Name: Explorando o potencial das células-tronco mesenquimais folha sobre o desenvolvimento do Carcinoma hepatocelular na Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Explore o desenvolvimento de modelo de carcinoma hepatocelular in vivo utilizando tecnologia de folha de células e células-tronco mesenquimais em ratos nus. Este método permite avaliar terapias anticâncer de forma confiável.

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Os autores gostaria de agradecer a equipe de Cirurgia Experimental e laboratório de Animal da faculdade de medicina, rei Saud Universidade, pela sua cooperação e apoio-especialmente Hussain Almukhayzim e Hisham Aloudah. Os autores também gostaria de reconhecer a equipe de mídia da rei Saud bin Abdul-Aziz University para preparar o visual material-especialmente Muath bin Ghannam e Abdulwahab Alsulami.

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Comité de ética da Universidade Rei Saud. Procedimentos cirúrgicos, anestésicos e outros medicamentos utilizados em animais são aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Rei Saud. Todo o trabalho experimental é executado por pessoal adequadamente treinado.
1. célula folha construção
<ol><li>Revestir os pratos de cultura (pratos de cultura responsiva a temperatura de 3,5 cm) com soro bovino fetal não diluído (FBS) e certifique-se de cobrir toda a superfície do prato. Nota: Este passo é importante para o destacamento da camada de células, uma vez que suporta o crescimento das células em uma monocamada e impede a agregação de célula.</li>
	<li>Incube os pratos por 24 h a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% ar umidificada.</li>
	<li>Retire o excesso FBS os pratos revestidos e permitir que os pratos secar à temperatura ambiente (RT) pelo menos 1 h.</li>
	<li>Preparar as suspensões de três celulares: 1 x 106 HepG2 células, 1 x 106 HepG2 células com BMMSCs e 1 x 106 HepG2 células com UCMSCs (em uma proporção de 4:1 para BMMSCs e UCMSCs).</li>
	<li>A suspensão de célula apropriada para cada prato rotulado de semente.</li>
	<li>Suspenda todas as células em cultura DMEM suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Incube as células a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% ar umidificada.</li>
</ol>2. célula folha de desprendimento
<ol><li>Na confluência de célula de 100%, se os pratos da incubadora a 37 ° C.</li>
	<li>Incube o prato de folha de célula HepG2 por 1h no RT, ao mesmo tempo incubando o HepG2/BMMSC e pratos de folha de célula HepG2/UCMSC por 30-40 min, a 20 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% ar umidificada. Nota: A camada de células feita a partir apenas de HepG2 é frágil; reduzindo a temperatura a 20 ° C provoca danos à estrutura da folha.</li>
</ol>3. desempenho do procedimento cirúrgico
Nota: Durante o tempo de incubação para o destacamento de folha do celular, inicie o tratamento de animais.
<ol><li>
Instruções para a preparação da área de cirurgia
	<ol>
<li>Realizar todos os procedimentos cirúrgicos em uma área estéril separada dentro do laboratório, como um capuz, fluxo laminar ou uma sala de cirurgia asséptica. Certifique-se de que todas as superfícies da área de cirurgia são não-poroso, selado, durável e sanitizable.</li>
		<li>Use equipamento de proteção adequado, incluindo avental, luvas, máscaras e cabeça e sapato cobre.</li>
		<li>Uso cirúrgico ferramentas que são limpo e esterilizado (através de autoclavagem; haste saturada sob alta pressão) no início da cirurgia.</li>
		<li>Mudar as luvas entre ratos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação do animal para a cirurgia
	<ol>
<li>Use ratos nus de 8 a 12 semanas de idade.</li>
		<li>Crie a anestesia injetável para ratos.<ol>
<li>Para preparar a solução de anestesia, xilazina-cetamina, misture 2 mL de cetamina, 1 mL de xilazina (em uma concentração de 20 mg/mL) e 1 mL de salina fisiológica estéril (por exemplo, 0,9% de cloreto de sódio) em um frasco de coleta estéril 10 mL de soro e agite bem antes de Use.</li>
			<li>Para aplicar anestesia, injete intraperitonealmente 0,2 mL da solução de xilazina-cetamina por 100 gramas de peso do corpo do rato. Nota: A dose total da solução é de 100 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg de xilazina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remova sujeira/sujidade visível do local cirúrgico.</li>
		<li>Verifique a profundidade da anestesia por testar o reflexo de retirada de pedal (pitada de almofada de pé sobre as duas patas traseiras). Nota: A pitada de almofada do pé provoca uma resposta, repetir na dose de 0,05 mL/100 g (aproximadamente a cada 30 min), se volte a verificar a profundidade anestésica.</li>
		<li>Desinfete a área de cirurgia com uma esfoliação de dois estágios por povidone-iodo/isopropanol.</li>
		<li>Cobrir o rato com um pano estéril para evitar a contaminação da incisão.</li>
		<li>Injetar os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg)8 antes de fazer a incisão.</li>
		<li>Usando um bisturi estéril, fazer um 7 para 10-cm corte entre a pele e os músculos subjacentes para expor o fígado.<ol>
<li>Separe o músculo abdominal da pele com a parte traseira lisa borda do bisturi.</li>
			<li>Cuidadosamente a esfaquear o linea alba usando um bisturi e estender o corte com tesoura afiada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. célula folha transplante
Nota: O transplante de células folha é realizado no fígado.
<ol><li>Recolha a camada de células da placa de cultura.<ol>
<li>Bata levemente o prato de cultura sobre o banco para retirar a folha de sua superfície.</li>
		<li>Separe a camada de células da superfície do prato raspando a borda da folha em um meio círculo, usando a ponta da pipeta estéril.</li>
		<li>Suavemente retire o meio inteiro o prato de cultura.</li>
		<li>Garantir que a folha está intacta, sem nenhum dano; caso contrário, não pode ser usado (Figura 1). Nota: As folhas resultantes podem ser detectadas diretamente pelo olho.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma membrana esterilizada (papel de filtro) para colher a folha célula do prato.<ol>
<li>Primeiro, embeba a membrana com solução salina normal. Em seguida, retire o soro em excesso com uma almofada de algodão estéril.</li>
		<li>Coloque a membrana molhada sobre a camada de células, evitando dobras e bolhas de ar entre a membrana e a camada de células.</li>
		<li>Adicione algumas gotas de solução salina sobre a membrana e a camada de células para coletá-los mais fácil. Nota: Para evitar quebrar a camada de células, não utilize soro fisiológico frio e levantar a membrana e a camada de células com fórceps.</li>
		<li>Embora a membrana por alguns segundos garantir que a camada de células é bem presas à membrana e depois cobrá-lo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o fígado para transplante de células folha.<ol>
<li>Certifique-se que a superfície do fígado é seca tocando-o suavemente com uma almofada de algodão estéril.</li>
		<li>Usando a pinça estéril, coloque a membrana com a camada de células sobre um único lóbulo do fígado do rato.</li>
		<li>Adicione algumas gotas de solução salina estéril e aplique uma ligeira pressão à membrana para separar a camada de células dele.</li>
		<li>Espere 5 minutos antes de remover cuidadosamente a membrana. Nota: Isto é feito para garantir que a camada de células está bem colocada para o fígado.</li>
		<li>Finalmente, fechar os músculos subjacentes e a pele incisões com suturas de nylon 5-0.</li>
		<li>Desinfete a área de cirurgia com iodo-povidona. Nota: A Figura 2 mostra um diagrama do processo de transplante de células folha no fígado de rato nude.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cuidados pós-operatório de
<ol><li>Imediatamente após a cirurgia, o rato individualmente para evitar canibalismo ou asfixia de casa e monitorá-lo regularmente (pelo menos a cada 15 min) até que seja consciente e totalmente ambulant.</li>
	<li>Em seguida, avalie os ratos diariamente por 5-14 d, pelo menos 5 d no período pós-operatório, para garantir que não há nenhuma complicação. Durante a avaliação diária, certifique-se do seguir.<ol>
<li>A ferida é fechada, e as suturas estão intactas, sem ser excessivamente apertado.</li>
		<li>Não há sinais de infecção no local da incisão, tais como calor, excessiva descarga purulenta ou inchaço.</li>
		<li>Não há sinais associados com dor, tais como o reduzido consumo de comida e água, perda de peso, desidratação, pele acampar ou respiração rápida e aberto. Para controle de moderada a severa dor depois da cirurgia, se for o caso, injete os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg) cada 6-8 h9 por um período mínimo de 48 a 72 h no pós-operatório.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. análise da área transplantada
<ol><li>Um mês após o transplante, scarifice o rato e recolher a área transplantada para histológica e análise imuno-histoquímica.</li>
</ol>

<ol><li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171(2011).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li>
<li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+%28N-isopropylacrylamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), e10088(2010).</li>
<li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+1+%28MSC1%29-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590(2012).</li>
<li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li>
<li>Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats">https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats</a> (2017).</li>
<li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004(2017).</li>
<li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).</li>
<li>Driscoll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preclinical+new+drug+research+program+of+the+National+Cancer+Institute%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reports%22%5BJournal%5D)">The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute.</a> Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).</li>
<li>Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+in+vivo+cancer+model+using+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering.</a> Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li>
<li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li>
<li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Uma extensa quantidade de pesquisa é dedicada ao desenvolvimento de um adequada na vivo pré-clínicos modelo animal que se assemelha a cânceres humanos. Atualmente, as principais abordagens usadas para criar modelos animais câncer envolvem engenharia genética e células de transplantação11. Modelos de animais geneticamente modificados são boas ferramentas para a identificação e validação de genes-alvo, bem como compreender os mecanismos moleculares subjacentes a toxicidade induzida por drog...

HCC é um câncer primário do fígado que está significativamente associado um mau prognóstico. Anualmente, quase meio milhão novos pacientes são diagnosticados com HCC, representando 85% dos pacientes de câncer de fígado em todo o mundo1. Hepatocarcinogenesis não é uma doença de forma única; pelo contrário, é uma coleção de doenças que têm diferentes características histopatológicas e variabilidade genética e genômica, além de variados prognóstico resultados1. Portanto, os principais desafios no desenvolvimento de uma estratégia terapêutica eficaz para HCC são o limitado conhecimento da biologia HCC e a falta de um modelo animal experimental apropriado que pode ajudar a entender esta doença complexa. Em vivo modelo animal que imita o câncer humano é necessário para seleção de genes candidatos e identificar marcadores prognóstico/preditivo implicados na indução de câncer, bem como para a investigação de diferentes fatores que podem afetar respostas de câncer de agentes terapêuticos.
Estudos in vitro do câncer estão ainda associados com maiores limitações. Isto é devido ao fato de que as células cancerosas perdem muitas das suas características na vivo , quando mantidas em cultura. As mudanças que ocorrem em células em vitro resultado da ausência de fisiologia do tecido inteiro num cenário ex vivo . Interação de célula para célula de câncer (do estroma, imune, vascularização, epitelial, etc.) dentro do microambiente do tumor reflete muito sobre câncer célula características2. O microambiente do tumor pode alterar a expressão de gene/proteína de células de câncer e características fenotípicas, além de angiogenetic e potencial metastático. O sistema de cultura bidimensional (2D) em vitro também carece de uma matriz de tecido apropriado, o que é necessária regulamentar a progressão do tumor. Assim, devido a essas limitações, modelos em vivo devem sempre ser utilizados para apoiar as conclusões preliminares dos modelos em vitro . Neste estudo, nós usamos a tecnologia de folha de célula para desenvolver no vivo modelo animal que elucida o completo processo biológico subjacente HCC.
Mais de uma década atrás, laboratório do Okano estabeleceu um novo método de engenharia de tecidos, com base na célula folha tecnologia3. Esta técnica utiliza um plástico de cultura thermo-responsivo para permitir a aderência de célula reversível/destacamento controlando a hidrofobicidade de superfície. Este método permite uma suave colheita de culturas de células de formato um intacto tridimensional (3D) (folha i.e.,cell), com uma cuidada da matriz extracelular (ECM) e interações de célula para célula. A técnica de folha célula requer o precoating de pratos de cultura com uma temperatura-responsivo polímero poly(N-isopropylacrylamide) (sou de PIPA), que é comercialmente disponível e pronto para uso. A uma temperatura abaixo de 20 ° C, polímeros PIPA estou tornam-se hidratado e dissolve-se em soluções aquosas, Considerando que, a uma temperatura mais elevada (37 ° C), os polímeros tornar-se desidratado e transformam em um precipitado turvo. O polímero contém cadeias hidrofílicas de Amida e cadeias laterais hidrofóbicas (grupos de isopropil). Em altas temperaturas, o movimento browniano das moléculas de água se intensifica, Considerando que, em uma baixa temperatura, as moléculas de água circundantes isopropílico grupos do colapso da estrutura hidratado e os grupos hidrofóbico isopropílico agregar por causa de interações hidrofóbicas. Portanto, toda a cadeia do polímero agrega e precipita-se4.
No estudo apresentado, esta técnica é empregada para desenvolver um modelo animal de HCC, usando três folhas de célula diferente. A primeira folha de empregados é composto HCC célula linha células apenas, enquanto as outras duas folhas consistem em uma combinação de células de linha celular HCC e MSCs de duas fontes diferentes: MSCs da medula óssea (BMMSCs) e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). MSCs são células do estroma não-hematopoiéticas que são capazes de diferenciar intocell derivados da linhagem mesenquimal, incluindo adipócitos, osteócitos, condrócitos e miócitos5. A razão pela qual que empregamos essas células, ao criar a camada de células de câncer é o relatórios inconsistentes sobre o efeito do MSCs em cânceres. Tem sido sugerido que o MSCs podem ter dois fenótipos distintos: "MSC1", um fenótipo de proinflammatory e "MSC2", um fenótipo imunossupressoras6. MSCs expressam receptores toll-like (TLRs). TLR4 escorva do MSCs aumenta sua secreção de fatores de proinflammatory, Considerando que o TLR3 escorva aumenta sua secreção de fatores imunossupressores6. Um estudo em vitro destes dois fenótipos relatou que uma cultura co de MSC1 com linhas de células de câncer atenuado o crescimento de células de câncer, enquanto MSC2 co-cultura teve o efeito oposto7. Isto implica que MSCs podem ser pro-câncer ou anticâncer, dependendo de seu fenótipo. Assim, além de desenvolver o modelo animal de HCC, usando a tecnologia de célula de folha, queremos explorar o efeito da MSC transplantes no desenvolvimento do tumor, e se usar essas células irão aumentar ou reduzir o desenvolvimento deste modelo.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM glicose alta</td>Penicilina/estreptomicina <td>Sigma</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina fisiológica estéril</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular HepG2 humana</td><td>ATCC, EUA</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular MSCs de medula óssea humana</td><td>PromoCell, EUA</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSCs de tecido do cordão umbilical humano</td><td>PromoCell, EUA&nbsp;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina 50%</td> <td>Rompun, Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 2%</td> <td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>Alphadine&reg; &nbsp; solução.</td><td>Riyadh Pharma</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td>Descartáveis:&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mL Polipropileno Alta Clareza PP Tubo de Centrífuga</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>placas de cultura UpCell estéreis de 3,5 cm com o papel de filtro (membrana)</td> <td>Sigma</td><td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; l &nbsp; Ponteiras de pipeta&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CLS4868-1000EA&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Campo de Procedimento Básico</td><td>Thermofisher</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>Equipment&nbsp; Pipeta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus, volume variável</td><td>Eppendorf&reg; &nbsp; Pesquisa&reg;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos 37 &deg; C, 5% CO2</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armário de segurança biológica</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos 20 &deg; C, 5% CO2</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas cirúrgicas estéreis e ratos nus:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bisturi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sutura de Nylon&nbsp; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>Monofilamento, Lanceta</td></tr><tr><td>1 ml Seringas de Tuberculina</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>Ratos nus&nbsp;</td><td>Rio</td><td></td><td></td> Charles</tr></tbody></table>

explorando o potencial das células-tronco mesenquimais folha sobre o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular na vivo

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Em vivo modelo animal que imita o câncer humano poderia ter vários aplicativos que oferecem informação clínica significativa. As técnicas atualmente utilizadas para o desenvolvimento de modelos de câncer na vivo tem limitações consideráveis. Portanto, neste estudo, pretendemos implementar tecnologia de folha de célula para desenvolver um modelo de câncer na vivo . Carcinoma hepatocelular (HCC) é desenvolvido com sucesso em ratos nus usando folhas de célula criadas a partir de células de linha celular HCC. Os lençóis de células de câncer são gerados através de adesão intracelular e a formação de uma estrutura estratificada, controlada pela matriz extracelular. Isto permite o transplante de folha do HCC para o fígado e a criação de um modelo animal de tumor-rolamento dentro de um mês. Além disso, o papel das células-tronco mesenquimais (MSC) no desenvolvimento deste modelo de câncer é investigado. Além da folha de linha celular HCC, outro folhas de duas células são criadas: uma folha de células HCC e medula óssea MSCs (BMMSCs) e uma folha de células HCC e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). Folhas com uma combinação de células HCC e MSCs também são capazes de produzir um animal de tumor-rolamento. No entanto, a adição de MSCs reduz o tamanho do tumor formado, e esse efeito adverso sobre o desenvolvimento do tumor varia de acordo com fonte do MSCs usados. Isto indica que uma folha de células de determinados subtipos MSC poderia ser utilizada no controle e gerenciamento do tumor.

Tumorigenicidade de lençóis de células transplantadas em ratos:
Um mês após o transplante, todas as folhas de célula transplantado em fígados de ratos desenvolveram tumores (Figura 3). O tamanho médio dos tumores desenvolvidos de HepG2, HepG2/BMMSC e folhas de célula HepG2/UCMSC foram 4,5 cm, 4 cm e 2,5 cm, respectivamente,10.
<p class="jove_content" fo:k...

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver um modelo câncer in vivo usando a tecnologia de célula de folha. Tal modelo poderia ser muito útil para a avaliação da terapêutica antineoplásica.

Explorando o potencial das células-tronco mesenquimais folha sobre o desenvolvimento do Carcinoma hepatocelular na Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Olá, sou o Dr. Alaa Alshareeda, do Centro Internacional de Pesquisa Médica Rei Abdullah do Departamento de Células-Tronco e Medicina Regenerativa. Hoje estaremos demonstrando o efeito das células-tronco mesenquimais no desenvolvimento de carcinoma hepatocelular em modelo de rato usando a tecnologia de folha de células. Olá, sou Abdullah Almubarak.Estou trabalhando em Cirurgia Experimental e Laboratório Animal na Universidade King Saud. Usamos o rato nu para evitar rejeições após o transplante da folha de células. Este diagrama mostra o procedimento de transplante de folha celular em ratos nus.Ratos nus de oito a 12 semanas de idade serão usados neste estudo. Primeiro, corte os ratos e faça um corte de sete a dez centímetros entre a pele e os músculos subjacentes usando bisturi para expor o fígado. Para transferir a folha de células, use uma membrana estéril.Coloque a membrana sobre a folha de células para coletá-la. Em seguida, coloque a folha de células com a membrana sobre um lobo do fígado. Construção da folha de célula.Antes de semear as células, cubra placas de cultura UpCell responsivas à temperatura de 3,5 centímetros com FBS não diluído. O revestimento de placas com FBS suporta o crescimento das células na camada de membrana e evita a degradação das células. Certifique-se de cobrir toda a superfície da louça.Incube os pratos por 24 horas a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono e 95% de ar. No dia seguinte, retire o excesso de FBS e deixe a loiça secar à temperatura ambiente durante pelo menos uma hora. Semeie pelo menos um milhão de células cancerígenas HepG2 isoladas ou co-cultivadas com células-tronco mesenquimais em meio de cultura DMEM.O meio suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. A proporção usada de células cancerígenas para células-tronco mesenquimais neste estudo é de 4:1. Depois de adicionar as células, agite suavemente os pratos.Incube as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono e 95% de ar. Descolamento da folha de célula. A 100% de confluência celular, retire os pratos da incubadora de 37 graus Celsius.Agora, incube a folha de células cancerígenas HepG2 por uma hora em temperatura ambiente, enquanto incuba a HepG2 co-cultivada com células-tronco mesenquimais por 30 a 40 minutos a 20 Celsius em uma atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de carbono a 95% de ar. Durante o tempo de incubação para o desprendimento da folha de células, inicie o procedimento animal. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade King Saud.Realização do procedimento cirúrgico. Verifique a profundidade da anestesia testando o reflexo de retirada do pedal. Desinfete a área de cirurgia com iodo.Agora, aplique um segundo esfoliante com iodo. Cubra o animal com uma cortina esterilizada para evitar a contaminação da incisão. Usando um bisturi esterilizado, faça um corte entre a pele e os músculos subjacentes, com cerca de sete a dez centímetros de tamanho para expor o fígado.Separe o músculo abdominal da pele com a borda traseira plana do bisturi. Esfaqueie cuidadosamente a linha alba com um bisturi e estenda o corte com uma tesoura afiada. Transplante de folha celular em fígado de rato.Bata suavemente a placa de cultura sobre a bancada para separar a folha de sua superfície. Separe a folha de células da superfície do prato raspando as bordas da folha em um semicírculo. Agora, remova delicadamente todo o meio de cultura do prato.Certifique-se de que a folha esteja intacta sem danos, caso contrário, ela não poderá ser usada. Prepare uma membrana estéril para colher e transferir a folha de células. Então, primeiro, molhe a membrana com solução salina normal e, em seguida, remova o excesso de solução salina com um cotonete estéril.Coloque a membrana úmida sobre a folha de células, evitando bolhas de ar entre a membrana e a folha de células. Adicione algumas gotas de solução salina normal sobre a membrana e a folha de células para coletar o material. Deixe a membrana por alguns segundos para garantir que a folha de célula esteja devidamente presa à membrana e, em seguida, colete-a.Agora, prepare o fígado para o transplante. Certifique-se de que a superfície do fígado esteja seca. Coloque a membrana com a folha de células sobre um único lobo do fígado do rato.Adicione algumas gotas de solução salina esterilizada para separar a folha de células da membrana. Aguarde cinco minutos antes de remover cuidadosamente a membrana. A folha de células pode ser vista anexada no fígado neste vídeo.Finalmente, feche os músculos subjacentes e as incisões na pele com cinco suturas de náilon. Após fechar a incisão, desinfete a área da cirurgia com betadine. O tempo entre o desligamento do anestésico e a cabeça levantada é variável, mas geralmente fica entre cinco e 20 minutos.Esta figura mostra o tumor desenvolvido no fígado de ratos após um mês de transplante de folha de células HepG2. Aqui, o tumor foi desenvolvido após o transplante de células cancerígenas HepG2 fabricadas em folha celular e células-tronco mesenquimais da medula óssea. Considerando que este mostra, o menor tumor desenvolvido no fígado de rato após o transplante de folha de células fabricada a partir de células cancerígenas HepG2 e células-tronco mesenquimais do cordão umbilical, Esta figura mostra a coloração H e E do fígado de rato após um mês do transplante de folha de células.Onde A representa células normais do fígado de rato e B mostra células hepáticas de rato com câncer. Conclusão. Então, depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de desenvolver um modelo de carcinoma hepatocelular em rato nu usando a tecnologia de folha de células. Obrigado por assistir.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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o<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Corioalantóide membrana (CAM) como um Ensaio Xenoenxerto modelo eficiente de carcinoma hepatocelular

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A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

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