Estrutura do HIV-1 Assembléias Cápside por Cryo-Microscopia eletrônica e reconstrução iterativa helicoidal espaço-Real

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método para obter uma estrutura tridimensional de moléculas montadas de heli utilizando microscopia eletrônica de criogenia. O protocolo inicia-se com a preparação da amostra de criomicroscopia eletrônica usando um método de diluição rápida e aplicação do papel absorvente no lado oposto para reduzir temporariamente a concentração de sal durante a preparação da grade de microscopia eletrônica com congelamento por hidratação. Esse processo garante a estabilidade da proteína enquanto reduz o ruído de fundo e melhora a relação sinal-ruído durante a coleta de dados com baixa dose em criomicroscopia eletrônica, que ocorre posteriormente à coleta de dados.

A indexação helicoidal dos padrões de difração é concluída. Em seguida, é realizada a processamento de imagens, seguido pela reconstrução tridimensional no espaço real, resultando no mapa final de densidade do capsídio do HIV-1 ou do tubo de CA. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois existem vários pontos críticos para a coleta e análise ideais dos dados.

Por exemplo, no caso do HIV, montagens tubulares de capsídeo que se formam apenas em uma solução fonte de um molar reduzem rapidamente a concentração de sal sem afetar a estrutura. É fundamental obter imagens de alta qualidade de microscopia eletrônica criogênica. Dada uma imagem de um tubo, é muito difícil saber o que fazer para indexar um tubo crítico e qual software poderia ser considerado para realizar a reconstrução tridimensional.

Este vídeo apresenta uma abordagem detalhada e direta para obter uma reconstrução tridimensional de objetos físicos e pode ser usado como referência para o seu experimento. Vou demonstrar o procedimento com a Dra. Puja. Ambas somos pós-doutorandas do Laboratório do Dr. Para preparar os arranjos da proteína do capsídeo do HIV-1 para microscopia crioeletrônica, comece por submeter o lado de carbono de grades de cobre de 200 malhas à descarga por brilho, sob 25 miliampères, durante 25 segundos.

Use um nebulizador para elevar a umidade a 80% na câmara ambiental, que é um êmbolo de gravidade manual caseiro. Enquanto isso, resfrie etano líquido em um êmbolo de vidro com nitrogênio líquido e monte o dispositivo de congelação por imersão no êmbolo de gravidade manual. Em seguida, use pinças para prender as garras fechadas na borda da grade.

Adicione 2,5 microlitros de uma solução proteica pré-montada no lado de carbono da grade. Em seguida, coloque a pinça no êmbolo com o lado de carbono da grade voltado para longe. Adicione três microlitros de tampão de diluição com baixa concentração salina ao lado oposto da grade.

Imediatamente, tampone a grade com um pedaço de papel filtro no mesmo lado. Mantenha toda a superfície traseira da grade em contato próximo com o papel filtro por aproximadamente seis segundos. Após remover o papel filtro, mergulhe imediatamente a grade em etano líquido.

Por fim, remova a pinça do êmbolo e transfira rapidamente a grade para uma caixa de armazenamento de grades. Inicie a microscopia eletrônica criogênica carregando a grade congelada hidratada em um microscópio eletrônico FEI Polara G2, operando a 200 quilovolts e equipado com uma câmera CCD Gatan de 4K por 4K.

No modo de busca com dose baixa, adicione uma ampliação de cerca de 200 x. Examine toda a grade em busca de áreas com gelo adequado. Salve as posições dessas áreas em um arquivo de estágio.

Recupere as posições salvas e examine mais detalhadamente essas áreas. Aumente a magnificação para 3.900 x no modo de busca com baixa dose. Selecione as áreas com camada de gelo uniforme e fina para a coleta de dados, caracterizadas pela presença de tubos longos suspensos sobre um orifício.

Salve todas as áreas em um arquivo de segunda etapa. Alterne para o modo de exposição. Adicione uma magnificação de 59.000 x e insira uma abertura objetiva de 100 micrômetros.

Em seguida, ajuste o estigmatismo do objetivo e a intensidade do feixe para uma dose de aproximadamente 15 elétrons por angstrom quadrado por exposição. Retorne ao modo de busca com baixa dose e mova-se para uma posição salva. Identifique e centralize um bom tubo.

Usando a câmera CCD, mude para o modo de foco, ajuste o foco e defina um valor de desfoque normalmente entre 0,5 e 2,5 micrômetros. Em seguida, mude para o modo de exposição e defina um tempo de exposição de 0,3 a 0,5 segundos para uma dose de 15 elétrons por angstrom quadrado. Colete as imagens em uma câmera de chapa, permitindo que os filmes se estabilizem por 10 segundos antes de realizar a exposição.

Após a coleta das imagens, passe para a próxima posição salva e repita este processo para coletar mais imagens. Revele os filmes em D 19 na concentração total por 12 minutos. Em seguida, digitalize as imagens usando um scanner Nikon Super cool scan 9.000 ED com tamanho de pixel de 6,35 micrômetros.

Um objeto helicoidal pode ser indexado por dois parâmetros: a ordem de Bessel N e o número da linha de camada L na transformada de Fourier do retículo superficial de um objeto helicoidal. Cada linha de camada é caracterizada por N e L e corresponde a um conjunto de linhas no retículo superficial, denotado pelos índices H e K.

Para iniciar a indexação helicoidal, utilize o programa Helix boxer de Iman para delimitar um tubo relativamente longo e reto com diâmetro uniforme e salve a imagem no formato MRC. Em seguida, meça o raio do tubo usando o programa boxer de Iman. Determine a distância de repetição da hélice utilizando um programa baseado em correlação cruzada, como o I-M-G-C-C-F no pacote MRC.

Em seguida, calcule o foyer. Transforme com um novo comprimento de caixa que seja um múltiplo inteiro da distância de repetição. Depois, escolha duas linhas de camada principais que definam dois vetores fundamentais do reticulado superficial: um zero e zero um em unidades de pixel da TFF.

Determine os números das linhas de camada, bem como os raios de amplitude máxima, para as duas linhas de camada principais na transformada de Fourier. Conhecidos os números das linhas de camada e os valores das ordens de Bessel para as duas linhas de camada principais, a rotação entre subunidades e a elevação axial da hélice uniestrela pode ser obtida utilizando a regra de seleção descrita no procedimento escrito. Esses dois números reais descrevem a simetria helicoidal do tubo.

A reconstrução 3D começa com a segmentação de partículas usando o programa Iman.Boxer. Após abrir uma micrografia contendo partículas helicoidais, corte uma partícula em segmentos sobrepostos no painel de controle do Boxer. Escolha o modo hélice e defina os parâmetros para o enquadramento.

O tamanho da caixa deve ser maior que o diâmetro da partícula e o valor para OLA deve ser cerca de 90% do tamanho da caixa. Após o clique esquerdo em qualquer extremidade da caixa da partícula, será gerada automaticamente uma série de caixas de partículas ao longo do comprimento da hélice, salvando os segmentos delimitados bem como suas coordenadas. O próximo passo é realizar a reconstrução tridimensional inicial utilizando o método de reconstrução iterativa no espaço real helicoidal, I-H-R-S-R, antes do processamento com I-H-R-S-R.

Inverta o contraste das imagens de microscopia eletrônica criogênica e aplique filtragem LOWPASS. Em seguida, abra a interface gráfica do programa I-H-R-S-R digitando generator. Forneça à interface gráfica todas as informações sobre a pilha de partículas delimitadas, incluindo o nome e caminho da pilha, o número de imagens na pilha e os valores dos parâmetros de simetria.

Clique no botão finalizar para criar o script de reconstrução. B 25 SP.I utilizo um cilindro sólido ou oco como referência inicial e permito que o procedimento execute ciclos até que não haja mais alterações na simetria de parafuso definida, o que geralmente ocorre após alguns ciclos. Uma simetria helicoidal à direita deve fornecer um reconhecimento convergido de forma estável.

A reconstrução gerada no último ciclo será utilizada como referência inicial para refinamento adicional. Por fim, realize a reconstrução tridimensional com refinamento iterativo, utilizando o mapa de densidade tridimensional gerado pelo I-H-R-S-R como referência inicial para refinamento adicional durante o processo. A simetria helicoidal é fixada no que diz respeito à rotação entre subunidades e ao avanço axial, os quais são determinados a partir do procedimento I-H-R-S-R.

Em seguida, determine o desfoque e o astigmatismo presentes na micrografia utilizando os programas CTF find three e CTF tilt, usando programas spider denominados FT e mu, multiplique os segmentos de partículas pela função de transferência de contraste. Abreviado CTF, realize correspondência por projeção comparando projeções dos volumes de referência com as imagens corrigidas pela CTF usando alinhamento com múltiplas referências. A variação no ângulo de inclinação fora do plano é limitada a mais ou menos 10 graus e amostrada em intervalos de um grau, introduzindo restrições como altos coeficientes de correlação em ângulos planares próximos a zero graus ou 180 graus e deslocamentos X limitados.

Para os parâmetros de alinhamento de cada segmento, inclua na reconstrução apenas aqueles segmentos que satisfaçam as restrições. Após cada ciclo de refinamento iterativo, uma reconstrução tridimensional é gerada utilizando projeção inversa e dividida por algum valor sobre o CTF ao quadrado, impondo a simetria helicoidal para gerar um volume com simetrias. O refinamento iterativo é encerrado quando não ocorre mais melhoria na resolução da nova reconstrução tridimensional.

Um único conjunto de cápsides de HIV, um tubo de 92 e, foi delimitado e sua transformada de Fourier foi calculada para indexação helicoidal, determinando-se os dois raios, os números das linhas de camada e os raios de amplitude máxima para as linhas de camada um zero e zero um. Foram então calculados valores finais de menos 12 e 11 para um zero e zero um, respectivamente, com uma distância de repetição de 5195,48 angstroms. A simetria helicoidal do tubo foi determinada como delta Z igual a 6,81 angstroms e delta cinco igual a 328,88 graus; delta Z e delta cinco foram refinados para 7,13 angstroms e 328,86 graus utilizando I-H-R-S-R, e uma reconstrução inicial foi gerada após 10 ciclos iterativos.

A reconstrução final após o refinamento iterativo melhorou significativamente o mapa de densidade em relação ao modelo inicial calculado com I-H-R-S-R. O mapa de densidade dos tubos de montagem do capsídeo é exibido como três cortes ortogonais paralelos ao eixo do tubo e próximos à superfície, perpendiculares ao eixo do tubo e paralelos e passando pelo eixo do tubo. A estrutura exibida resulta da renderização da superfície do mapa de densidade 3D contornado em 1,8 Sigma, envolvendo 100% do volume.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão muito boa de como obter uma estrutura tridimensional de uma molécula montada por associação usando microscopia eletrônica de criogenia.