Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Este método explica um procedimento detalhado para a engenharia de tecidos da veia safena. Também demonstramos a preparação de configurações de descelularização e biorreator para recelularização usando aparelhos simples. A principal vantagem dessa técnica é que uma simples amostra de sangue é necessária para a recelularização, eliminando assim a coleta dolorosa da medula óssea e os demorados procedimentos de cultura de células.

Para perfusão e lavagem do Triton-X 100, prepare a configuração de descelularização um. Em uma câmara de dois litros, cole todos os três pedaços de tubo A.Cole um tubo na parede onde a borda toca o fundo da câmara para a entrada do detergente. Prenda os outros dois tubos na parede oposta com uma distância de cinco a 10 centímetros entre eles, dependendo do comprimento da veia.

Pelo menos cinco centímetros desses tubos também devem ser colados no chão da câmara. Conecte o tubo de entrada do detergente ao tubo B usando os conectores de isca macho e fêmea. Em seguida, conecte o tubo B ao tubo F e o tubo F ao tubo C. Conecte o tubo C à entrada da veia.

Agora, coloque o tubo F no da bomba peristáltica. Pegue outro tubo C e conecte uma extremidade à saída da veia. Coloque a outra extremidade em uma jarra de vidro equipada com uma saída de mangueira inferior e posicionada 45 centímetros acima da câmara e prenda-a com fita adesiva.

Isso serve como saída de detergente. Em seguida, empurre uma extremidade do tubo G na saída da mangueira do frasco de vidro e coloque a outra extremidade na câmara das veias. Em seguida, prepare a configuração de descelularização dois para perfusão de TnBP, conforme detalhado no protocolo de texto.

Prepare também a configuração de descelularização três para a perfusão do DNA, conforme detalhado no texto, e coloque-a a 37 graus Celsius. Para preparar o biorreator de recelularização, insira o tubo H em uma porta de uma tampa de quatro portas para servir como saída da veia. Na segunda porta, insira o tubo I para servir como entrada de mídia.

E na terceira porta, insira o tubo J para a entrada da veia. Em seguida, insira a outra extremidade do tubo H na quarta porta para servir como meio de comunicação. Conecte os conectores redutores às extremidades internas dos tubos H e J. Dobre a outra extremidade do tubo J em forma de U e amarre-o com uma sutura.

Agora, coloque um tubo de 60 mililitros com uma base plana em um copo de 250 mililitros. Em seguida, conecte uma extremidade do tubo K à entrada da veia e conecte a outra extremidade ao tubo E.Conecte o tubo E a um segundo tubo K e, em seguida, à entrada do meio. Em seguida, coloque a configuração da tampa preparada no tubo presente na garrafa.

Finalmente, esterilize o biorreator por autoclavagem. Execute dois ciclos de congelamento e descongelamento em uma veia safena humana, conforme detalhado no protocolo de texto, antes de cortar uma biópsia de dois milímetros de comprimento com uma tesoura. Fixe a biópsia em formaldeído por 24 a 48 horas em temperatura ambiente.

Amarre cada extremidade da veia às farpas de um conector de isca macho e fêmea com uma sutura. Conecte a veia à configuração de descelularização um e encha a câmara com um litro da solução dois. Agora, perfunda por 15 minutos a 35 mililitros por minuto e esvazie o conteúdo da configuração.

Em seguida, adicione um litro de solução quatro e perfunda por quatro horas a 35 mililitros por minuto. Esvazie o conteúdo, adicione 500 mililitros da solução dois, perfunda por cinco minutos e esvazie novamente o conteúdo. Desconecte a veia da configuração de perfusão um e conecte-a à configuração de perfusão dois.

Em seguida, adicione um litro da solução cinco, ligue o agitador e perfunda por quatro horas a 35 mililitros por minuto. Desconecte a veia da configuração de perfusão dois e lave a parte externa da veia duas vezes com 20 mililitros de água ultrapura. Em seguida, use uma seringa para lavar o interior da veia duas vezes com 20 mililitros de água ultrapura por cinco a 10 minutos.

Após a perfusão com a configuração de perfusão três, conforme descrito no protocolo de texto, conecte a veia à configuração de perfusão um. Encha um litro da solução dois e perfunda durante a noite a 35 mililitros por minuto. Repita o processo de perfusão quatro vezes para remover completamente o material nuclear.

Após a perfusão, esvazie a configuração, encha um litro da solução dois e perfunda por 24 horas a 35 mililitros por minuto. Após 24 horas, esvazie a configuração novamente e encha com um litro de água ultrapura. Perfunda por mais 24 horas a 35 mililitros por minuto.

Por fim, repita a perfusão nas mesmas condições, mas com a solução sete. Após a verificação da descelularização conforme descrito no protocolo de texto, esterilizar a veia colocando-a em um tubo de 50 mililitros contendo 50 mililitros da solução oito. Agite a 80 rotações por minuto em uma coqueteleira por uma hora a 37 graus Celsius.

Trabalhando em um gabinete de fluxo laminar para manter a esterilidade, agora use uma pinça estéril para transferir a veia estéril para um novo tubo de 50 mililitros contendo 50 mililitros de solução estéril sete, contendo 500 microlitros de anti anti. Agite a veia como antes por 12 horas, trocando a solução sete pelo menos duas vezes entre elas. Usando uma pinça estéril, transfira a veia para um novo tubo de 50 mililitros, adicione 50 mililitros de meio endotelial e agite por 11 horas.

Agora, conecte a veia amarrando-a à entrada e saída da veia do biorreator com sutura e pinça estéreis e aperte a configuração da tampa ao frasco de 250 mililitros. Encha o biorreator com o mesmo meio endotelial. Adicione heparina a 50 unidades por mililitro e perfunda por uma hora a dois mililitros por minuto na incubadora.

Colete 15 a 25 mililitros de sangue fresco do doador em tubos vacutainer revestidos com heparina e dilua-o um a um com solução de steen. Mais tarde, adicione o fator de crescimento endotelial vascular derivado da glândula endócrina, o fator de crescimento fibroblástico básico e um ácido salicílico sutil. Depois de esvaziar o meio endotelial do biorreator, adicione o sangue a ele e perfunda por 48 horas a dois mililitros por minuto em uma incubadora a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono.

Aproximadamente 12 horas depois, trabalhe no gabinete de fluxo laminar para remover uma gota de sangue do biorreator e medir a glicose usando um dispositivo de monitoramento de glicose no sangue. Se o nível for inferior a três milimoles por litro, adicione glicose para colocá-lo na faixa de sete a nove milimoles por litro. Após 48 horas de volta à incubadora, drene o sangue do biorreator no gabinete de fluxo laminar.

Adicione 30 mililitros de solução estéril sete, perfunda por cinco minutos e escorra a solução. Repita esse processo até que a cor vermelho-sangue seja perdida. Por fim, adicione 30 a 45 mililitros de meio endotelial e perfunda por 96 horas na incubadora a dois mililitros por minuto.

Desconecte a veia recelularizada do biorreator no gabinete de fluxo laminar, corte as bordas de cinco milímetros da veia usando uma tesoura e descarte. Faça uma biópsia como antes, coloque em formaldeído e realize a verificação da recelularização conforme descrito no protocolo de texto. A morfologia macroscópica de uma veia normal parece vermelha brilhante.

A cor vermelha é perdida em ciclos progressivos de descelularização e, após cinco ciclos de tratamento, parece pálida e branca. A veia recelularizada por perfusão de sangue periférico e meio endotelial novamente parecia vermelha brilhante. Aqui é mostrada uma imagem representativa de coloração de hemotaxilina e eosina de veia normal mostrando a presença de muitos núcleos azuis.

No entanto, núcleos azuis não foram observados na coloração de hemotaxilina e eosina da veia descelularizada. Na veia recelularizada perfundida com sangue e meio endotelial, a coloração de hemotaxilina e eosina mostrou a presença de fixação celular no lúmen. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar a descelularização da veia safena por detergentes e a recelularização com sangue periférico e meio endotelial.

Esta técnica de descelularização usando perfusão de Triton-X 100, TnBP e DNA's sob pressão foi bem-sucedida e reprodutível na remoção de núcleos de veias safenas humanas. Embora essa técnica leve 20 dias para ser concluída, armazenar a veia descelularizada como um produto pós-prateleira diminuirá o tempo do procedimento para oito dias. A recelularização das veias usando o sangue periférico do receptor pode ser considerada clinicamente relevante.

As veias recelularizadas com protocolo semelhante mostraram-se promissoras no transplante clínico, fornecendo um suprimento sanguíneo funcional após a operação. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser usado para qualquer tipo de veia e como enxerto personalizado em clínicas para todas as cirurgias vasculares.