Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro
6 de março de 2019
Nós descrevemos três métodos experimentais para avaliar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos em vitro: quantificação do conteúdo de atividade e 2) melanina tirosinase 1) celular e 3) medição de melanina por celular melanina mancha e análise de imagem.
Este método pode ser útil no desenvolvimento de cosméticos funcionais e agente de pele com atividades anti-melanógenas. Está lá para realizar e o resultado pode ser obtido rapidamente. Além disso, esse método pode ser útil para pesquisadores, que querem identificar ou investigar os efeitos ou os compostos ou investigar as atividades anti-melanoma ou promelanogênicas.
Para medir a atividade tyrosinase comece semeando Melanicidas B16-F10 a cinco vezes 10 para as quatro células por poço de uma concentração de placa de 24 poços em meio completo por 24 horas em uma incubadora de cultura celular. No dia seguinte, substitua o supernaente em cada poço por DMEM complementado com composto de teste recém-preparado e controle inibidor ou um controle negativo e devolva a placa à incubadora por mais 72 horas. No final do tratamento enxágue os poços duas vezes com 300 microliters de pbs frios por poço e coloque a placa no gelo.
Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de lise a cada poço usando um raspador de células para coletar os lises celulares após cinco minutos. Transfira as suspensões de partículas celulares resultantes para tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro. E homogeneize os lises três vezes por dois segundos a 14,500 rpm no gelo para liberar o Tyrosinase intercelular.
Pellule os detritos celulares por centrifugação e transfira os supernantes para tubos individuais de centrífugas de 1,5 mililitro no gelo. Aloque 70 microlitros de cada supernaente para poços individuais de uma micro placa de poliestireno clara de 96 poços e adicione 140 microlitros de solução de substrato de Tyrosinase a cada poço de supernascer. Agitando a placa suavemente para misturar o conteúdo do poço.
Em seguida, incubar a placa a 37 graus celsius por duas horas. E meça a atividade tyrosinase em 475 nanômetros em um leitor de microplato. Para medir o teor de melanina das células após a coleta do lysate das células tratadas como demonstrado.
Colete os lises por centrifugação e transfira os supernantes para novos tubos. Adicione 300 microliters de um hidróxido de sódio normal a cada pelota para uma incubação de uma hora a 60 graus Celsius. Seguido pela centrifugação das suspensões de células dissolvidas.
Em seguida, transfira 200 microliters dos supernantes para cada poço de uma placa de 96 poços. E meça o conteúdo da melanina em um leitor de microplaca a um comprimento de onda de 400 nanômetros. Para fontana-masson Staining, lave as células tratadas duas vezes com 300 microliters de pbs frios e fixe as células com 200 microliters de 10% formalina por uma hora a quatro graus Celsius.
Enxágüe as células grossas com água destilada e adicione 200 microlitros de 58 a 68 graus celsius solução de trabalho de prata ammoniacal para cada poço. Para uma hora de incubação a 37 graus Celsius ou até que as células se tornem amarelas-marrons na cor. Enxágüe as células manchadas com água destilada seguida de incubação de dois minutos em cloreto de ouro de 0,1% à temperatura ambiente.
Enxágüe as células tratadas com cloreto de ouro com água destilada e adicione 200 microliters de solução de tiossulfato de sódio às células. Depois de dois minutos enxágue as células novamente. E rotular as células com 200 microliters de vermelho nuclear rápido por poço por cinco minutos.
Em seguida, lave as células manchadas com água da torneira antes de imaginar sob um microscópio leve. Para análise de limiar, abra as imagens na imagem J e selecione imagem, ajuste e Limite de cores. Para medir a área manchada com Fontana Masson, ajuste a barra do parâmetro de brilho a zero e ajuste o brilho ao ponto em que todas as células manchadas pretas ou marrons estão incluídas.
Selecione Analisar e analisar partículas e verificar a caixa de resumo na janela Analisar partículas e clique bem para obter um resumo dos resultados e copie e cole os dados em uma planilha. O tratamento com arbutina suprime significativamente a atividade de Tyrosinase celular em comparação com as células tratadas com veículos de controle. Da mesma forma, o teor de melanina das células estimuladas com Arbutin é significativamente reduzido em comparação com os controles.
Embora as células sejam morfologicamente semelhantes entre os grupos de tratamento, a arbutina diminui a área do pigmento negro em comparação com as células tratadas de controle. Este método é útil para a triagem de atividades usando nossa biblioteca composta. Há mais de centenas de amostras para serem testadas rapidamente.
Além disso, este método também pode ser usado para investigar o mecanismo que envolve a melanogênese. Após a identificação dos compostos de candidatos bioativos, para seu testemunho do estudo de mecanismos biológicos ou aplicações comerciais.
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Visão Geral
Este artigo descreve três métodos experimentais para avaliar in vitro a atividade hipopigmentante de substâncias quím游戏副本
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Ciência Cosmética
Antecedentes
- Compreender a hipopigmentação é fundamental para o desenvolvimento de agentes dermatológicos.
- A tirosinase desempenha um papel fundamental na produção de melanina.
- Métodos in vitro permitem a avaliação rápida dos efeitos químicos.
- A identificação de atividades antimelanogênicas pode auxiliar na formulação cosmética.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a atividade hipopigmentante de diversos compostos químicos.
- Fornecer uma metodologia rápida e eficaz para pesquisadores.
- Facilitar o desenvolvimento de cosméticos funcionais.
Métodos Utilizados
- Placamento de melanócitos B16-F10 em uma placa de 24 poços.
- Substituição do sobrenadante por DMEM e compostos em teste.
- Incubação das células por 72 horas após o tratamento.
- Enxágue dos poços com PBS frio para análises subsequentes.
Resultados Principais
- Os métodos quantificam efetivamente a atividade da tirosinase.
- O teor de melanina pode ser medido com precisão.
- A coloração celular fornece confirmação visual dos resultados.
- Os resultados podem ser obtidos rapidamente para pesquisas posteriores.
Conclusões
- Os métodos descritos são confiáveis para avaliar hipopigmentação.
- Eles podem auxiliar no desenvolvimento de produtos antimelanogênicos.
- Essas técnicas são benéficas para pesquisadores da área.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa in vitro da atividade hipopigmentante permite a redução de riscos em estágios iniciais de compostos candidatos que visam a melanogênese. A medição confiável da atividade da tirosinase e do teor de melanina sustenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes para portfólios de P&D dermatológicos e cosméticos. Esses ensaios fornecem uma base padronizada para triagem e avaliação mecanicista antes do avanço translacional ou pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à inibição da melanogênese.
- Apoia a validação funcional de alvos como a tirosinase na regulação do pigmento.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas mediante a quantificação de efeitos bioquímicos diretos.
- Fornece parâmetros quantitativos para triagem de agentes hipopigmentantes em portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece ensaios validados e reprodutíveis para triagem em alta produtividade de bibliotecas de compostos.
- Padroniza a medição da atividade da tirosinase e do teor de melanina para permitir a comparabilidade entre ensaios.
- Permite avaliação rápida e quantitativa de atividades anti-melanogênicas e pró-melanogênicas.
- Apoia a reutilização da plataforma para triagem de produtos químicos diversos e produtos naturais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas in vitro com vias relevantes para doenças em distúrbios da pigmentação.
- Oferece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica de agentes candidatos.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em saídas bioquímicas quantitativas.
- Facilita estudos mecanicistas da atividade, crescimento e diferenciação de melanócitos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esses ensaios in vitro inserem-se na fase inicial da descoberta até a identificação de compostos líderes, permitindo triagem rápida e avaliação mecanicista antes dos estudos pré-clínicos.
- Descoberta Biológica: Quantifica a inibição da tirosinase e da síntese de melanina para esclarecer o envolvimento da via.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para comparação e priorização de compostos.
- Análises: Oferece leituras espectrofotométricas e baseadas em imagens para análise estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados mecanicistas in vitro a modelos pré-clínicos de pigmentação.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalonável para avaliação contínua de compostos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de melanogênese.
- Valor Operacional: Permite a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios para grandes conjuntos de compostos.
- Valor Estratégico: Apoia decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e a gestão eficiente de portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos a hipopigmentação.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células, espectrofotometria e análise de imagens.
- Necessita acesso a leitores de microplacas, sistemas de imagem e software analítico.
- Exige padronização entre equipes para comparabilidade dos ensaios e integridade dos dados.
- Adaptável a diversos modelos de melanócitos e classes de compostos.
- Os resultados in vitro podem não prever completamente os resultados in vivo ou clínicos.
