Isolamento de RNA fecal (micro)
28 de outubro de 2020
Este protocolo isola RNA total de alta qualidade de amostras fecais de animais e seres humanos. Um kit comercial de isolamento de miRNA é usado com adaptação significativa para isolar o RNA puro com quantidade e qualidade otimizadas. Os isolados de RNA são bons para a maioria dos ensaios de RNA a jusante, como sequenciamento, micro-array e RT-PCR.
Apresentamos um protocolo de isolamento de RNA de amostras fecais para estudo de microRNAs. Este protocolo pode ser usado para isolar o RNA das fezes com alta qualidade e quantidade. Minimiza os RNAs de micróbios vivos.
É importante enfatizar que o buffer de ligação não é usado neste protocolo. Este protocolo é simples e direto. Comece ressuspendendo 25 a 100 miligramas de amostras fecais em 600 microlitros de 1X DPBS estéril em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Incubar o tubo que contém a amostra à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, amasse a mistura com uma ponta de pipeta de um mililitro e vortex bem. Ressuspenda a mistura em um homogeneizador com uma configuração para um ciclo a 4.000 rotações por minuto por 45 segundos para otimizar e aumentar a quantidade e a qualidade do RNA.
Adicione 600 microlitros de solução ácida de fenol clorofórmio à amostra e vortex a mistura por 60 segundos. Alternativamente, para otimizar uma quantidade maior de RNA no rendimento, misture-o com um homogeneizador. Centrifugar a amostra durante 15 minutos a 10 000 x g à temperatura ambiente para separar a fase aquosa e a fase orgânica.
Repita a centrifugação até que a interface esteja compacta. Transfira a fase aquosa superior com cuidado, sem perturbar a fase inferior, para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros com tampa de dobradiça. Adicione etanol 100% de grau ACS a 1,25 x o volume da fase aquosa adquirida e vórtice por três segundos.
Coloque o cartucho do filtro nos tubos de coleta. Carregue 600 microlitros de cada uma das amostras no cartucho do filtro fornecido no kit de isolamento de microRNA. Centrifugar a 10 000 x g durante 90 segundos para filtrar a mistura através do cartucho.
Em seguida, rejeitar o filtrado. Repita isso até que todo o volume da mistura seja filtrado através da mesma membrana filtrante em aplicações sucessivas. Afinal, a amostra é filtrada.
adicione 700 microlitros de solução de lavagem de microRNA 1 no mesmo cartucho de filtro. Centrifugue por 60 segundos para filtrar a solução de lavagem através do cartucho do filtro. Descarte o filtrado e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta.
Lave o cartucho do filtro com 700 microlitros de solução de lavagem 2/3 preparada em etanol 100% grau ACS e centrifugue a 10.000 x g por um minuto. Rejeitar o filtrado obtido e colocar o cartucho filtrante no mesmo tubo. Lave o cartucho do filtro com 500 microlitros de solução de lavagem 2/3 e centrifugue a 10.000 x g por um minuto.
Descarte o filtrado obtido e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta. Lave o cartucho do filtro com 250 microlitros de solução de lavagem 2/3 preparada em etanol 100% grau ACS e centrifugue a 10.000 x g por um minuto. Descarte o filtrado obtido e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta.
Por fim, transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta e gire o conjunto por cinco minutos para remover o fluido residual. Transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta, adicione 50 microlitros de água livre de nuclease ao centro do filtro e tampe o tubo. Incube o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguida, gire o tubo por cinco minutos a 8.000 x g para recuperar o RNA em um novo tubo de coleta. Um ensaio de eletroforese de RNA baseado em chip sugere que os isolados de RNA representativos de fezes de camundongos e humanos têm baixa ou falta de composições de rRNA 18S e 28S e o tamanho dos isolados de RNA cai na região do RNA pequeno. Uma outra pequena eletroforese de RNA com a eletroforese baseada em chip revelou que uma grande parte dos RNAs é do tamanho de microRNA.
A pureza do RNA extraído foi alta, conforme indicado pela razão de absorbância de 2,0 para comprimentos de onda de 260 e 280 nanômetros e valor de razão de 1,8 para absorbância em 260 e 230 nanômetros. Para garantir o sucesso da extração orgânica, certifique-se de que as faces sejam óbvias e transfira apenas a fase aquosa superior sem perturbar a fase inferior, mesmo ao custo de um volume reduzido de nossa fase aquosa.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo apresenta um método direto para isolar RNA de alta qualidade a partir de amostras fecais, minimizando a contaminação de micróbios vivos. É projetado para sujeitos humanos e animais, garantindo rendimento e pureza otimizados para aplicações subsequentes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microbiologia
- Biologia Molecular
Fundo
- O isolamento de RNA a partir de amostras fecais é crucial para estudar microRNAs.
- Métodos tradicionais podem levar à contaminação por RNA microbiano.
- RNA de alta qualidade é essencial para ensaios precisos subsequentes.
- Este protocolo adapta um kit comercial de isolamento de miRNA para resultados aprimorados.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para extração de RNA a partir de fezes.
- Melhorar a qualidade e quantidade de isolados de RNA.
- Facilitar a pesquisa sobre microRNAs em vários contextos biológicos.
Métodos Utilizados
- Ressuspensão de amostras fecais em DPBS 1X estéril.
- Uso de um tubo de microcentrífuga de dois mililitros para processamento.
- Adaptação de um kit comercial de isolamento de miRNA.
- Minimização da contaminação de RNA por micróbios vivos.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de RNA total de alta qualidade a partir de amostras fecais.
- Protocolo otimizado produz RNA adequado para sequenciamento e RT-PCR.
- Eficácia demonstrada na redução da contaminação por RNA microbiano.
- O protocolo é simples e direto para pesquisadores.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para extração de RNA a partir de amostras fecais.
- RNA de alta qualidade é crucial para aplicações subsequentes.
- Adaptações a kits comerciais podem melhorar o rendimento e a pureza do RNA.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity RNA from fecal samples enables mechanistic de-risking in target validation by providing access to host-derived microRNAs without microbial contamination. This supports predictive confidence in biomarker discovery and pathway analysis for gastrointestinal and systemic diseases. The protocol’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host microRNA signatures in feces for therapeutic hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing confounding signals from living microbes in sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces RNA isolates suitable for sequencing, RT-PCR, and microarray applications, enabling reliable compound screening readouts.
- Operational Value: Standardized washing steps and phase separation ensure reproducibility and scalability for high-throughput assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by yielding disease-relevant small RNA profiles from animal and human fecal models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with consistent RNA quality and quantity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical validation by providing a standardized input for omics and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by isolating host-derived RNA from complex fecal matrices.
- Screening: Enables assay readiness through high-yield, pure RNA outputs compatible with downstream analytical platforms.
- Analytics: Delivers quantitative RNA measurements with high purity (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8) for accurate condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via species-agnostic application in mouse and human models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for fecal RNA isolation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced microbial contamination and enhanced target validation in host-microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via optimized resuspension, washing, and filtration steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker-driven programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable RNA-derived data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and phase separation techniques to avoid interphase disruption.
- Dependent on centrifugation equipment capable of 10,000 x g and homogenization at 4,000 rpm for sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample mass limits (25–200 mg) to ensure consistent aqueous phase recovery.
- Adaptation considerations include adjusting wash volumes and incubation times for varying sample types and inhibitor loads.
- Practical limitation: samples exceeding 200 mg may compromise phase separation and RNA purity due to interface instability.
