Isolamento de RNA fecal (micro)

Apresentamos um protocolo de isolamento de RNA de amostras fecais para estudo de microRNAs. Este protocolo pode ser usado para isolar o RNA das fezes com alta qualidade e quantidade. Minimiza os RNAs de micróbios vivos.

É importante enfatizar que o buffer de ligação não é usado neste protocolo. Este protocolo é simples e direto. Comece ressuspendendo 25 a 100 miligramas de amostras fecais em 600 microlitros de 1X DPBS estéril em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Incubar o tubo que contém a amostra à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, amasse a mistura com uma ponta de pipeta de um mililitro e vortex bem. Ressuspenda a mistura em um homogeneizador com uma configuração para um ciclo a 4.000 rotações por minuto por 45 segundos para otimizar e aumentar a quantidade e a qualidade do RNA.

Adicione 600 microlitros de solução ácida de fenol clorofórmio à amostra e vortex a mistura por 60 segundos. Alternativamente, para otimizar uma quantidade maior de RNA no rendimento, misture-o com um homogeneizador. Centrifugar a amostra durante 15 minutos a 10 000 x g à temperatura ambiente para separar a fase aquosa e a fase orgânica.

Repita a centrifugação até que a interface esteja compacta. Transfira a fase aquosa superior com cuidado, sem perturbar a fase inferior, para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros com tampa de dobradiça. Adicione etanol 100% de grau ACS a 1,25 x o volume da fase aquosa adquirida e vórtice por três segundos.

Coloque o cartucho do filtro nos tubos de coleta. Carregue 600 microlitros de cada uma das amostras no cartucho do filtro fornecido no kit de isolamento de microRNA. Centrifugar a 10 000 x g durante 90 segundos para filtrar a mistura através do cartucho.

Em seguida, rejeitar o filtrado. Repita isso até que todo o volume da mistura seja filtrado através da mesma membrana filtrante em aplicações sucessivas. Afinal, a amostra é filtrada.

adicione 700 microlitros de solução de lavagem de microRNA 1 no mesmo cartucho de filtro. Centrifugue por 60 segundos para filtrar a solução de lavagem através do cartucho do filtro. Descarte o filtrado e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta.

Lave o cartucho do filtro com 700 microlitros de solução de lavagem 2/3 preparada em etanol 100% grau ACS e centrifugue a 10.000 x g por um minuto. Rejeitar o filtrado obtido e colocar o cartucho filtrante no mesmo tubo. Lave o cartucho do filtro com 500 microlitros de solução de lavagem 2/3 e centrifugue a 10.000 x g por um minuto.

Descarte o filtrado obtido e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta. Lave o cartucho do filtro com 250 microlitros de solução de lavagem 2/3 preparada em etanol 100% grau ACS e centrifugue a 10.000 x g por um minuto. Descarte o filtrado obtido e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta.

Por fim, transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta e gire o conjunto por cinco minutos para remover o fluido residual. Transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta, adicione 50 microlitros de água livre de nuclease ao centro do filtro e tampe o tubo. Incube o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, gire o tubo por cinco minutos a 8.000 x g para recuperar o RNA em um novo tubo de coleta. Um ensaio de eletroforese de RNA baseado em chip sugere que os isolados de RNA representativos de fezes de camundongos e humanos têm baixa ou falta de composições de rRNA 18S e 28S e o tamanho dos isolados de RNA cai na região do RNA pequeno. Uma outra pequena eletroforese de RNA com a eletroforese baseada em chip revelou que uma grande parte dos RNAs é do tamanho de microRNA.

A pureza do RNA extraído foi alta, conforme indicado pela razão de absorbância de 2,0 para comprimentos de onda de 260 e 280 nanômetros e valor de razão de 1,8 para absorbância em 260 e 230 nanômetros. Para garantir o sucesso da extração orgânica, certifique-se de que as faces sejam óbvias e transfira apenas a fase aquosa superior sem perturbar a fase inferior, mesmo ao custo de um volume reduzido de nossa fase aquosa.