Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

O objetivo geral desta técnica de limpeza é estabelecer um método de limpeza de tecido para o cérebro de ratos. Este protocolo também pode ser usado para o rato transgênico HIV-1. A principal vantagem desta técnica é que o tecido cerebral do rato pode ser deixado intacto para limpeza, permitindo assim a análise completa do nível do circuito.

Demonstrando o procedimento estarão Kristin Kirchner, uma candidata a doutorado do meu laboratório, e também Hailong Li, um pesquisador associado do meu laboratório. Depois de realizar a perfusão transcárdica em um rato de três a seis semanas de idade, remova o cérebro do crânio usando uma pinça. Em seguida, coloque-o em uma posição sagital e corte-o em quatro seções iguais de três milímetros de largura usando uma lâmina de barbear e uma matriz de cérebro de rato.

Fixe cada seção em quatro por cento de PFA em um tubo de plástico selado de cinco mililitros durante a noite em um shaker a quatro graus Celsius. No dia seguinte, continue a fixação em temperatura ambiente por uma hora. Lave cada seção três vezes com PBS por cerca de 30 minutos por lavagem.

Incube em série as seções lavadas em solução de metanol a 20, 40, 60, 80 e 100% por uma hora cada. Repita a desidratação com 100% de metanol. Em seguida, resfrie as amostras em 100% de metanol a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Prepare uma solução contendo 66% DCM e 33% de metanol e incube as seções resfriadas nesta solução durante a noite em temperatura ambiente com agitação. No dia seguinte, lave a amostra duas vezes com metanol por 30 minutos e resfrie-a em 100% de metanol a quatro graus Celsius por 10 minutos. Para o branqueamento, coloque a amostra em peróxido de hidrogênio fresco a cinco por cento em metanol e incube-a durante a noite a quatro graus Celsius.

Após a incubação durante a noite, incube em série a amostra em soluções de 80, 60, 40 e 20% de metanol por uma hora cada em temperatura ambiente. Em seguida, incubar a amostra em PBS por uma hora e lavá-la duas vezes em solução, uma por uma hora por lavagem. Encha uma seringa de um mililitro com 2,5 microlitros de um por cento de biotina-CTB e injete-a lentamente no local do núcleo accumbens por mais de 20 segundos.

Deixe a ponta da agulha no lugar por um minuto e remova-a lentamente por mais de 10 segundos para evitar vazamentos. Incubar a amostra na solução três e depois na solução quatro por dois dias cada em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione o anticorpo primário e continue a incubação por sete dias.

Lave a amostra cinco vezes na solução dois por uma hora por lavagem e guarde-a na solução dois à temperatura ambiente durante a noite. Incubar a amostra com um anticorpo secundário durante sete dias num banho-maria a 37 graus Celsius. Por fim, lave-o cinco vezes na solução dois por uma hora por lavagem e guarde-o na solução dois em temperatura ambiente durante a noite com pouca luz.

Incube a amostra em série em 20, 40, 60, 80 e 100% de metanol por uma hora cada em temperatura ambiente. Em seguida, incube-o em 100% de metanol fresco durante a noite. No dia seguinte, incube a amostra em 66% DCM recém-preparado em 33% de metanol por três horas em temperatura ambiente com agitação.

Após três horas, incubar a amostra em éter dibenzílico sem agitar até que esteja límpida. Em seguida, armazene-o em éter dibenzílico até a geração de imagens. Obtenha uma câmara de impressora 3D e prenda-a a uma lâmina de microscópio usando epóxi.

Colocar a amostra no espaço quadrado no meio da câmara e encher completamente a câmara com éter dibenzílico. Coloque uma lamínula de 0,17 milímetros de espessura sobre a câmara e aplique pressão para garantir que esteja em contato total com as paredes da câmara. Em seguida, sele as bordas com epóxi.

Certifique-se de girar a câmara para permitir que bolhas de ar escapem da entrada de enchimento. Encher a câmara com éter dibenzílico suplementar. Em seguida, sele a entrada de enchimento com epóxi e deixe curar.

Observe a amostra usando um sistema de microscópio confocal para realizar um z-scan com ampliação de quatro vezes. A imagem confocal da amostra de tecido hidrofobicamente limpa com ampliação de quatro vezes mostra coloração densa de TH na área da substância negra, neurônios TH esparsos adjacentes à substância negra e uma área preta escura de tecido sem neurônios HT. A morfologia típica de um neurônio TH-positivo com ampliação de 20 vezes tem um grande soma e vários processos de ramificação.

Considerando que a microglia corada com IBA1 tem corpos celulares pequenos e processos de extensão mais curtos. A imagem confocal ideal mostra coloração positiva e densa de TH na área da substância negra com ganho de fluorescência adequado. Exemplos de imagens confocais ruins incluem uma imagem focada incorretamente com muito ganho fluorescente, uma coloração falso positiva com pontos brilhantes não focados com o resto do tecido e uma alta coloração de fundo como resultado do uso de um soro bloqueador que não corresponde a um anticorpo secundário.

A coloração positiva de CTB no cérebro do rato é mostrada aqui. As fibras longas e finas são projeções aferentes ao longo da via dopaminérgica. A colocalização de TH e CTB torna possível visualizar o local da injeção na área do núcleo accumbens, que aparece como um círculo verde densamente fluorescente.

A colocalização de TH e CTB na substância negra é mostrada aqui. As coisas mais importantes a serem lembradas ao tentar este procedimento são permitir que a amostra tenha tempo suficiente para incubar em todas as soluções de anticorpos e tempo suficiente para limpar completamente antes da imagem. A amostra deve ter exposição limitada ao ar, pois isso danificará a amostra.

Essa técnica é altamente versátil e pode ser usada para investigar muitas proteínas diferentes de interesse em diferentes regiões do cérebro. A técnica atual ajuda a pavimentar o caminho para os neurocientistas investigarem o cérebro de ratos em um nível de circuito que é essencial para o estudo do cérebro como um sistema inteiro.