Natural Killer (NK) e Método de Expansão Celular CAR-NK usando a Linha Celular B Modificada por IL-21 Ligada à Membrana
8 de fevereiro de 2022
Aqui, apresentamos um método para expandir o natural killer do sangue periférico (PBNK), células NK de tecidos hepáticos e células do receptor de antígeno quimérico (CAR)-NK derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou sangue do cordão umbilical (CB). Este protocolo demonstra a expansão das células NK e CAR-NK usando células alimentadoras de 221-mIL-21, além da pureza otimizada das células NK expandidas.
Este protocolo pode melhorar significativamente a expansão de células NK funcionais, não exaustivas e semelhantes à memória ex vivo em comparação com outras células alimentadoras baseadas no sistema de expansão. Este é um método mais simples em comparação com outros protocolos que usam células alimentadoras em que pulamos a etapa de isolamento da célula NK antes da expansão da célula NK. Este protocolo pode fornecer um número suficiente de células NK e CAR-NK para imunoterapia.
Esta técnica é altamente reprodutível. No entanto, usar novos materiais de partida frescos e tomar cuidado para não perturbar as células NK durante os primeiros dias de expansão é crucial. Comece identificando e seccionando as áreas de tecido viáveis usando equipamentos cirúrgicos estéreis para obter linfócitos.
Em seguida, coloque os tecidos seccionados em 30 mililitros de HBSS sem cálcio ou magnésio e mantenha o tecido no gelo até que esteja pronto para o isolamento. Trabalhando dentro de um armário de biossegurança, pice o tecido em cubos de menos de 0,5 centímetro com lâminas de barbear estéreis e fórceps. Coloque os pedaços de tecido picados, não mais de 4 gramas, nos tubos dissociadores de tecido e adicione 10 mililitros de colagenase IV aos pedaços de tecido.
Para picar o tecido completamente, trate os tubos dissociadores de tecido em um dissociador de tecido a 37 graus Celsius. Depois de remover os tubos do dissociador de tecido, triturar o tecido picado através de um filtro de células de nylon de 40 mícrons usando a extremidade traseira de uma seringa de 5 mililitros. Descarte os grandes fragmentos não digeridos.
Gire o eluente coletado a 400G por 5 minutos à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender os pellets celulares em sílica revestida de polivinilpirrolidona a 30% para remover as células adiposas. Gire as células conforme descrito antes de ressuspender o pellet celular em 9 mililitros de meio R-10. Para separar os linfócitos dos glóbulos vermelhos e das células polimorfonucleares, coloque cuidadosamente a suspensão celular em camadas sobre 4 mililitros de Ficoll ou meios de separação de linfócitos.
Separe as camadas centrifugando a 400G por 23 minutos à temperatura ambiente com a aceleração e os freios desligados. Em seguida, decante cuidadosamente a camada média-superior e colha a interfase contendo linfócitos infiltrantes de tecido. Lave as células com 10 mililitros de meio e prossiga para análise ou protocolo primário de expansão de células natural killer, ou NK.
Lave as células mononucleares do sangue periférico, ou PBMCs, e 100 células 221-mIL-21 irradiadas por gama separadamente por centrifugação a 400G por 5 minutos com 10 mililitros de meio R-10. Após a centrifugação, salve 1 x 10 para o 6º PBMCs para citometria de fluxo e misture 5 x 10 para o 6º PBMCs com 10 x 10 para o 6º 100 células 221-mIL-21 irradiadas por gama em uma placa especial de 6 poços. Adicione 30 mililitros de meio R-10 suplementado com interleucina-2 humana e interleucina-15 humana à mesma placa de 6 poços e incube a placa a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%, substituindo o meio a cada 3 a 4 dias.
Durante a incubação, registre o assassino natural total do sangue periférico, ou PBNK, a viabilidade do número de células e realize a citometria de fluxo a cada 3 a 4 dias para calcular a taxa de expansão celular NK. Adicionar 1,8 x 10 à 6ª célula 293T em 11 mililitros do meio D-10 por placa de 100 milímetros tratada e incubar células 293T a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Em um tubo de 1,70 mililitros, misture 470 microlitros do meio sérico reduzido com 30 microlitros do reagente de transfecção.
Em um tubo separado de 1,70 mililitro, adicione 2,5 microgramas de plasmídeo pRDF, 3,75 microgramas de plasmídeo Pegpam3 e 2,5 microgramas de construção CAR no vetor SFG no meio sérico reduzido para fazer o volume final de 500 microlitros. Misture o conteúdo do tubo com o tubo de 1,70 mililitro preparado anteriormente de forma gotícula. Após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, adicione 1 mililitro da mistura do tubo à placa de células 293T de forma gota a gota e coloque a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas.
Diluir a proteína retronectina com PBS até uma concentração final de 50 a 100 microgramas por mililitro. Adicione 500 microlitros da retronectina diluída em cada poço de uma placa de 24 poços não tratada. Em seguida, sele a placa usando parafilme e incube a placa a 4 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, centrifugar a placa de retronectina a 2, 103G por 30 minutos a 4 graus Celsius e descartar o sobrenadante. Depois de bloquear cada poço da placa de 24 poços com 1 mililitro de meio R-10, incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 1 hora. Filtre as células 293T previamente transfectadas usando um filtro de 0,45 mícron para coletar o sobrenadante do retrovírus.
Aliquot 2 mililitros do sobrenadante do retrovírus filtrado em cada poço da placa de retronectina de 24 poços. Centrifugar a placa de retronectina de 24 poços a 2, 103G por 2 horas em uma centrífuga pré-aquecida a 32 graus Celsius. Enquanto as placas estão sendo centrifugadas, colete as células PBNK expandidas do Dia 0 e conte as células usando Trypan Blue.
Diluir as células PBNK expandidas com meios R-10 suplementados com interleucina-2 e interleucina-15 até a concentração de 2,5 x 10 para a 5ª a 5 x 10 para a 5ª célula por mililitro. Após a centrifugação da placa de retronectina de 24 poços, aspirar parcialmente o sobrenadante do retrovírus de cada poço. Em seguida, adicione 2 mililitros das células PBNK expandidas diluídas a cada poço.
Centrifugar a placa a 600G durante 10 minutos a 32 graus Celsius antes de incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas. Transfira as células da placa de 24 poços para um tubo de centrífuga de 50 mililitros para centrifugar o tubo a 400G por 5 minutos. Depois de ressuspender o pellet com 1 mililitro de meio R-10, transfira as células ressuspensas para uma placa especial de 6 poços contendo 30 mililitros de meio R-10 suplementado com interleucina-2 e interleucina-15.
Incube a placa especial de 6 poços a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com meios refrescantes e calcule a taxa de expansão da célula NK a cada 3 a 4 dias. As células PBNK expandidas por 221-mIL-21 mostraram expandir-se quase 5 x 10 para a 4ª dobra. E a pureza da célula NK foi mantida em torno de 85% durante a expansão de 21 dias.
Antes da expansão, a robustez do sistema de expansão 221-mIL-21 foi examinada pela coloração de PBMCs para anti-CD56 e anti-CD3, que mostraram uma pureza celular de 7,09% para células NK e uma alta porcentagem de células T. No 4º dia de PBMCs e cocultura de 221-mIL-21, a pureza NK foi verificada antes da transdução CAR-NK. As células CAR-NK coradas para anti-CD56, anti-CD3 e anti-IgG humana mostraram uma alta população de células NK no Dia 7 e uma alta eficiência de transdução CAR de aproximadamente 70% foi observada.
No 18º dia, a expressão de RCA em vários subconjuntos foi verificada com citometria de fluxo. Após a expansão das células NK, as células podem ser usadas para ensaios funcionais in vitro ou para experimentos in vivo. O pesquisador pode usar este protocolo para expandir NK e CAR-NK para pacientes com deficiência funcional de NK, bem como outras espécies, como cães.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo robusto e reprodutível para a expansão ex vivo de células natural killer (NK) funcionais, não exaustas e com características de memória, bem como células NK modificadas com receptor de antígeno quimérico (CAR). O método utiliza uma linhagem de células B transformada pelo vírus Epstein-Barr (EBV) que expressa uma forma ligada à membrana da interleucina-21 (IL-21) como células alimentadoras, permitindo a geração de grandes quantidades de células NK e CAR-NK de alta pureza a partir de sangue de cordão, sangue periférico e tecidos de órgãos sólidos. Essa abordagem supera um entrave fundamental no desenvolvimento clínico da imunoterapia com CAR-NK, fornecendo uma fonte celular escalonável e pronta para uso.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunoterapia
- Engenharia celular
- Pesquisa sobre câncer
Contexto
- A terapia com células imunes modificadas por CAR é um tratamento emergente para cânceres e doenças infecciosas.
- A imunoterapia baseada em NK, especialmente as células CAR-NK, oferece um potencial terapêutico promissor "pronto para uso" com toxicidade reduzida.
- Obter números suficientes de células CAR-NK não exaustivas e de longa duração a partir de fontes de terceiros continua sendo um desafio.
- Os protocolos de expansão existentes frequentemente exigem sistemas complexos de células alimentadoras e etapas de isolamento de células NK.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simplificado e eficiente para a expansão de células NK e CAR-NK ex vivo.
- Utilizar uma linhagem celular B transformada pelo EBV e geneticamente modificada para expressar IL-21 ligada à membrana como células alimentadoras.
- Permitir a produção de quantidades clinicamente relevantes de células NK e CAR-NK funcionais a partir de diversas fontes teciduais.
Métodos Utilizados
- Preparação e seccionamento de tecido viável para isolamento de linfócitos.
- Dissociação enzimática e centrifugação em gradiente de densidade para obtenção de linfócitos infiltrantes do tecido.
- Cocultivo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) com células alimentadoras 221-mIL-21 submetidas à irradiação gama em meio suplementado com IL-2 e IL-15.
- Transdução retroviral de células NK expandidas com construtos de CAR utilizando placas revestidas com retronectina e sobrenadante viral derivado de células 293T.
- Citometria de fluxo para avaliar a pureza das células NK e a eficiência de transdução de CAR durante toda a expansão.
Resultados Principais
- O protocolo produz células NK com memória altamente funcionais e não exaustas, com expansão melhorada em comparação com outros sistemas de alimentação.
- A pureza das células NK é mantida em aproximadamente 85% durante um período de expansão de 21 dias.
- A eficiência de transdução de CAR atinge cerca de 70% no sétimo dia de cultivo.
- O sistema de expansão é robusto e reprodutível, com expansão de até 50.000 vezes das células NK observada.
- O método é aplicável a células derivadas de sangue de cordão, sangue periférico e tecidos de órgãos sólidos, e pode ser adaptado para outras espécies.
Conclusões
- Este protocolo permite a expansão eficiente e em larga escala de células NK e células CAR-NK funcionais, adequadas para aplicações em imunoterapia.
- O uso de células alimentadoras 221-mIL-21 simplifica o processo, eliminando a necessidade de isolamento prévio das células NK.
- A abordagem favorece o desenvolvimento clínico de terapias com CAR-NK "prontas para uso" para o câncer e outras doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Alcançar uma expansão robusta e escalonável de células NK e CAR-NK funcionais e não exaustas é um ponto crítico fundamental para o avanço das imunoterapias "prontas para uso" nos pipelines de oncologia e doenças infecciosas. Este sistema de células alimentadoras B modificadas com IL-21 ligada à membrana resolve um gargalo essencial, permitindo a produção de células NK e CAR-NK com alto rendimento e alta pureza a partir de diversas fontes teciduais. O método apoia a confiança preditiva e o avanço da carteira de projetos ao padronizar a expansão celular para aplicações translacionais e pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da citotoxicidade mediada por células NK e do engajamento funcional do alvo em sistemas relevantes para a doença.
- Apóia a desmistificação biológica ao gerar células NK com características de memória e não exaustivas para estudos mecanicistas.
- Facilita a confiança preditiva na validação de alvos por meio de expansão reprodutível e consistência fenotípica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece uma fonte padronizada de células NK e células CAR-NK de alta pureza para ensaios funcionais e de citotoxicidade subseqüentes.
- Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios ao eliminar a necessidade de isolamento prévio de células NK.
- Permite a avaliação quantitativa das taxas de expansão celular, pureza e eficiência de transdução de CAR para preparação para triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao apoiar a validação funcional in vitro e in vivo de células NK e CAR-NK.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, fornecendo populações celulares consistentes entre os estudos.
- Reduz o risco biológico nas decisões de avanço pré-clínico por meio de saídas robustas e reprodutíveis de expansão celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de expansão integra desde a fase inicial de descoberta até a pesquisa pré-clínica, apoiando a identificação de compostos líderes e a continuidade translacional para imunoterapias baseadas em células.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses e esclarecer vias utilizando células NK e CAR-NK funcionais.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medições baseadas em citometria de fluxo da pureza celular e da eficiência de transdução de CAR para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Apoia o desenvolvimento de modelos pré-clínicos e o alinhamento de biomarcadores com fontes celulares escaláveis.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável de expansão adaptável a múltiplas fontes de tecidos e espécies.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista no desenvolvimento de terapias baseadas em células NK.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho por meio da padronização, reprodutibilidade e eliminação das etapas de isolamento de células NK.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais precisas de avançar/não avançar e maior eficiência no uso de capital, fornecendo expansão celular confiável e de alto rendimento.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos a terapias celulares.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular, citometria de fluxo e técnicas de transdução viral.
- Necessita de acesso a instrumentação especializada para dissociação de tecidos, separação celular e validação analítica.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de expansão e dos pontos finais analíticos.
- Adaptável a diversas fontes de tecidos e potencialmente a outras espécies mediante otimização do protocolo.
- Depende da qualidade dos materiais iniciais e do manuseio cuidadoso para manter a reprodutibilidade.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
introduction
0:54
Natural Killer (NK) Cell Expansion from Liver Tissues: Day 0
3:14
Primary Natural Killer (NK) Cell Expansion from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs): Day 0
4:34
Attachment of 293T Cells (Day 2) and Retrovirus Transfection (Day 3)
5:58
Retronectin Plate-Coating (Day 3) and Transduction (Day 4)
8:18
CAR-NK Cells Collection (Day 6 or 7)
9:04
Results: Expansion of PBNK Cells and Flow Cytometric Analysis of CAR-NK Cells
10:22
Conclusion
