o biorreator para uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 e perfundir por 48 h a 2 mL/min.</li>
	<li>Aproximadamente após 12 h, mover o biorreator para um LAF do armário, pegue uma gota de sangue e medir glicose usando um dispositivo de monitoramento de glicose no sangue. Se o nível for inferior a 3 mmol/L, adicionar glicose para trazer na faixa de 7-9 mmol/L. repetir este passo cada 8-12 h.</li>
	<li>Após 48 h, mova o biorreator para a LAF do armário e drenar o sangue de bioreator. Adicionar 30 mL de solução estéril 7 e perfundir 5 min. Escorra a solução. Adicionar 30 mL de solução estéril 7 e perfundir 5 min. repetir duas vezes ou até que a cor vermelha sangue é perdida. Nota: A biópsia pode ser tomada para verificação de fixação da célula. Desconecte a veia, corte as bordas de 5 mm da veia com uma tesoura e descartá-las. Pegue uma biópsia, tal como indicado no passo 5.2 e conectar a veia novamente para o biorreator (etapa opcional).</li>
	<li>Adicionar 30-45 mL de meio de endotelial e perfundir para 96 h na incubadora em 2 mL/min. Nota: Adicione endotelial médio até a veia está submersa.</li>
	<li>Mover o biorreator dentro do gabinete LAF, desconecte a veia recellularized, bordas de 5 mm da veia com uma tesoura de cortar e descartar. Leve uma biópsia, tal como indicado no passo 5.2.</li>
</ol>8. verificação da Recellularization
<ol><li>Siga as instruções na seção 6 e realizar coloração H & E. Examine as lâminas ao microscópio para a presença de células.</li>
</ol>

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</ol>

SSH detém ações em Verigraft, uma empresa que licenciou a tecnologia de vasos sanguíneos de engenharia de tecidos. Os outros autores não têm nada a divulgar.

A técnica aqui apresentada para decellularization das veias safena é um método fácil, simples e econômico que também pode ser aplicado a todas as veias de pequeno diâmetro como veias umbilicais e glândulas mamárias. As soluções de decellularization e as respectivas concentrações utilizadas neste método são da nossa anterior resultados6,7. Mesmo que recomendamos 5 ciclos de decellularization, em certas veias também observamos decellularization completa em 3 ciclos. No entanto, obtiveram-se resultados reprodutíveis, usando 5 ciclos. Aplicação deste protocolo, nós decellularized as veias de diferentes comprimentos até 30 cm com êxito (inédito resultado). Tomada da solução decellularization de levantamento por 45cm criará uma pressão de 33 mmHg dentro da veia. Em nossa experiência, notamos isto como um passo fundamental na decellularizing na veia toda uniformemente e reproducibly em 5 ciclos. A pressão escolhida é 3 vezes maior que a pressão de veia safena normal (5-10 mmHg), mas é que a mesma incompetência das veias (varizes)23. Além disso, podemos especular que esta alta pressão irá criar uma força significativa nas paredes da veia e pode, portanto, ajudar na remoção de células mais rápido e eficiente.
Desde TnBP é um solvente orgânico e insolúvel em água, mexendo o detergente até torna-se nublado é importante; caso contrário, o detergente irá flutuar. Pela mesma razão, para manter a TnBP misturado na solução, o tubo de saída do detergente foi colocado na parte superior da jarra de vidro com saída de mangueira. Remoção eficiente de TnBP da veia após seu uso em cada ciclo pode ser visto pela ausência de flutuação TnBP gotas na água lavada. Também notamos que pular a etapa de DNase também produziu um tecido decellularized, mas em alguns casos, observou-se um comparativamente alto teor de DNA no tecido decellularized. Como pressão alta e taxas de fluxo elevado não são necessárias para a atividade de DNase eficiente, uma taxa baixa perfusão (10 mL/min) pode ser usada. Uma bomba peristáltica diferente foi usada como seu tamanho menor ajuda na manipulação fácil da instalação. Desde que notamos que dano da maioria das células durante os resultados decellularization no ciclo 2, sugerimos pular tratamento de DNase durante ciclos 1 e 3 (resultados não publicados). Mesmo que a caracterização e quantificação de proteínas da matriz extracelular não foram realizadas neste manuscrito, nossa experiência anterior com protocolos idênticos decellularization mostrou a preservação das propriedades biomecânicas, matriz extracelular proteínas e estrutura7. Embora nossos experimentos preliminares de quantificação com estas veias produziram um resultado semelhante (não publicado), nossos resultados já publicados reforçará essa confiança.
Recellularization usando o sangue é um processo fácil e conveniente sobre células da medula óssea expandida como um pode evitar longos tempos de expansão celular, mutações espontâneas em células expandidas, invasão cirúrgica e desconforto para o paciente. Desde que é conhecido que endotelização também pode ocorrer de circulantes EPCs, formulamos a perfusão com sangue seguido de perfusão com endotelial médio será suficiente para recellularization. A segurança dos tecidos veia projetado usando um método similar é vista a partir de resultados de sucesso do transplante quando duas dessas veias foram implantados em crianças com obstrução de veia porta hepática extra7. Podemos especular que os fatores de crescimento na matriz extracelular decellularized permitirá a fixação de EPCs de circulação de sangue24. Recellularization das veias seguindo um protocolo semelhante mostrou células positivo para receptor VEGF-2 e aglomerado de diferenciação (CD 14) sobre o lúmen enquanto CD45 foram observadas células expressando na adventícia7. Podemos também imaginar que uma camada endotelial contínua não pode ser observada em todos os casos especialmente quando usando o sangue de pacientes mais velhos e doentes, como é sabido que tais indivíduos diminuíram os números de circulação de células progenitoras25. No entanto, podemos postular a perfusão do destinatário próprio sangue pode mascarar muitos dos antígenos que são expostos por causa da decellularization e, portanto, podem diminuir as chances de reações inflamatórias quando transplantadas em vez de transplantar somente decellularized os vasos sanguíneos. Além disso, a perfusão sanguínea pode depositar aumento dos níveis de fatores de crescimento no lúmen e adventícia, que por sua vez pode recrutar o aumento do número de células progenitoras, resultando em um rápido processo de recellularization na vivode circulação.
As vantagens do bioreactor design utilizado neste estudo são autoclave completo, fácil montagem, custo-efetividade, fácil manuseio e menos possibilidade de danos. Em nossa experiência, usando o projeto atual, veias foram recellularized até 10 cm de comprimento. Apesar das veias até 25 cm de comprimento, também pode ser recellularized, mantendo a veia em forma de "U" dentro do biorreator, isto deve ser validado. O design de biorreator mostra que a direção do fluxo na veia é contra a gravidade e é projetada como tal porque é a direção normal do fluxo para estas veias em seres humanos. A perfusão de 12 h do passo médio endotelial é condição da veia e aumentar a afinidade para a ligação de entrada EPCs. Adição de heparina extra e perfusão por 1h irá diminuir o risco de formação de coágulos de sangue nos tubos durante a perfusão sanguínea.
O volume de sangue necessário é dependente do comprimento da veia. O princípio básico, que seguimos para o volume de sangue é que a veia deve ser submersa no sangue. Durante a manipulação de volumes de sangue superiores a 45 mL, misturando ocasionalmente pode ser necessário para evitar a acumulação de células na parte inferior do bioreator. Nós adicionamos solução de Steen de sangue desde que contem uma quantidade elevada de proteínas e componentes necessários para manter os tecidos saudáveis durante o transplante de órgão26,27. Adição de VEGF e b-FGF é benéfica porque eles são de fatores de crescimento angiogênico potente28 e sua presença induz a migração, proliferação e diferenciação de EPCs29,30,31,32 . A quantidade de VEGF adicionado baseia-se nos nossos resultados inéditos anteriores, onde a proliferação de EPCs foi vista em 80 ng/mL. Adição de aspirina inibe a ativação de plaquetas33 , diminuindo assim as chances de seu apego à camada endotelial. Monitoramento contínuo e adição de glicose também será benéficos para a proliferação celular e impedindo a hemólise dos glóbulos vermelhos.
Uma vez que apenas uma amostra de sangue simples é exigida o destinatário, pode ser considerado como um procedimento fácil e viável, exigindo menos técnicos especializados. Mesmo assim, todo o procedimento mostrado aqui do início ao fim leva 20 dias, armazenando as veias decellularized como da prateleira produto vai encurtar o procedimento para 8 dias para os pacientes. Embora, tecnicamente, o armazenamento de veias decellularized não deverá afectar a eficiência de recellularization, devem ser avaliada. Engenharia de tecidos veias geradas após este procedimento podem ser usadas na clínica para cirurgias de by-pass, substituindo as veias obstruídas, insuficiência venosa, levando a varizes sem a necessidade de imunossupressão e proporcionando uma melhor qualidade de vida para o paciente.

Conduítes vasculares são necessários para várias condições clínicas como aneurismas, estenose da artéria carótida e aterosclerose, levando a graves problemas vasculares. Cirurgiões usam conduítes vasculares sintéticas, autólogos ou alogênico para restabelecer o fornecimento de sangue funcional. Embora a utilização de embarcações de sangue autólogas é ainda considerada a abordagem ideal, a disponibilidade de pacientes é muito limitada. As alternativas tais como enxertos sintéticos ou alogênico tem profundos problemas com tratamentos imunossupressores e pobre patência levando a reoperação1,2, resultando em saúde principal encargos económicos a países. Engenharia de tecidos de vasos sanguíneos visa proporcionar enxertos com uma homologia natural e células autólogas. Assim, o sistema imunológico destinatário reconhece o enxerto transplantado como o self e desde que tal um enxerto contém as proteínas naturais e células na configuração original, que pode funcionar melhor em comparação com as alternativas atuais. Engenharia de tecidos, órgãos, tais como a bexiga3, a uretra4, a traqueia5e veias6,7, tem sido utilizados com sucesso na clínica.
Engenharia de tecido para produzir enxertos personalizados requer um enxerto de um doador, seguido por decellularization e recellularization. Decellularization é uma tecnologia promissora para remover células de tecidos e órgãos8,9,10. Decellularization pode ser realizada por métodos físicos, químicos e enzimáticos específicos11 ou combinando-os. No ideal uso desses métodos, tecidos decellularized ter proteínas estruturais e funcionais semelhantes em uma matriz extracelular semelhante aos tecidos nativos. Esses órgãos possuem a capacidade intrínseca para melhorar a fixação, migração, proliferação e diferenciação de células-tronco recebidas.
Recellularization é um processo dinâmico de semeadura de células para o enxerto, e células-tronco destinatários pode ser usadas para transplante clínico. Células-tronco atualmente usadas para tais fins incluem a medula óssea, mesenquimal e órgão residentes3,5,6. Animal e pesquisa orientada estudos utilizaram células-tronco mesenquimais origens que são pluripotentes induzidas e fetal12,13,14. Este processo requer um biorreator (uma câmara que contém a veia e fornece as condições necessárias, como gases, temperatura, pH e pressão), células e meios de cultura. O desafio em recellularization é obter o número necessário de células de um tipo específico e uma estratégia de propagação de que células podem chegar todo tecido ou órgão. Mesmo que não completo tecido ou órgão estrutural e funcionalmente foram gerada e avaliada até agora, vários avanços no campo e os resultados iniciais mostram a possibilidade futura de15. A função chave da veia encontra-se no endotélio luminal que controla a infiltração de células inflamatórias nos tecidos e a camada média de músculo liso que ajuda na constrição e também fornece a força para manter a pressão arterial16. Estudos têm demonstrado que, durante a danos, endotelização ocorre de anastomose ou de circulação de células progenitoras endoteliais (EPCs) no sangue17,18,19. Nossa estratégia para recellularization das veias depende os EPCs presentes na circulação do sangue.
Engenharia de tecidos de veias e artérias foi realizada por vários grupos diferentes decellularization e recellularization estratégias20,21a seguir. Nosso grupo também tem realizado e desenvolvido estratégias decellularization e recellularization para veias ilíacas e glândulas mamárias6,7. Decellularization foi realizada por agitação da veia em Triton X-100, tri-n-butil fosfato (TnBP) e enzima desoxirribonuclease (DNase). O recellularization foi realizada usando derivada de medula óssea de células musculares lisas e endoteliais6 ou sangue periférico7. As veias recellularized por qualquer protocolo clínico prometedores em fornecer o suprimento de sangue funcional em transplante de pacientes pediátricos com obstrução de veia porta hepática extra6,7.
Atualmente, nós desenvolvemos uma versão modificada do mesmo protocolo para o desempenho melhorado e fácil de manipulação de decellularization, recellularization e biorreator de veias de pequeno diâmetro. O atual protocolo de decellularization necessário perfusão de detergentes na veia usando pressão em vez de agitação com detergentes. O protocolo de recellularization envolve uma etapa adicional de pré-condicionamento para melhorar a aderência de célula e a adição de fatores de crescimento na circulação de sangue para melhorar a proliferação, a sobrevivência e a adesão celular. Também melhorámos o design do bioreator utilizando produtos comercialmente disponíveis. Neste trabalho, apresentamos uma descrição detalhada do protocolo modificado para a realização de decellularization e recellularization das veias safena humanas.

<table><tbody><tr><td>Tampa de 4 Portas</td><td>CPLabSafety</td><td>WF-GL45-4Kit</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acetilsalicílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Lonza</td><td>cc-4113B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de monitoramento de glicose no sangue - Estilo livre Lite</td><td>Abbott</td><td>70808-70</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco com CaCl2 e MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal dissódico di-hidratado</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161. </td><td></td>Kit</tr> de <tr><td>Fatores de Crescimento OB EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EG-VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-44</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro 250ml</td><td>VWR</td><td>2151593</td><td>Qualquer frasco com tampa GL45 pode ser usado</td></tr><tr><td>Frasco de vidro 1L</td><td>VWR</td><td>2151595</td><td>Qualquer frasco com tampa GL45 pode ser usado</td></tr><tr><td>Frasco de vidro 500ml com saída de mangueira inferior</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>14607</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Vacutainer Revestidos com Heparina</td><td>Becton Dickinson</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Soro AB Humano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Luer Fêmea com 1/8" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-2PP-QC</td><td>Para tubo de silicone 3X5mm</td></tr><tr><td>Luer Fêmea com 3/32" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LF-1.5PP-QC</td><td>Para tubo de silicone 2X4mm</td></tr><tr><td>Luer Macho com 3/32" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-1.5PP-QC</td><td>Para tubo de silicone 2X4mm</td></tr><tr><td>Luer Macho com 1/8" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>Para tubo de silicone 3X5mm</td></tr><tr><td>Luer Male com 5/32" ID Barb</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45518-06</td><td>Para tubo de silicone 5X8mm</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Por ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433241</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica I</td><td>Masterflex</td><td>7524-45</td><td>Para configuração de descelularização 1 e 2. O usado é 7519-75</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica II</td><td>Ismatec</td><td>ISM941</td><td>Para configuração de descelularização 3 e biorreator de recelularização.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Conector redutor 1.5mmX2.5mm</td><td>Biotech</td><td>ISM569A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Ika</td><td>KS4000 i&nbsp; controle</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato de sódio</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Steen</td><td>Xvivo</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Agnthos</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Tri-n-butil Fosfato</td><td>AlfaAesar</td><td>A16084.AU</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046. Tubo OF</td><td></td></tr><tr><td>60ml com fundo plano</td><td>Sarstedt</td><td>60596</td><td></td></tr><tr><td>Tubo A</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Corte 3 peças, cada uma com 25 cm de comprimento para descelularização perfusão steup 1 e 2</td></tr><tr><td>Tubo B</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Corte 1 peça de 35 cm de comprimento para descelularização perfusão</td></tr><tr><td>Tubo C</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Corte 5 peças, cada uma com 75 cm de comprimento para descelularização perfusão Tubos 1-3</td></tr><tr><td>Tubo D</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cortar 1 peça de 90 cm de comprimento para descelularização e perfusão</td></tr> 2 <tr><td>Tubo E</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td>Cortar 1 peça de 20 cm de comprimento para descelularização</td></tr><tr><td>Tubo de</td> perfusão F <td>VWR</td><td>2280713</td><td>Cortar 2 peças, cada uma com 15 cm de comprimento para descelularização e perfusão 1 e 2</td></tr><tr><td>Tubo G</td><td>VWR</td><td>2280713</td><td>Corte 2 peças, cada uma com 60 cm de comprimento para a estrutura de perfusão de descelularização 1 e 2</td></tr><tr><td>Tubo H</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Corte 1 peça de 15 cm de comprimento para a estrutura de perfusão de recelularização</td></tr><tr><td>Tubo I</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Corte 1 peça de 20 cm de comprimento para a estrutura de perfusão de recelularização</td></tr><tr><td>Tubo J</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Corte 1 peça de 25 cm de comprimento para a estrutura de perfusão de recelularização</td></tr><tr><td>Tubo K</td><td>VWR</td><td>2280703</td><td>Corte 2 peças, cada uma com 35 cm de comprimento para recelularização perfusão</td></tr></tbody></table>

decellularization e recellularization metodologia para as veias safena humanas

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Conduítes vasculares usados durante a maioria das cirurgias vasculares são enxertos sintéticos ou alogênico que muitas vezes levam a complicações causadas por imunossupressão e pobre patência. Engenharia de tecidos oferece uma nova solução para gerar os enxertos personalizados com uma natural da matriz extracelular que contém células do destinatário usando o método de decellularization e recellularization. Vamos mostrar um método detalhado para a realização de decellularization da veia safena humana e recellularization por perfusão de sangue periférico. A veia foi decellularized por perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (TnBP) e 2.000 unidades de Kunitz de desoxirribonuclease (DNase). Triton X-100 e TnBP foram perfundidos em 35 mL/min para 4h enquanto DNase foi perfundido em 10 mL/min a 37 ° C por 4 h. A veia foi lavada em água ultrapura e PBS e então esterilizada em 0,1% o ácido peracético. Foi lavado novamente em PBS e pré-condicionado endotelial médio. A veia foi conectada a um biorreator e perfundida com endotelial médio contendo 50 UI/mL heparina para 1 h. Recellularization foi realizada por preenchendo o biorreator com sangue fresco, diluído 1:1 em solução Steen e adicionando derivado de glândula endócrina vascular fatores de crescimento endoteliais (80 ng/mL), fatores de crescimento fibroblástico básico (4 µ l/mL) e ácido acetil salicílico (5 µ g/mL). O biorreator foi, em seguida, mudou-se para uma incubadora e perfundido por 48 h a 2 mL/min, mantendo a glicemia entre 3-9 mmol/L. Mais tarde, a veia era lavada com PBS, cheias de médio endotelial e perfundida por 96 h na incubadora. Tratamento com Triton X-100, TnBP e DNase decellularized da veia safena em 5 ciclos. A veia decellularized parecia branca em contraste com as veias normais e recellularized (luz vermelha). A hematoxilina & eosina (H & E) coloração mostraram a presença de núcleos apenas no normal, mas não nas veias decellularized. Na veia recellularized, H & E mancha mostraram a presença de células na superfície luminal da veia.

A morfologia bruta de uma veia normal é luz vermelha (Figura 3A). A cor vermelha é perdida na decellularization progressiva ciclos (ciclo 2, Figura 3B; ciclo 3, Figura 3) e pelo ciclo de 5th , parece pálido e branco (Figura 3D). A veia recellularized depois da perfusão sanguínea (Figura 3E) e mídia endotelial perfusão (Figura 3F) parece vermelho brilhante na cor. Os 5 ciclos de tratamento decellularization removido com sucesso as células da veia como eram vistos sem núcleos azuis na coloração H &amp; E (Figura 4B). Em contraste, vários núcleos foram vistos na veia normal (Figura 4A). A presença de células anexadas no lado luminal é vista em H &amp; E mancha na veia recellularized com sangue por 48 h (Figura 4, setas pretas) e após a perfusão com o meio endotelial de 96 h (Figura 3D, setas pretas).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig1.jpg"> Figura 1 : Montagem de configurações de perfusão para decellularization. A) a foto mostrando a configuração montada decellularization 1 para Triton X-100 e lavagem. As setas brancas mostram o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas e saídas para a veia e soluções. B) a foto mostrando a configuração montada decellularization 2 para perfusão TnBP. Da mesma forma, como na instalação de decellularization 1, setas brancas indicam o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas e saídas para a veia e soluções. C) a foto mostrando a configuração montada decellularization 3 para perfusão desoxirribonuclease. As setas brancas mostram o caminho de fluxo de soluções e setas vermelhas indicam entradas para a veia e soluções. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig2.jpg"> Figura 2 : Preparação e montagem do bioreator para recellularization. A) imagine apresentando materiais necessários para a montagem do biorreator. B) imagens do interior do cap 4 portas mostrando a colocação da redução conectores (setas vermelhas), aponta para conectar a veia de entrada e saída (setas brancas) e arranjo de tubos, H, I e J. A extremidade livre do tubo H é colocada em bioreator para retorno de mídia. C) os respectivos tubos entrando e saindo podem ser vistos da parte superior da tampa do bujão de 4. D) imagens mostrando o biorreator montado. E) foto mostrando a configuração inteira biorreator com a bomba peristáltica. Os tubos K estendem as conexões de bioreator para a bomba peristáltica. F) a representação esquemática do sistema de perfusão de biorreator toda. As setas laranja indicam o sentido do fluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig3.jpg"> Figura 3 : Morfologia das veias de efectivação durante decellularization e recellularization. A) a morfologia bruta da veia normal parece vermelho brilhante na cor. A cor é perdida com o aumento do número de ciclos de decellularization B) ciclo 2 e C) ciclo 3. D) por 5 ciclos, a veia parece pálida e branca. A veia depois perfusing com E) sangue por 48 h e F) com o meio endotelial de 96 h parece mais uma vez brilhante vermelho na cor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57803/57803fig4.jpg"> Figura 4 : Caracterização das veias decellularized e recellularized. A hematoxilina e eosina, manchando a imagem de A) veia normal contém muitos núcleos azuis mas estão ausentes no B) veia decellularized. Na veia recellularized com C) sangue por 48 h e com D) endotelial médio para 96 h, fixação de células (setas pretas) no lúmen foi notado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57803/57803fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um protocolo para o decellularization de veia safena, usando detergentes e recellularization por perfusão de sangue periférico e o médio endotelial.

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Este método explica um procedimento detalhado para a engenharia de tecidos da veia safena. Também demonstramos a preparação de configurações de descelularização e biorreator para recelularização usando aparelhos simples. A principal vantagem dessa técnica é que uma simples amostra de sangue é necessária para a recelularização, eliminando assim a coleta dolorosa da medula óssea e os demorados procedimentos de cultura de células.Para perfusão e lavagem do Triton-X 100, prepare a configuração de descelularização um. Em uma câmara de dois litros, cole todos os três pedaços de tubo A.Cole um tubo na parede onde a borda toca o fundo da câmara para a entrada do detergente. Prenda os outros dois tubos na parede oposta com uma distância de cinco a 10 centímetros entre eles, dependendo do comprimento da veia.Pelo menos cinco centímetros desses tubos também devem ser colados no chão da câmara. Conecte o tubo de entrada do detergente ao tubo B usando os conectores de isca macho e fêmea. Em seguida, conecte o tubo B ao tubo F e o tubo F ao tubo C. Conecte o tubo C à entrada da veia.Agora, coloque o tubo F no da bomba peristáltica. Pegue outro tubo C e conecte uma extremidade à saída da veia. Coloque a outra extremidade em uma jarra de vidro equipada com uma saída de mangueira inferior e posicionada 45 centímetros acima da câmara e prenda-a com fita adesiva.Isso serve como saída de detergente. Em seguida, empurre uma extremidade do tubo G na saída da mangueira do frasco de vidro e coloque a outra extremidade na câmara das veias. Em seguida, prepare a configuração de descelularização dois para perfusão de TnBP, conforme detalhado no protocolo de texto.Prepare também a configuração de descelularização três para a perfusão do DNA, conforme detalhado no texto, e coloque-a a 37 graus Celsius. Para preparar o biorreator de recelularização, insira o tubo H em uma porta de uma tampa de quatro portas para servir como saída da veia. Na segunda porta, insira o tubo I para servir como entrada de mídia.E na terceira porta, insira o tubo J para a entrada da veia. Em seguida, insira a outra extremidade do tubo H na quarta porta para servir como meio de comunicação. Conecte os conectores redutores às extremidades internas dos tubos H e J. Dobre a outra extremidade do tubo J em forma de U e amarre-o com uma sutura.Agora, coloque um tubo de 60 mililitros com uma base plana em um copo de 250 mililitros. Em seguida, conecte uma extremidade do tubo K à entrada da veia e conecte a outra extremidade ao tubo E.Conecte o tubo E a um segundo tubo K e, em seguida, à entrada do meio. Em seguida, coloque a configuração da tampa preparada no tubo presente na garrafa.Finalmente, esterilize o biorreator por autoclavagem. Execute dois ciclos de congelamento e descongelamento em uma veia safena humana, conforme detalhado no protocolo de texto, antes de cortar uma biópsia de dois milímetros de comprimento com uma tesoura. Fixe a biópsia em formaldeído por 24 a 48 horas em temperatura ambiente.Amarre cada extremidade da veia às farpas de um conector de isca macho e fêmea com uma sutura. Conecte a veia à configuração de descelularização um e encha a câmara com um litro da solução dois. Agora, perfunda por 15 minutos a 35 mililitros por minuto e esvazie o conteúdo da configuração.Em seguida, adicione um litro de solução quatro e perfunda por quatro horas a 35 mililitros por minuto. Esvazie o conteúdo, adicione 500 mililitros da solução dois, perfunda por cinco minutos e esvazie novamente o conteúdo. Desconecte a veia da configuração de perfusão um e conecte-a à configuração de perfusão dois.Em seguida, adicione um litro da solução cinco, ligue o agitador e perfunda por quatro horas a 35 mililitros por minuto. Desconecte a veia da configuração de perfusão dois e lave a parte externa da veia duas vezes com 20 mililitros de água ultrapura. Em seguida, use uma seringa para lavar o interior da veia duas vezes com 20 mililitros de água ultrapura por cinco a 10 minutos.Após a perfusão com a configuração de perfusão três, conforme descrito no protocolo de texto, conecte a veia à configuração de perfusão um. Encha um litro da solução dois e perfunda durante a noite a 35 mililitros por minuto. Repita o processo de perfusão quatro vezes para remover completamente o material nuclear.Após a perfusão, esvazie a configuração, encha um litro da solução dois e perfunda por 24 horas a 35 mililitros por minuto. Após 24 horas, esvazie a configuração novamente e encha com um litro de água ultrapura. Perfunda por mais 24 horas a 35 mililitros por minuto.Por fim, repita a perfusão nas mesmas condições, mas com a solução sete. Após a verificação da descelularização conforme descrito no protocolo de texto, esterilizar a veia colocando-a em um tubo de 50 mililitros contendo 50 mililitros da solução oito. Agite a 80 rotações por minuto em uma coqueteleira por uma hora a 37 graus Celsius.Trabalhando em um gabinete de fluxo laminar para manter a esterilidade, agora use uma pinça estéril para transferir a veia estéril para um novo tubo de 50 mililitros contendo 50 mililitros de solução estéril sete, contendo 500 microlitros de anti anti. Agite a veia como antes por 12 horas, trocando a solução sete pelo menos duas vezes entre elas. Usando uma pinça estéril, transfira a veia para um novo tubo de 50 mililitros, adicione 50 mililitros de meio endotelial e agite por 11 horas.Agora, conecte a veia amarrando-a à entrada e saída da veia do biorreator com sutura e pinça estéreis e aperte a configuração da tampa ao frasco de 250 mililitros. Encha o biorreator com o mesmo meio endotelial. Adicione heparina a 50 unidades por mililitro e perfunda por uma hora a dois mililitros por minuto na incubadora.Colete 15 a 25 mililitros de sangue fresco do doador em tubos vacutainer revestidos com heparina e dilua-o um a um com solução de steen. Mais tarde, adicione o fator de crescimento endotelial vascular derivado da glândula endócrina, o fator de crescimento fibroblástico básico e um ácido salicílico sutil. Depois de esvaziar o meio endotelial do biorreator, adicione o sangue a ele e perfunda por 48 horas a dois mililitros por minuto em uma incubadora a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono.Aproximadamente 12 horas depois, trabalhe no gabinete de fluxo laminar para remover uma gota de sangue do biorreator e medir a glicose usando um dispositivo de monitoramento de glicose no sangue. Se o nível for inferior a três milimoles por litro, adicione glicose para colocá-lo na faixa de sete a nove milimoles por litro. Após 48 horas de volta à incubadora, drene o sangue do biorreator no gabinete de fluxo laminar.Adicione 30 mililitros de solução estéril sete, perfunda por cinco minutos e escorra a solução. Repita esse processo até que a cor vermelho-sangue seja perdida. Por fim, adicione 30 a 45 mililitros de meio endotelial e perfunda por 96 horas na incubadora a dois mililitros por minuto.Desconecte a veia recelularizada do biorreator no gabinete de fluxo laminar, corte as bordas de cinco milímetros da veia usando uma tesoura e descarte. Faça uma biópsia como antes, coloque em formaldeído e realize a verificação da recelularização conforme descrito no protocolo de texto. A morfologia macroscópica de uma veia normal parece vermelha brilhante.A cor vermelha é perdida em ciclos progressivos de descelularização e, após cinco ciclos de tratamento, parece pálida e branca. A veia recelularizada por perfusão de sangue periférico e meio endotelial novamente parecia vermelha brilhante. Aqui é mostrada uma imagem representativa de coloração de hemotaxilina e eosina de veia normal mostrando a presença de muitos núcleos azuis.No entanto, núcleos azuis não foram observados na coloração de hemotaxilina e eosina da veia descelularizada. Na veia recelularizada perfundida com sangue e meio endotelial, a coloração de hemotaxilina e eosina mostrou a presença de fixação celular no lúmen. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar a descelularização da veia safena por detergentes e a recelularização com sangue periférico e meio endotelial.Esta técnica de descelularização usando perfusão de Triton-X 100, TnBP e DNA's sob pressão foi bem-sucedida e reprodutível na remoção de núcleos de veias safenas humanas. Embora essa técnica leve 20 dias para ser concluída, armazenar a veia descelularizada como um produto pós-prateleira diminuirá o tempo do procedimento para oito dias. A recelularização das veias usando o sangue periférico do receptor pode ser considerada clinicamente relevante.As veias recelularizadas com protocolo semelhante mostraram-se promissoras no transplante clínico, fornecendo um suprimento sanguíneo funcional após a operação. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser usado para qualquer tipo de veia e como enxerto personalizado em clínicas para todas as cirurgias vasculares.

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Research

JoVE Journal

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