Isolamento de células assassinas naturais do tecido hepático para expansão seletiva

Para isolar células assassinas naturais, ou células NK - glóbulos brancos especializados envolvidos na imunidade inata, comece com tecido hepático humano contendo diversas populações de células, incluindo células contendo gordura, eritrócitos, granulócitos, linfócitos e outras células associadas presas em uma matriz extracelular rica em colágeno ou MEC.

Pique o tecido em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo contendo colagenase - uma enzima proteolítica. A colagenase cliva o colágeno, rompe a matriz e solta as células ligadas à MEC.

Insira o tubo em um dissociador de tecido. Essa dissociação mecânica desintegra ainda mais a ECM para liberar células frouxamente ligadas na solução. Filtrar o conteúdo para remover o tecido não digerido e os fragmentos de MEC e recolher o filtrado contendo várias células.

Ressuspenda as células em um tampão contendo polivinilpirrolidona ou esferas de sílica revestidas com PVP. Os grânulos de PVP se ligam seletivamente às células que contêm gordura, separando-as efetivamente do resto das células.

Centrifugar a baixa velocidade para peletar a população celular; rejeitar o sobrenadante que contém detritos e células adiposas ligadas a grânulos. Ressuspenda o pellet e sobreponha a suspensão celular em um tubo contendo um meio de gradiente de densidade para separar as células com base em suas densidades.

Centrifugue em baixa velocidade. Os eritrócitos e granulócitos de maior densidade se depositam na parte inferior, enquanto os linfócitos aparecem na interfase entre dois líquidos.

Colete as células da interfase e cultive-as em um meio seletivo para expansão das células NK.

Comece identificando e seccionando as áreas viáveis do tecido usando equipamento cirúrgico estéril para obter linfócitos. Em seguida, coloque os tecidos seccionados em 30 mililitros de HBSS sem cálcio ou magnésio e mantenha o tecido no gelo até que esteja pronto para o isolamento.

Trabalhando dentro de um gabinete de biossegurança, pique o tecido em cubos de menos de 0,5 centímetro com lâminas de barbear e pinças estéreis. Coloque os pedaços de tecido picados - não mais do que 4 gramas - nos tubos dissociadores de tecido e adicione 10 mililitros de colagenase IV aos pedaços de tecido.

Para picar bem o tecido, trate os tubos dissociadores de tecido em um dissociador de tecido a 37 graus Celsius. Depois de remover os tubos do dissociador de tecido, triture o tecido picado através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons usando a extremidade traseira de uma seringa de 5 mililitros. Descarte os fragmentos grandes e não digeridos.

Centrifugar o eluente recolhido a 400 g durante 5 minutos à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender os grânulos celulares em sílica revestida com polivinilpirrolidona a 30% para remover as células adiposas. Gire as células conforme descrito, antes de ressuspender o pellet celular em 9 mililitros de meio R-10.

Para separar os linfócitos dos glóbulos vermelhos e das células polimorfonucleares, coloque cuidadosamente a suspensão celular em camadas sobre 4 mililitros de Ficoll ou meio de separação de linfócitos. Separar as camadas centrifugando a 400 g durante 23 minutos à temperatura ambiente, com a aceleração e os travões desligados. Em seguida, decantar cuidadosamente a camada média superior e colher a interfase que contém linfócitos infiltrantes de tecidos.

Enxágue as células com 10 mililitros de meio e prossiga para análise do protocolo de expansão de células Natural Killer primárias, ou NK.