Estudos de Interações Acompanhante-Cochaperone usando ensaio homogêneo baseado em contas

Construímos um ensaio homogêneo à base de contas para estudar interações acompanhante-cochaperone. Usando esta técnica, examinamos pequenas moléculas inibindo interações entre Hsp90 e FKDP51 ou FKBP52 e identificamos inibidores potentes e seletivos. Esta técnica de triagem de alto rendimento é robusta e confiável.

Os resultados podem ser obtidos dentro de uma hora, e requer apenas pequenas quantidades de proteínas e compostos de contas. A interação do Hsp90 com essa cochaperona foi implicada em doenças humanas, como doença de Alzheimer, Câncer, Doença Autoimune. Esta técnica oferece a oportunidade de testar inibidores de acompanhante-cochaperona com alta importância médica.

Aqui está o princípio básico deste ensaio. Quando a interação entre o peptídeo Hsp90C-Terminal e o domínio TPR de cochaperonas traz o doador e as contas aceitadoras para a proximidade, um sinal altamente amplificado é gerado. Quando os inibidores de interação são adicionados, as contas doador e aceitadora não podem chegar à proximidade, e nenhum sinal detectável é produzido.

Comece diluindo o peptídeo Hsp90 em PBS a um miligrama por concentração mililitro. Diluir as contas aceitadoras não conjugadas na PBS, e transferir as contas para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar as contas diluídas para lavar e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenatante.

Para conjugar, coloque as contas aceitadoras em peptídeos em uma proporção de 10 para 1. Para as contas de paletídeo no peptídeo diluído pbs, Tween 20 e solução de cyanaboroughhydride de sódio, e incubar com agitação final sobre o fim em um agitador rotativo. Para bloquear os locais não redigidos, adicione 20 microlitradores de uma solução de cloridrato Tris molar de pH 8.0 às contas, e saciie a reação incubando por uma hora a 37 graus Celsius.

No final da incubação, lave as contas por centrifugação e suspenda a pelota de contas em um mililitro da solução de cloridrato tris. Repita a lavagem mais duas vezes. Após a última lavagem, suspenda as contas a um miligrama por mililitro de concentração no buffer de armazenamento e armazene a solução de contas aceitas conjugadas a 4 graus Celsius protegidas da luz.

Adicione contas doadoras de glutationa a 10 microgramas por concentração mililitro na PBS. Adicione GSTFKBP51 a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e incubar a reação por 10 minutos a 25 graus Celsius no escuro. Faça diluições seriais do composto de teste em DMSO.

Adicione 0,25 microliters de diluições compostas de teste e triplicate no canto de cada poço de uma placa de 384 poços. Para controle negativo, adicione 0,25 microliters de DMSO e para controle positivo, adicione 0,25 microliters de peptídeo Hsp90 C-Terminal nos poços. Adicione 22,5 microliters da solução contendo contas doadoras de glutationa com proteínas marcadas gst para cada poço.

Agite bem a placa com as mãos e incubar no escuro a 25 graus Celsius por 15 minutos. Diluir as contas aceitadoras com o peptídeo Hsp90C-Terminal anexado a 100 microgramas por concentração de mililitro em 0,5 vezes PBS. Adicione 2,25 microliters de contas aceitadoras diluídas a cada poço.

Agite e incubar a placa no escuro por 15 minutos como demonstrado. Ligue o instrumento leitor da placa, meça o sinal da placa e analise os dados conforme descrito no manuscrito do texto. Crie uma tabela de dados X-Y na caixa de diálogo de boas-vindas, selecione números X, Y e digite três valores de réplica em colunas lado a lado.

Importe os valores de concentração para a coluna X e os valores do sinal para a coluna Y. Clique em analisar, selecione transformar concentração X e, em seguida, selecione transformar em logaritmos. Clique em analisar e escolha regressão não linear na análise X-Y.

Abra a opção de inibição de resposta à dose e escolha a equação de inclinação variável log versus resposta. Clique bem para ver os resultados que contêm valor e gráficos IC50. Este ensaio foi utilizado para triagem de pequenas moléculas, inibindo interações entre Hsp90 e FKBP51 ou FKBP52.

A pontuação Z de mais de 0,8 e a razão de sinal para fundo de 13,35, demonstram a robustez e confiabilidade para a triagem de alto rendimento. O efeito do pequeno composto de teste de peso molecular D10 na inibição das interações acompanhante-cochaperona foi avaliado e os valores ic50 foram calculados, onde D10 apresentou inibição dependente da dose. O valor IC50 para interações Hsp90 GSTFKBP51 foi de 65 nanomolar.

Considerando que para as interações Hsp90, GSTFKBP52, a inibição completa não foi alcançada com a maior concentração composta indica que a inibição seletiva da interação proteína-proteína com pequenas moléculas pode ser alcançada. O passo crítico é a ordem de adição. Primeiro formamos um complexo entre uma pequena molécula e seu alvo TPR.

Caso contrário, são necessárias maiores incubações e maiores concentrações compostas. Podemos usar essa técnica para testar pequenas moléculas interrompendo a interação entre Hsp90 e FKB51 ou Hsp90 e FKB52. Também pode ser estendido a qualquer interação entre Hsp90, Hsp70 e um motivo TPR contendo inibidores seletivos de triagem de cochaperona.