Name: Geração organoide do nervo motor tridimensional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a gerar organoides de nervo motor tridimensionais a partir de células iPS humanas usando microchips PDMS. Este método permite estudar o desenvolvimento de feixes axonais e triagem de fármacos para doenças do neurônio motor.

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Este estudo foi apoiado pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 e 18K19903, Core-2-core e Beyond AI institute.

<ol><li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li>
<li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
<li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Src%2Fc-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li>
<li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+axons+tell+each+other%3A+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li>
<li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li>
<li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421(2018).</li>
<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li>
<li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li>
<li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li>
<li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).</li>
<li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

Em parte deste protocolo, uma patente foi licenciada para jiksak bioengenharia, Inc. que foi fundada por Jiro Kawada.

Este protocolo descreve a formação de um organoide nervoso motor (MNO) que tem um feixe de axônio estendido a partir de um esferoide de neurônio motor gerado a partir de células iPS humanas. O pacote de axônio formado é espesso, flexível e bem organizado em estruturas unidirecionais. Ao dissecar o feixe de axônio, a proteína axonal de alta pureza e o RNA podem ser obtidos suficientemente para análises bioquímicas. A atividade neuronal pode ser medida em feixes de axônio e esferoides com imagem de cálcio. A contaminação de proteínas nucleares e dendríticas no liseto axonal não foi detectada pela mancha ocidental, demonstrando que nosso método separou eficientemente os axônios dos corpos celulares e dendritos.
Uma das vantagens deste protocolo é a rápida diferenciação e geração de MNO equipado com um pacote de axônio, no qual todos os processos podem ser feitos em 4 semanas com o protocolo 3D e 5-6 semanas usando o protocolo 2D. Isso é curto em comparação com outros protocolos que normalmente levam de 3 a 4 semanas para simplesmente se diferenciar em MN de células-tronco embrionárias e células iPS17 e leva mais 2-4 semanas para obter alongamento axonal. O protocolo 3D é geralmente preferido em relação ao protocolo 2D devido ao menor tempo de diferenciação, menos etapas e riscos técnicos reduzidos sem a etapa de dissociação em comparação com o protocolo 2D. O chip de cultura tecidual baseado em microfluidic foi projetado de forma que os axônios de MNS possam alongar em direção ao outro compartimento através do microcanal, o que facilita a formação de um feixe de axônios induzindo interações axo-axonanas e afinidade entre axônios. Por causa da simples configuração experimental, todos os protocolos descritos aqui podem não apenas ser realizados por bioengenheiros, que estão familiarizados com a manipulação de um chip de cultura tecidual, mas também biólogos e neurocientistas que não estão familiarizados com microfluidos e técnicas de microfabúcia. Deve-se notar que as etapas 1 e 2 também podem ser realizadas utilizando um serviço de fabricação externa.
Um dos passos críticos para a realização do protocolo é uma mudança sequencial do meio cultural. Aconselhável mudar completamente o meio de cultura a cada etapa durante a diferenciação para que fatores no meio gasto não perturbem a diferenciação de MN. Outro ponto crítico deste protocolo é manter células iPS indiferenciadas em boa qualidade. A qualidade da cultura celular iPS inicial afeta significativamente a eficiência para a obtenção de neurônios motores e MNO. Outro ponto é que o diâmetro do MNS deve ser menor do que o tamanho do orifício do chip (1,5 mm). Esferoides maiores não podem entrar na câmara, e potencialmente experimentam necrose hipóxica grave na parte central. O tamanho dos MNSs pode ser controlado alterando um número inicial de semeadura de células iPS (em protocolo 3D) ou neurônios motores (em protocolo 2D). A densidade de semeadura das células deve ser otimizada para cada linha celular iPS.
Dispositivos microfluidos compartimentados com microgrooves e pequenos filtros de poros têm sido amplamente utilizados para separar axônios de corpos celulares e dendritos. Esta técnica também pode separar axônios de corpos celulares e dendrite, com abundância superior de axônios em tecidos empacotados. Em comparação com os outros métodos, uma das principais limitações deste método é que ele não pode separar duas mídias culturais diferentes no desenho atual do chip de cultura tecidual, o que dificulta a capacidade de co-cultura de duas células diferentes que requerem duas mídias distintas. Outra limitação é que o chip PDMS colocou restrição predeterminada no tamanho do tecido. Um esferoide maior que o orifício não pode entrar na câmara, e o feixe de axônio não pode crescer mais grosso do que a largura do canal microfluido.
Este método pode ser aplicado a outros tipos de neurônios. Nosso grupo mostrou capacidade para modelar um trato cerebral usando um método modificado combinado com técnicas organoides cerebrais18. Esferoides corticais foram introduzidos em ambos os compartimentos e os axônios espontaneamente alongados reciprocamente em direção a cada esferoide, e posteriormente um feixe de axônio formado espontaneamente. Como resultado, dois esferoides cortical podem ser conectados através de um feixe de axônio, e o tecido poderia ser obtido como uma peça. Isso demonstra que a abordagem é altamente versátil para formar tecidos de feixe de axônio, independentemente dos tipos de células neuronais. Neste protocolo, foram utilizadas células iPS humanas, no entanto, outras células-tronco, incluindo células-tronco humanas e células-tronco neurais humanas, podem ser usadas com modificações no protocolo apresentado. Esferoides 3D de neurônios podem ser gerados por diversos protocolos19,20. Este método de fabricação de tecidos com um feixe de axônio pode potencialmente ser combinado no futuro com os outros protocolos de diferenciação para fazer esferoide 3D MN. Além disso, a espessura e o comprimento do feixe de axônio podem ser controlados simplesmente alterando a largura e a altura dos microcanais do chip de cultura tecidual para desenvolvimentos futuros.
Acreditamos que este protocolo pode ser usado para testes e rastreamento de drogas e pode contribuir para a compreensão dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e doenças dos fascicles de axônio.

Os neurônios motores espinhais (MN) estendem os axônios aos músculos esqueléticos para controlar o movimento corporal. Suas trajetórias axonal são altamente organizadas e reguladas no processo de desenvolvimento. Apesar de muitos estudos sobre extensão de axônio e orientação1,os mecanismos de formação organizada de axônio ainda estão sendo investigados. Axônios de neurônios motores são frequentemente danificados por doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)2, mas mecanismos fisiopatológicos dos danos nos fascicles de axônio são mal compreendidos. Assim, é necessário um modelo fisiológico e patológico para recapitular a formação e regressão do feixe de axônio no campo.
Um neurônio motor derivado de células-tronco humanas é uma plataforma promissora para entender o desenvolvimento e doenças como a ALS3. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (células iPS) podem ser usadas para modelar doenças usando células derivadas do paciente. Até o momento, vários métodos de diferenciação de células-tronco pluripotentes em MN foram relatados4,5,6. No entanto, os axônios dos neurônios na cultura bidimensional são orientados aleatoriamente e não recapitulam o microambiente in vivo dentro dos nervos em desenvolvimento nos quais os axônios são montados unidiretamente através de densas interações axo-axonanas7. Para superar essa questão, desenvolvemos uma técnica para gerar um tecido tridimensional semelhante ao nervo motor a partir das células iPS humanas8, e nomeamos o tecido como organoide do nervo motor (MNO). O MNO consiste em corpos celulares localizados em um esferoide de neurônio motor (MNS) e um fascicle axonal estendido do esferoide. Os axônios no fascicle são unidiretamente orientados, que se assemelha a axônios no desenvolvimento de nervos motores. Assim, os MNOs fornecem exclusivamente um microambiente axonal fisiológico, o que não foi feito por nenhum outro método de cultura neuronal previamente desenvolvido.
Neste protocolo, descrevemos métodos para fabricação de chips de cultura tecidual, rápida diferenciação de neurônios motores e formação organoide do nervo motor em chips desenvolvidos. Nosso chip de cultura tecidual é muito simples, e contém apenas um compartimento para aceitar um esferoide, um microcanal para formar um feixe de axônio, e um compartimento para abrigar terminais de axônio. O dispositivo não contém estruturas complexas, incluindo microvalhões ou filtros de microporos que muitas vezes são usados para separar axônios e corpos celulares pelo tamanho9,10. Assim, nossos dispositivos podem ser facilmente fabricados seguindo as etapas descritas neste protocolo se uma configuração de fotolitografia estiver disponível.
A rápida diferenciação das células iPS humanas é alcançada com uma combinação otimizada de fatores de indução e padronização (SB431542, LDN-193189, ácido retinóico (RA) e agonista suavizada (SAG)) e fatores de aceleração (SU5402 e DAPT). Foi relatado que a combinação de SU5402 e DAPT acelera a diferenciação de neurônios periféricos e células de crista neural11. Neste protocolo, oferecemos três métodos diferentes para gerar MNOs, para que os leitores possam decidir sobre um método mais adequado às suas necessidades. Recomendamos a realização da diferenciação das células iPS humanas após a formação de um esferoide (o método 3D), uma vez que o MNS diferenciado pode ser transferido diretamente para um chip de cultura tecidual. Alternativamente, as células iPS humanas podem ser diferenciadas em neurônios motores na cultura monocamada (2D) e, em seguida, criadas em esferoides de neurônio motor tridimensional, como relatamos anteriormente8. Atualizamos o protocolo, e com o método de diferenciação tridimensional descrito neste protocolo, a transição do 2D para o 3D pode ser evitada e os MNOs podem ser obtidos com menor tempo de diferenciação, menos etapas e riscos técnicos reduzidos sem a etapa de dissociação. Neurônios disponíveis comercialmente também podem ser usados para gerar MNS para reduzir o tempo de diferenciação.
Para gerar um MNO, nós cultuamos um MNS no chip de cultura de tecidos. Os axônios alongam-se do esferoide e estendem-se para o microcanal no qual os axônios se reúnem e se alinham unidiretamente. Isso facilita a interação axonal e a formação espontânea de um tecido de axônio unidirecional bem montado no microcanal, que é alcançado exclusivamente por este protocolo, enquanto a formação espontânea do feixe ou a orientação axonal guiada por si só pode ser alcançada por outros protocolos12,13,14. Em um experimento típico, poucas células migram de esferoides para o microcanal e a maioria das células permanece nas proximidades. Este método permite que os axônios sejam espontaneamente separados dos esferoides sem o uso de barreiras físicas dependentes de tamanho (por exemplo, microgrooves ou filtros de microporos) para separar axônios dos corpos celulares.
O MNO resultante pode ser submetido a diversos exames, incluindo análises morfológicas, bioquímicas e físicas. O corpo celular e o feixe de axônio estendido podem ser fisicamente isolados pelo corte e podem ser analisados separadamente para experimentos a jusante, por exemplo, ensaios bioquímicos. Materiais biológicos, incluindo RNA e proteína, podem ser isolados de apenas alguns feixes de axônio para ensaios bioquímicos regulares, incluindo RT-PCR e manchas ocidentais. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de organoide nervoso motor a partir de células iPS, que oferece um modelo fisiológico e patológico atraente para estudar o mecanismo de desenvolvimento subjacente e doença dos fascicles de axônio.

<table><tbody><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)-1-triclorosilano</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>16% Solução aquosa de paraformaldeído (formaldeído)</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200&micro; l Pontas de pipeta de diâmetro largo</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS</td> Placas de 6 poços <td></td></tr><tr><td></td><td>Violamo</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X)</td> <td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)</td> <td>Wako</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento reduzido Matrigel (matriz da membrana basal)</td> <td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HB9 Anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-22542</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Neurônio motor iCell (neurônios motores derivados de células iPS humanas disponíveis comercialmente)</td> <td>Dinâmica Celular</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico (IPA)</td><td>Wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Substituição de Soro</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sonda</td><td>Sigma SML0559</td><td></td></tr><tr><td>MEA Alpha</td><td>MED Scientific inc</td><td>MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x) (NEAA)</td><td>Vidro de Microscópio Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Matsunami</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Wako</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fotorresistente SU-8 2100</td><td>Microchem</td><td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>Superfície primária 96U</td><td>Sumitomo Baquelite</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR (reagente de passagem)</td> <td>Stem Cell Technologies</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Wako</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Sigma</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>Bolacha de silício</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>Silpot 184 w / c kit</td><td>Dow Toray</td><td>Silpot 184 com kit</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Desenvolvedor</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin I Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express líquido sem vermelho de fenol (solução de dissociação)</td> <td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

geração organoide do nervo motor tridimensional

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Um fascicle de axônios é um dos principais motivos estruturais observados no sistema nervoso. A interrupção dos fascicles de axônio pode causar doenças desenvolvitórias e neurodegenerativas. Embora inúmeros estudos de axônios tenham sido conduzidos, nosso entendimento da formação e disfunção de fascicles de axônio ainda é limitado devido à falta de modelos in vitro tridimensionais robustos. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para a rápida geração de um organoide nervoso motor (MNO) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS) em um chip de cultura de tecido baseado em microfluidic. Em primeiro lugar, descreve-se a fabricação de chips usados para o método. A partir de células iPS humanas, forma-se um esferoide de neurônio motor (MNS). Em seguida, o MNS diferenciado é transferido para o chip. A partir daí, os axônios crescem espontaneamente do esferoide e se reúnem em um fascículo dentro de um microcanal equipado no chip, o que gera um tecido MNO carregando um feixe de axônios estendidos do esferoide. Para a análise a jusante, os MNOs podem ser retirados do chip para serem fixados para análises morfológicas ou dissecados para análises bioquímicas, bem como imagens de cálcio e gravações de matriz de vários eletrodos. Os MNOs gerados com este protocolo podem facilitar o teste e rastreamento de medicamentos e podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento subjacente e doenças dos fascicles de axônio.

Os neurônios motores foram diferenciados dentro de 12-14 dias em procedimentos de diferenciação 3D(Figura 4 e Figura 5). É importante ressaltar que mais de 60% das células expressaram o marcador de neurônio motor HB9 durante a diferenciação. A imunohistoquímica revelou que aproximadamente 80% das células no MNS eram neurônios motores SMI32 positivos. HB9 e SMI32 são os marcadores de neurônio motor em estágio inicial estabelecidos15,16. A expressão de HB9 e SMI32 são os parâmetros-chave que precisam ser confirmados para garantir a identidade celular dos neurônios motores. Após a introdução de um MNS no chip de cultura, os axônios se estendem para o canal e um pacote de axônio se forma. Devido aos microcanais que servem como guias físicos, os axônios alongam-se do MNS e formam um pacote por interação axo-axonal(Figura 6A). É essencial confirmar a formação do feixe de axônio por observação microscópica para confirmar a geração de um MNO. Um MNO bem sucedido carrega um pacote de axônio maior que 50 μm e poucos axônios isolados fora do feixe no canal. O alongamento inicial dos axônios pode ser observado 24 horas após a introdução do esferoide. Nos próximos 3-4 dias, os axônios chegaram ao centro do microcanal e, em seguida, chegam à outra extremidade dentro de mais 10 dias(Figura 6A). Consequentemente, os axônios montaram e formaram um feixe reto e unidirecional em 2-3 semanas em um chip, e atividades neuronais foram observadas posteriormente.
Organoides do nervo motor podem ser coletados do chip desvinculando o PDMS do vidro do microscópio para análise biológica(Figura 6B). Pacotes de axônio e corpos celulares podem ser dissecados e isolados cortando usando uma faca cirúrgica ou pinça sob um microscópio(Figura 6B). Esses materiais biológicos, incluindo RNA e proteína, podem ser usados para ensaios bioquímicos regulares, como RT-PCR e mancha ocidental. Em feixes de Axônio de MNOs, proteínas fabricantes nucleares ou dendríticas não são detectadas em manchas ocidentais(Figura 6C).
Em combinação com um indicador de cálcio (Fluo-4 AM), a atividade neuronal pode ser capturada no chip de cultura tecidual. A atividade espontânea dos neurônios motores no esferoide e no feixe de axônio foram observadas dentro do MNO. Além disso, as atividades neurais foram observadas utilizando-se um sistema de matriz multi-eletrodo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figura 1: A dimensão do chip de cultura tecidual PDMS. (A) Fotomask do chip de cultura tecidual. (B) Dimensões do microcanal no chip de cultura tecidual. O diâmetro da câmara base para segurar o esferoide do neurônio motor é de 2 mm e o orifício de PDMS acima da câmara é de 1,5 mm. A largura e a altura de um microcanal de duas câmaras são de 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figura 2: Ilustração esquemática da diferenciação do neurônio motor. (A) As etapas de diferenciação envolveram indução neural, padronização na linhagem de neurônios motores e maturação de neurônios motores. (B) Duas opções para criar esferoide de neurônio motor (MNS) a partir de células iPS: protocolo 3D, e um protocolo 2D com etapa de dissociação de neurônios motores. Organoide do nervo motor (MNO) pode ser obtido por ambos os protocolos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figura 3: Protocolo passo a passo para revestimento da matriz da membrana do porão e introdução de esferoides de neurônios motores. (A) Revestimento da matriz de membrana do porão no canal do chip de cultura tecidual. (B) Introdução MNS no orifício do chip. (C) Cultura média de mudança por aspiração de meio exausto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figura 4: Diferenciação de neurônio motor 2D e 3D. (A) Curso de tempo de diferenciação 3D MNS representativa (protocolo 3D). O tamanho do MNS aumentou gradualmente ao longo do tempo. Barra de escala: 500 μm. (B) Curso de tempo de diferenciação 2D em -D2, D0, D1, D6, D12 (protocolo 2D). Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figura 5: Caracterização dos neurônios motores. (A) (Esquerda) Uma crioseção de um MNS manchado com anticorpo SMI-32 e DAPI. (Meio) Uma imagem de contraste de fase de MNS replalado em uma superfície revestida de matriz de membrana do porão. Observou-se alongamento axonal. (À direita) Axons de MNS repladados manchados com anticorpos Synapsin I e Tuj1. Barra de escala: 500 μm (Esquerda e Médio) e 50μm (Direita). (B) Uma imagem representativa de neurônios motores 2D imunossuou com anticorpos Tuj e HB9. Barra de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figura 6: Caracterização de um organoide nervoso motor (MNO) gerado em um chip de cultura. (A) Imagens representativas do alongamento do axônio e da formação de feixe de axônio espesso na D32. Barra de escala: 500 μm. (B) Imunostaining de organoide nervoso motor (MNO) por SMI-32 e DAPI. Axônios e corpos celulares podem ser isolados cortando fisicamente. Barra de escala: 1 mm. (C) Pureza da proteína de axônios e corpos celulares quantificado por mancha ocidental. MAP2, um marcador dendrático, não foi detectado em proteína axonal, enquanto o marcador axonal Tau1 é enriquecido na proteína axonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo fornece um procedimento abrangente para fabricar organoide nervoso motor derivado de células iPS humanas através da montagem espontânea de um robusto feixe de axônios estendidos de um esferoide em um chip de cultura tecidual.

Geração organoide do nervo motor tridimensional

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Este protocolo facilita a investigação dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e à doença dos feixes axonais usando organoides nervosos motores derivados das células iPS humanas fora dos corpos. Simplesmente cultivando esferóides neuronais e chips de microcultura personalizados, feixes de axônios unidirecionais podem ser gerados espontaneamente e usados para vários experimentos a jusante. O organoide do nervo motor pode facilitar a triagem e o teste dos medicamentos para doenças do neurônio motor, incluindo o LS, fornecendo um modelo mais fisiológico que são sistemas in vitro anteriores.Em uma capela de exaustão e usando o EPI apropriado, dispense três mililitros de SU-8 2100 em um wafer de silício limpo com acetona e coloque o wafer no centro de um revestidor giratório. Fixe o wafer por vácuo e gire o wafer a 500 rotações por minuto por 10 segundos para revestir o SU-8 uniformemente na superfície do wafer e, em seguida, gire o wafer a 1.500 rotações por minuto por 30 segundos com uma aceleração de 300 rotações por segundo para obter uma camada de fotorresistente de 150 mícrons de espessura no wafer. Após o cozimento suave, coloque a fotomáscara no alinhador de máscara e exponha o wafer à luz ultravioleta por 60 segundos.Após assar em uma placa quente, desenvolver o wafer por 10 a 20 minutos em revelador fotorresistente com agitação em um agitador orbital, trocando a solução reveladora uma vez durante o processo. Para preparar a camada inferior do chip para cultura de tecidos, despeje o PDMS recém-preparado no wafer até a espessura desejada e desgaseifique a mistura em uma câmara de vácuo. Cure o PDMS em um forno por pelo menos três horas a 60 graus Celsius.Após o resfriamento, use uma lâmina para cortar o PDMS curado do wafer e, em seguida, use o PDMS não curado com cozimento para unir um reservatório médio à camada inferior do PDMS para obter o chip de cultura de tecidos PDMS montado. Para preparar o chip PDMS para a formação de organoides nervosos motores, esterilize o chip e um vidro de microscópio de 76 por 52 milímetros em uma placa de Petri contendo 70% de etanol por pelo menos uma hora. No final da incubação, coloque o chip no vidro úmido do microscópio.Após a secagem durante a noite, o chip deve aderir ao vidro. Coloque uma gota de 30 microlitros de matriz de membrana basal diluída em DMEM/F12 em um lado da entrada do canal e aspire a solução do outro lado da entrada para revestir a superfície do microcanal com a matriz. Em seguida, incube o chip PDMS com a solução de revestimento em uma placa de Petri por uma hora em temperatura ambiente.Para induzir a diferenciação de células 3D iPS em neurônios motores, semeie quatro vezes 10 para o quarto células iPS por poço no número apropriado de poços de uma placa de fundo em U de 96 poços em 100 microlitros de alimentador e meio de cultura de células sem soro suplementado com 10 micromolares Y-27632. No dia seguinte, substitua o sobrenadante em cada poço por 100 microlitros de meio KSR suplementado com 10 SB431542 micromolares e 100 nanomolares LDN-193189. Nos dias dois e três, substitua os sobrenadantes por 100 microlitros de meio KSR suplementado com 10 SB431542 micromolares, 100 nanomolares LDN-193189, cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista alisado micromolar.Nos dias quatro e cinco, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 75% de meio KSR e 25% de meio N2 suplementado com 10 SB431542 micromolares, 100 LDN193189 nanomolares, cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista suavizado micromolar. Nos dias seis e sete, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 50% de meio KSR e 50% de meio N2 suplementado com cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista alisado micromolar. Nos dias oito e nove, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 25% de meio KSR e 75% de meio N2 suplementado com cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista suavizado micromolar.Nos dias 10 e 11, substitua os sobrenadantes por meio N2 suplementado com cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista suavizado micromolar. No dia 12, substitua os sobrenadantes em cada poço por 100 microlitros de meio de maturação suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro por poço. Para induzir a formação de organoides nervosos motores, substitua a solução de revestimento no chip PDMS por 150 microlitros de meio de maturação suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e use uma ponta de micropipeta de calibre largo para adicionar suavemente esferóides de neurônios motores de um poço da placa de 96 poços na entrada do microcanal do chip.Coloque um pequeno reservatório de água estéril perto do chip de cultura de tecidos no prato para evitar a evaporação média e coloque o prato em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A cada dois ou três dias, substitua metade do meio de cultura esgotado do centro do reservatório do meio por meio de maturação fresco suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro. Os axônios crescerão do esferóide do neurônio motor para o canal, reunindo-se espontaneamente em um único feixe durante um período de duas a três semanas para formar um organoide do nervo motor.Os neurônios motores se diferenciam dentro de 12 a 14 dias em procedimentos de diferenciação 3D. É importante ressaltar que mais de 60% das células expressam o marcador do neurônio motor HB9 durante a diferenciação e aproximadamente 80% das células do neurônio motor esferóide são SMI32 positivas. Com o microcanal servindo como guias físicos, os axônios se alongam a partir do esferóide do neurônio motor para formar um feixe por interação axo-axonal dentro de 24 horas após a introdução ao esferóide.Os axônios atingiram o centro do microcanal nos próximos três a quatro dias, estendendo-se até a outra extremidade do microcanal após mais 10 dias. Os organoides do nervo motor podem ser coletados do chip para análise biológica, destacando o PDMS do vidro do microscópio. Os feixes de axônios e corpos celulares podem então ser dissecados e isolados ao microscópio usando uma faca cirúrgica ou pinça.Nos feixes axônicos dos organoides do nervo motor, as proteínas marcadoras dendríticas não são detectadas por Western blotting. É importante certificar-se de que os esferóides sejam completamente jogados no fundo do chip de cultura. Mostramos o exame dos locais e o fundo pode ajudar a determinar a localização do esferóide no chip.Os feixes de axônios isolados podem ser examinados para vários métodos adicionais. Uma grande quantidade de axônios pode ser obtida e usada para ensaios bioquímicos que requerem materiais substanciais.

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra a formação de junções neuromusculares usando um dispositivo microfluídico. As células precursoras neurais e as células progenitoras musculares são semeadas em diferentes poços dentro do dispositivo e deixadas para amadurecer em neurônios motores e miotubos, respectivamente. A criação de um gradiente de volume e químico leva ao desenvolvimento de junções neuromusculares ativas.

Gerando junções neuromusculares usando um dispositivo microfluídico

Este vídeo demonstra o método de criação de organoides nervosos motores, primeiro cultivando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em um meio especial para formar esferoides, depois diferenciando-as em neurônios motores usando inibidores específicos e, finalmente, cultivando-as em um chip microfluídico para estender axônios e formar organoides nervosos motores.

Desenvolvimento de organoides nervosos motores derivados de iPSC humanos usando um chip microfluídico

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em neurônios dopaminérgicos, para fornecer um modelo para estudar a doença de Parkinson. As hESCs são cultivadas em um meio de indução neural em uma placa de micropoços para formar neuroesferas 3D. Estes são então cultivados em um meio de indução neural para promover a diferenciação em neurônios progenitores dopaminérgicos. A maturação final dos neurônios ocorre em uma inserção de cultura sob condições de...

Geração de Organoides Neuronais Dopaminérgicos a partir de Células-Tronco Embrionárias Humanas

Este estudo introduz e descreve protocolos para derivar dois organóides neurais humanos específicos como um modelo relevante e exato para estudar 1) desenvolvimento humano do glioblastoma dentro dos organóides neural humanos exclusivamente nos seres humanos e 2) neurônio dopaminérgicos diferenciação, gerando um organoide tridimensional.

Organóides neurais humanos para estudar câncer cerebral e doenças neurodegenerativas

Descrevemos um método para gerar unidades motoras humanas em dispositivos microfluidos comercialmente disponíveis, co-culminando neurônios motores pluripotentes induzidos por células-tronco com miótubos primários derivados do mesoangioblast, resultando na formação de junções neuromusculares funcionalmente ativas.

Geração de Unidades Motoras Humanas com Junções Neuromusculares Funcionais em Dispositivos Microfluidos

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Neste estudo, fornecemos uma técnica detalhada para um sistema de cultura organoide cortical simples, mas robusto, usando culturas hPSC padrão sem alimentador. Este é um protocolo rápido, eficiente e reprodutível para gerar organoides que modelam aspectos da senescência cerebral in vitro.

Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelar senescência neuronal cerebral in vitro

Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

Este protocolo usa tridimensional (3D) de imagem e análise técnicas para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. As técnicas são aplicáveis a outras situações onde um sinal fluorescente é usado para isolar um subconjunto de dados de outro sinal fluorescente.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

Aprenda a gerar organoides de nervo motor tridimensionais a partir de células iPS humanas usando microchips PDMS. Este método permite estudar o desenvolvimento de feixes axonais e triagem de fármacos para doenças do neurônio motor.

Geração organoide do nervo motor tridimensional

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