Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila
14 de junho de 2021
O ensaio alimentador de microplacos oferece um método econômico de alta produtividade para quantificar o consumo de alimentos líquidos em Drosophila. Um dispositivo impresso em 3D conecta uma microplaca de 96 poços na qual as moscas estão alojadas em uma microplaca de 1536 poços da qual as moscas consomem uma solução de alimentação com um corante rastreador. O declínio do volume da solução é medido espectrofotometricamente.
O ensaio alimentador de microplacos fornece um método econômico simples, de alto rendimento e econômico para medir o comportamento alimentar de Drosophila, e oferece múltiplas vantagens em relação a outros métodos mais elaborados. Quantificar o consumo medindo a absorvância com um leitor de placas elimina medições manuais e evita a entrada manual de dados. Os dados também são favoráveis à extração e processamento programáticos.
Com este ensaio de alto rendimento podemos quantificar o consumo de nutrientes solúveis em água, drogas, fármacos ou toxinas, e o sistema pode ser modificado para aplicações a uma variedade de espécies de insetos. Comece despejando a agarose derretida em um cocho de reagente e distribua 80 microliters de agarose derretida em cada poço de uma microplata de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Leve à geladeira a sobra por até uma semana em um saco selado e remeleme-o para fazer placas adicionais.
Se as tiras de barreira estiverem muito soltas, enrole-as ao redor do dedo para dar-lhes curvatura para segurá-las nos canais. Insira as faixas de barreira nos canais de tira de barreira para preparar os acopladores. Afixe o acoplador a uma placa de fome, certificando-se de não usar o acoplador para manipular o prato, pois o acoplador pode escorregar.
Certifique-se de que o canto angular do acoplador corresponde ao canto angular da microplaca para manter a orientação correta. Sob anestesia de CO2, tipo moscas de três a cinco dias de idade. Carregue moscas individuais por coluna na placa de fome.
Feche cada coluna enquanto ela preenche ajustando sua faixa de barreira à posição fechada. Grave cuidadosamente o layout da amostra dentro da microplacão. Uma vez que a placa de fome é preenchida, permita que as moscas se recuperem espontaneamente depois de remover o CO2, e esfomeá-las por seis horas a partir de seu tempo inicial de anestesia.
Prepare 10 mililitros de alimentos líquidos em um tubo cônico de 15 mililitros dissolvendo 0,4 gramas de sacarose e 0,1 grama de extrato de levedura em 10 mililitros de água destilada. Vórtice do tubo até que os sólidos se dissolvam completamente. Adicione 40 microliters de solução de estoque de corante e transfira o alimento líquido para uma seringa de 10 mililitros com um filtro de 0,45 micrômetros.
Filtre aproximadamente 1,5 mililitros da solução de cada vez em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Coloque a seringa contendo a solução de lado e filtre a solução adicional conforme necessário durante a preparação da placa de alimentação. Prepare uma placa alimentadora selando a parte inferior de uma microplacão de 1536 poços com uma máquina de selar.
Use uma remada de vedação para aderir bem ao filme. Em seguida, corte o excesso de filme das bordas esquerda e direita com uma lâmina de barbear. Distribua 10 microliters da coluna de alimentos líquidos filtrados no poço superior esquerdo para cada conjunto de quatro poços da microplacão de 1536 poços.
Uma vez que todos os poços estejam cheios, aplique uma película de vedação na parte superior da placa, seguindo os mesmos passos usados para selar a parte inferior da microplaca. Repita para o número desejado de placas. Centrifugar as placas a 200 vezes G por 10 segundos para liquidar o fluido.
Não permita que a placa seja resfriada, pois isso pode causar o acúmulo de condensação nos poços, ocultando leituras de absorvência. Perfure os poços na superfície superior da placa com a ferramenta da sonda agulha equipada com uma agulha de 0,25 milímetros de diâmetro, utilizando a mesma ordem para perfurar como foi usada na dispensa das soluções. Limpe a agulha entre as soluções para evitar a contaminação cruzada.
Vire a placa e perfure os poços na parte inferior. Leia a absorção da placa em 630 nanômetros sem tampa. Coloque uma tampa interna na película de vedação superior para garantir que os anéis de condensação circundem os poços perfurados e coloque a tampa externa na placa.
Coloque a placa alimentadora de frente para cima no acoplador de tal forma que as guias alinhem os orifícios apropriados da placa alimentadora e da placa de fome. Certifique-se de que o acoplador e as placas estão corretamente orientados. Uma vez que todas as placas alimentadoras são carregadas sobre os acoplamentos, abra os poços para as placas ajustando as faixas de barreira no acoplador.
Coloque o acoplador e as montagens de placas no recipiente secundário. Coloque a metade inferior de uma caixa de pipeta contendo toalhas de papel encharcadas em cada recipiente secundário para fornecer umidade. Feche a tampa do recipiente secundário e transfira-a para um ambiente controlado.
Deixe as moscas consumirem por 22 horas. Após as 22 horas de exposição, verifique cada placa se há moscas mortas e atualize o layout da placa de acordo. Depois que todas as placas forem verificadas, anestesia as moscas em massa, bombeando CO2 dentro do recipiente secundário.
Após aproximadamente 60 segundos, certifique-se de que todas as moscas estão imobilizadas. Bata suavemente as moscas na placa de fome e substitua as tiras de barreira de plástico. Remova as placas alimentadoras para leitura.
Releia a absorvância da placa em 630 nanômetros. Repita o processo até que todas as placas tenham sido lidas. A evaporação foi quantificada para cada poço e foi encontrada para determinar se existem correlações entre os poços de placas individuais.
Coeficientes de correlação de Pearson para evaporação versus linhas e evaporação versus colunas foram calculados para avaliar tendências entre evaporação e locais de poços. O consumo de moscas Canton-SB de três a cinco dias de idade foi quantificado para estabelecer a validade do protocolo. As moscas foram escolhidas entre uma solução de 4% de sacarose com extrato de levedura de 1% e uma solução de 4% de sacarose complementada com 15% de etanol e extrato de 1% de levedura.
Tanto os machos quanto as fêmeas mostraram uma preferência esmagadora pela solução com extrato de etanol e levedura. É essencial manter a consistência na construção das placas alimentadoras, garantindo que cada mosca seja apresentada com um cenário de consumo idêntico em relação ao volume alimentar, evaporação e acesso. Essa técnica permitirá que pesquisadores da área de Drosophila realizem ensaios de alto rendimento para comportamentos de consumo e preferência com maior rendimento e a menor custo em comparação com os métodos tradicionais.
Visão Geral
O ensaio com alimentador de microplacas fornece um método de alto rendimento para quantificar o comportamento alimentar de Drosophila. Essa abordagem econômica utiliza um dispositivo impresso em 3D para conectar microplacas, permitindo a medição eficiente do consumo de alimento líquido.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Entomologia
Antecedentes
- A medição do comportamento alimentar em Drosophila é fundamental para compreender as preferências nutricionais.
- Métodos tradicionais podem ser trabalhosos e menos eficientes.
- O ensaio com alimentador em microplaca simplifica esse processo.
- Utiliza medições espectrofotométricas para a coleta de dados.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de alto rendimento para avaliar o consumo alimentar em Drosophila.
- Facilitar a quantificação de diversos nutrientes e substâncias.
- Melhorar a eficiência dos estudos sobre comportamento alimentar.
Métodos Utilizados
- Preparação de agarose e microplacas para ensaios de alimentação.
- Classificação e anestesia de moscas para experimentos controlados de alimentação.
- Medição da absorbância para quantificar o consumo de alimento.
- Análise de dados para identificar tendências no comportamento e nas preferências alimentares.
Resultados Principais
- As moscas mostraram preferência por alimento contendo etanol e extrato de levedura.
- A coleta de dados foi simplificada por meio de medições automatizadas de absorbância.
- As taxas de evaporação foram quantificadas e analisadas quanto a correlações.
- O ensaio mostrou-se eficaz para estudos de alimentação de alto rendimento.
Conclusões
- O ensaio com alimentador de microplacas é uma ferramenta valiosa para a pesquisa com Drosophila.
- Ele permite a medição eficiente e precisa do comportamento alimentar.
- Este método pode ser adaptado para diversas espécies de insetos e aplicações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação do consumo em organismos modelo apoia a validação de alvos e a triagem fenotípica na fase inicial de descoberta. O ensaio com alimentador de microplaca permite a medição em alto rendimento da ingestão de alimento líquido em Drosophila, fornecendo dados quantitativos para a redução de riscos mecanicistas em intervenções nutricionais, toxicológicas ou farmacológicas. Esta abordagem melhora a confiabilidade preditiva na identificação de compostos promissores ao padronizar métricas de consumo em grandes conjuntos de amostras.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a quantificação do consumo de nutrientes, toxinas ou fármacos em um modelo geneticamente manipulável.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos por meio de medições padronizadas, baseadas em absorbância, da ingestão de alimento líquido.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao gerar dados reprodutíveis de consumo para triagem de compostos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes ao isolar o consumo individual de moscas em formatos de placas de múltiplos poços.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de placas microtituláveis seladas e correção controlada da evaporação.
- Escalabilidade: Destaca a aptidão para triagem e a reutilização da plataforma por meio de acopladores impressos em 3D que sincronizam placas microtituláveis de 96 e 1536 poços.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo análise de resposta dose-dependente de compostos consumíveis.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Enfoca o valor preditivo ao avaliar respostas comportamentais a substâncias como etanol ou extrato de levedura.
- Sistema Relevante para Doenças: Apoia estudos de características associadas ao consumo com variáveis ambientais e farmacológicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde o teste de hipóteses até a identificação de compostos promissores, apoiando o fenotipagem comportamental quantitativa.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia testes de hipóteses, esclarecimento de vias ou desvio biológico por meio da quantificação da ingestão de alimento líquido.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, reprodutibilidade ou resultados quantitativos quando apoiados pelo artigo por meio de medições de absorbância antes e após o consumo.
- Análises: Destaca medições, leituras ou resultados estatísticos que ajudam as equipes a comparar condições, incluindo correção de evaporação e análise de correlação de Pearson.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com continuidade pré-clínica ou alinhamento de biomarcadores somente quando o texto original o apoia por meio de testes de preferência entre soluções suplementadas com sacarose e etanol.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, por meio de acopladores impressos em 3D e protocolos de vedação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em fenótipos relacionados ao consumo.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de leituras de absorbância em microplacas e controles com tiras de barreira.
- Valor Estratégico: Tomada de decisões mais eficaz sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados, permitindo ensaios de preferência e consumo em alto rendimento.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em dados quantitativos de ingestão obtidos em bibliotecas de compostos.
Considerações de Implementação
- Expertise científica necessária no manejo de Drosophila, preparação de microplacas e espectrofotometria.
- Os requisitos de instrumentação e infraestrutura analítica incluem leitores de placas capazes de absorvância em 630 nm e sistemas acopladores produzidos por impressão 3D.
- Requisitos de padronização entre equipes quanto ao selamento, perfuração e controles ambientais, para minimizar artefatos por condensação e evaporação.
- Considerações sobre adaptação entre sistemas modelo, observando o potencial de extensão a outras espécies de insetos mediante modificações nas formulações alimentares.
- Limitações práticas respaldadas pela literatura: a evaporação deve ser quantificada e corrigida; o resfriamento das placas provoca condensação que dificulta as leituras; é necessária orientação consistente entre o acoplador e as microplacas para acesso adequado aos poços.
