Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

A regulação da sinalização do complexo eIF4F está associada ao aumento da tradução do subconjunto de mRNA que está envolvido na proliferação e sobrevivência do câncer. Aqui descrevemos um ensaio de interação proteína-proteína baseado em células eIF4E-eIF4G que nos permite avaliar a perturbação induzida por drogas na integridade do complexo eIF4F em células vivas. Há um interesse crescente no desenvolvimento de modalidades que visem eficientemente a interface proteína-proteína.

Imaginamos que nossos ensaios eIF4E-eIF4G PPI ajudarão a promover essas estratégias e validá-las. Este ensaio fornecerá um esquema primário ideal para liderar a otimização dos inibidores de eIF4E-eIF4G. A semeadura correta da célula e a realização da transfecção de transferência são os aspectos mais desafiadores deste produto, pois podem refletir diretamente na supressão do sistema de notificação de IBP.

Após descongelar e contar as células, semeie placas de 6 poços com células HEK 293, usando 2 mililitros de meio de crescimento padrão por poço. Na manhã do dia 2, para cada transfecção planejada, diluir 9 microlitros de solução à base de lipossomas em um tubo contendo 125 microlitros de meio sérico reduzido sem vermelho de fenol. Enquanto os lipossomas diluídos incubam à temperatura ambiente durante 5 minutos, preparar a mistura principal de ADN diluindo 3 microgramas de cada plasmídeo em 125 microlitros de meio sérico reduzido para cada tubo de transfecção.

Adicione 12 microlitros de reagentes intensificadores ao DNA master mix 2 e misture bem. Adicione imediatamente esta mistura a cada tubo de lipossomas diluídos na proporção de 1 para 1. Depois de incubar este complexo lipídico de DNA por 15 minutos à temperatura ambiente, adicione o complexo a cada poço das placas de 6 poços.

Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Na manhã do dia 3, enxágue cada bem com 1 mililitro de PBS e adicione 0,3 mililitros de tripsina. Incube as placas a 37 graus Celsius por 5 minutos.

Após a incubação, neutralize a tripsina adicionando 2 mililitros a cada poço do meio sérico reduzido sem vermelho de fenol. Transfira as células transfectadas para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 290x G por 5 minutos.

Aspire o meio e ressuspenda o sedimento celular em 2 mililitros do meio sérico reduzido. Semear as células HEK 293 transfectadas em placas opacas de 96 poços, a uma densidade de 30.000 células por poço em 90 microlitros de meio. Para obter 3 repetições técnicas para 3 compostos diferentes dentro do mesmo experimento, semeie 60 poços.

Exclua os poços nas bordas. Imediatamente após a semeadura das células transfectadas, adicione 10 microlitros de solução composta de DMSO a 10% em cada poço. Prepare soluções de estoque compostas de 1 milimolar dissolvendo cada composto de interesse em 100% de DMSO.

Para ter 3 repetições para cada titulação composta, use 8 microlitros da solução estoque de composto 1 milimolar. Realize uma diluição serial dupla de cada solução composta de estoque em 8 poços de uma placa de PCR de 96 poços, pipetando 4 microlitros do estoque de 1 milimolar em 4 microlitros de 100% DMSO para cada ponto de titulação. Rejeitar os 4 microlitros excedentes após o último ponto da diluição em série dupla.

Adicione 36 microlitros de água estéril de grau HPLC a cada tubo para preparar 40 microlitros de soluções de diluição seriais compostas 10x em 10% DMSO. Além disso, prepare um controle. 10% DMS apenas solução de estoque em água estéril de grau HPLC.

Adicione 10 microlitros de soluções de trabalho 10x às células na placa opaca de 96 poços para obter a concentração final pretendida, com uma concentração residual de DMSO de 1% Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 3 horas. Após 3 horas, comece a preparar o reagente de substrato de luciferase combinando 1 volume de substrato com 19 volumes de reagente de diluição. Use uma pipeta multicanal para adicionar imediatamente 25 microlitros do reagente de substrato a cada poço da placa de 96 poços com as células.

Agite a placa em um agitador orbital a 350 RPM, por 50 minutos em temperatura ambiente. Para avaliar a luminescência, coloque a placa em um leitor de placas. Defina o leitor de espelho para luminescência e o filtro de emissão para 455.

Use uma altura de medição de 6,5 milímetros com um tempo de medição de 1 segundo. Para avaliar a viabilidade celular, adicione 33 microlitros de reagente de ensaio de viabilidade a cada poço. Após 15 minutos à temperatura ambiente, avalie a luminescência com o leitor de placas, ajustando o leitor de espelho para luminescência e o filtro de emissão para 600.

Use uma altura de medição de 6,5 milímetros e um tempo de medição de 1 segundo. Use os dados do leitor de placas para determinar o valor IC 50 de cada composto, ajustando os dados à equação da curva de ajuste de 4 parâmetros descrita no manuscrito. As células HEK 293 foram transfectadas com o sistema de complementação eIF4E-eIF4G e, em seguida, retraídas e tratadas com inibidores de mTOR.

Quando a luminescência foi avaliada 4 horas após o tratamento, o PP242 e a rapamicina produziram uma inibição do sinal dependente da dose. Nem o PP242 nem a rapamicina produziram uma diminuição significativa na viabilidade celular, indicando que a diminuição da luminescência no sistema de complementação eIF4E-eIF4G não se deve à morte celular inespecífica, mas sim à interrupção da interação EIF4E-4G. A análise de Western blot, após o experimento de pull down de m7GTP, mostrou que a interrupção mediada por 4EBP1 da interação endógena eIF4E-eIF4G se correlaciona com o sinal de ensaio eIF4E-eIF4G medido.

O PP242 foi um inibidor mais potente da fosforilação total de 4EBP1 do que a rapamicina. Ambos os inibidores mostraram um impacto na sinalização normal do mTOR, com a rapamicina sendo mais ativa contra substratos do mTORC1 e o PP242 visando tanto o mTORC1 quanto o mTORC2. O aspecto mais crítico deste produto é semear as células no dia da transação, semear novamente as células em um meio sem vermelho de fenol, avaliar a luminescência do ensaio de complementação eIF4E-eIF4G e executar o ensaio de viabilidade na mesma placa.

Um ensaio de viabilidade secundária pode ser realizado para avaliar qualquer medicamento alvo e efeitos específicos conhecidos.