Geração organoide do nervo motor tridimensional

Este protocolo facilita a investigação dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e à doença dos feixes axonais usando organoides nervosos motores derivados das células iPS humanas fora dos corpos. Simplesmente cultivando esferóides neuronais e chips de microcultura personalizados, feixes de axônios unidirecionais podem ser gerados espontaneamente e usados para vários experimentos a jusante. O organoide do nervo motor pode facilitar a triagem e o teste dos medicamentos para doenças do neurônio motor, incluindo o LS, fornecendo um modelo mais fisiológico que são sistemas in vitro anteriores.

Em uma capela de exaustão e usando o EPI apropriado, dispense três mililitros de SU-8 2100 em um wafer de silício limpo com acetona e coloque o wafer no centro de um revestidor giratório. Fixe o wafer por vácuo e gire o wafer a 500 rotações por minuto por 10 segundos para revestir o SU-8 uniformemente na superfície do wafer e, em seguida, gire o wafer a 1.500 rotações por minuto por 30 segundos com uma aceleração de 300 rotações por segundo para obter uma camada de fotorresistente de 150 mícrons de espessura no wafer. Após o cozimento suave, coloque a fotomáscara no alinhador de máscara e exponha o wafer à luz ultravioleta por 60 segundos.

Após assar em uma placa quente, desenvolver o wafer por 10 a 20 minutos em revelador fotorresistente com agitação em um agitador orbital, trocando a solução reveladora uma vez durante o processo. Para preparar a camada inferior do chip para cultura de tecidos, despeje o PDMS recém-preparado no wafer até a espessura desejada e desgaseifique a mistura em uma câmara de vácuo. Cure o PDMS em um forno por pelo menos três horas a 60 graus Celsius.

Após o resfriamento, use uma lâmina para cortar o PDMS curado do wafer e, em seguida, use o PDMS não curado com cozimento para unir um reservatório médio à camada inferior do PDMS para obter o chip de cultura de tecidos PDMS montado. Para preparar o chip PDMS para a formação de organoides nervosos motores, esterilize o chip e um vidro de microscópio de 76 por 52 milímetros em uma placa de Petri contendo 70% de etanol por pelo menos uma hora. No final da incubação, coloque o chip no vidro úmido do microscópio.

Após a secagem durante a noite, o chip deve aderir ao vidro. Coloque uma gota de 30 microlitros de matriz de membrana basal diluída em DMEM/F12 em um lado da entrada do canal e aspire a solução do outro lado da entrada para revestir a superfície do microcanal com a matriz. Em seguida, incube o chip PDMS com a solução de revestimento em uma placa de Petri por uma hora em temperatura ambiente.

Para induzir a diferenciação de células 3D iPS em neurônios motores, semeie quatro vezes 10 para o quarto células iPS por poço no número apropriado de poços de uma placa de fundo em U de 96 poços em 100 microlitros de alimentador e meio de cultura de células sem soro suplementado com 10 micromolares Y-27632. No dia seguinte, substitua o sobrenadante em cada poço por 100 microlitros de meio KSR suplementado com 10 SB431542 micromolares e 100 nanomolares LDN-193189. Nos dias dois e três, substitua os sobrenadantes por 100 microlitros de meio KSR suplementado com 10 SB431542 micromolares, 100 nanomolares LDN-193189, cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista alisado micromolar.

Nos dias quatro e cinco, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 75% de meio KSR e 25% de meio N2 suplementado com 10 SB431542 micromolares, 100 LDN193189 nanomolares, cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista suavizado micromolar. Nos dias seis e sete, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 50% de meio KSR e 50% de meio N2 suplementado com cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista alisado micromolar. Nos dias oito e nove, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 25% de meio KSR e 75% de meio N2 suplementado com cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista suavizado micromolar.

Nos dias 10 e 11, substitua os sobrenadantes por meio N2 suplementado com cinco DAPT micromolares, cinco SU5402 micromolares, um ácido retinóico micromolar e um agonista suavizado micromolar. No dia 12, substitua os sobrenadantes em cada poço por 100 microlitros de meio de maturação suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro por poço. Para induzir a formação de organoides nervosos motores, substitua a solução de revestimento no chip PDMS por 150 microlitros de meio de maturação suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e use uma ponta de micropipeta de calibre largo para adicionar suavemente esferóides de neurônios motores de um poço da placa de 96 poços na entrada do microcanal do chip.

Coloque um pequeno reservatório de água estéril perto do chip de cultura de tecidos no prato para evitar a evaporação média e coloque o prato em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A cada dois ou três dias, substitua metade do meio de cultura esgotado do centro do reservatório do meio por meio de maturação fresco suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro. Os axônios crescerão do esferóide do neurônio motor para o canal, reunindo-se espontaneamente em um único feixe durante um período de duas a três semanas para formar um organoide do nervo motor.

Os neurônios motores se diferenciam dentro de 12 a 14 dias em procedimentos de diferenciação 3D. É importante ressaltar que mais de 60% das células expressam o marcador do neurônio motor HB9 durante a diferenciação e aproximadamente 80% das células do neurônio motor esferóide são SMI32 positivas. Com o microcanal servindo como guias físicos, os axônios se alongam a partir do esferóide do neurônio motor para formar um feixe por interação axo-axonal dentro de 24 horas após a introdução ao esferóide.

Os axônios atingiram o centro do microcanal nos próximos três a quatro dias, estendendo-se até a outra extremidade do microcanal após mais 10 dias. Os organoides do nervo motor podem ser coletados do chip para análise biológica, destacando o PDMS do vidro do microscópio. Os feixes de axônios e corpos celulares podem então ser dissecados e isolados ao microscópio usando uma faca cirúrgica ou pinça.

Nos feixes axônicos dos organoides do nervo motor, as proteínas marcadoras dendríticas não são detectadas por Western blotting. É importante certificar-se de que os esferóides sejam completamente jogados no fundo do chip de cultura. Mostramos o exame dos locais e o fundo pode ajudar a determinar a localização do esferóide no chip.

Os feixes de axônios isolados podem ser examinados para vários métodos adicionais. Uma grande quantidade de axônios pode ser obtida e usada para ensaios bioquímicos que requerem materiais substanciais.