Estrutura do HIV-1 Assembléias Cápside por Cryo-Microscopia eletrônica e reconstrução iterativa helicoidal espaço-Real

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método para obter uma estrutura tridimensional de moléculas helimontadas usando microscopia crioeletrônica. O protocolo começa com a preparação de amostras criogênicas EM usando um método de diluição rápida e backside blotting para reduzir transitoriamente a concentração de sal ao preparar a grade EM hidratada congelada. Esse processo garante a estabilidade da proteína, reduzindo o ruído de fundo e melhorando a relação sinal-ruído durante a coleta de dados de baixa dose de EM criogênico que se segue após a coleta de dados.

A indexação helicoidal dos padrões de difração está concluída. O processamento da imagem é então realizado, seguido pela reconstrução 3D do espaço real, resultando no mapa de densidade final do capsídeo HIV um ou tubo ca. Geralmente, os novos indivíduos neste método terão dificuldades porque existem vários pontos críticos para a coleta e análise de dados ideais.

Por exemplo, no caso do HIV, conjuntos tubulares de um capsídeo que se formam apenas em uma solução de fonte molar, reduzindo rapidamente a concentração de sal sem afetar a estrutura. É fundamental obter imagens criogênicas EM de alta qualidade. Dada uma imagem de tubo, é muito difícil aprender o que fazer para indexar um tubo crítico e qual software pode ser considerado para fazer a reconstrução 3D.

Este vídeo fornece uma abordagem detalhada e direta para obter uma reconstrução 3D de objetos físicos e pode ser usado como referência para seu experimento. Estarei demonstrando o procedimento com o Dr.Puja. Nós dois somos pós-doutorandos do Dr.Laboratory Para preparar os conjuntos de proteínas do HIV um capsídeo para crio, comece por brilhar, descarregando o lado de carbono de grades de cobre de 200 mesh sob 25 miliamperes por 25 segundos.

Use um nebulizador para trazer a umidade para 80% na câmara ambiental, que é um êmbolo de gravidade manual caseiro. Enquanto isso, o etano líquido resfriado em um êmbolo de bott in vitro com nitrogênio líquido monta o congelador de imersão no êmbolo de gravidade manual. Em seguida, use uma pinça para prender as pinças fechadas na borda da grade.

Aplique 2,5 microlitros de uma solução de proteína pré-montada no lado de carbono da grade. Em seguida, carregue a pinça no êmbolo com o lado de carbono da grade voltado para o lado. Adicione três microlitros de tampão de baixa diluição de sal na parte de trás da grade.

Seque imediatamente a grade com um pedaço de papel de filtro do mesmo lado. Mantenha toda a superfície traseira da grelha em contacto próximo com o papel de filtro durante cerca de seis segundos. Depois de remover o papel de filtro, mergulhe imediatamente a grade no etano líquido.

Por fim, remova a pinça do êmbolo e transfira rapidamente a grade para uma caixa de armazenamento de grade. Comece a microscopia crioeletrônica carregando a grade hidratada congelada em um microscópio polar FEI G de dois elétrons. Operando a 200 quilovolts e equipado com uma câmera CCD gatin 4K por 4K.

No modo de pesquisa de baixa dose, adicione uma ampliação de cerca de 200 x. Examine toda a grade em busca de áreas com gelo adequado. Salve as posições dessas áreas em um arquivo de estágio.

Recupere as posições salvas e examine ainda mais essas áreas. Adicione uma ampliação de 3.900 x no modo de busca de baixa dose. Selecione as áreas com camada fina uniforme de gelo para coleta de dados, que se caracterizam por conter longos tubos suspensos sobre um orifício.

Salve todas as áreas em um arquivo de segundo estágio. Mude para o modo de exposição. Adicione uma ampliação de 59.000 x e insira uma abertura objetiva de 100 micrômetros.

Em seguida, ajuste o estigmatismo objetivo e a intensidade do feixe para uma dose de aproximadamente 15 elétrons por angstrom ao quadrado por exposição. Retorne ao modo de busca de baixa dose e vá para uma posição salva. Identifique e centralize um bom tubo.

Usando a câmera CCD, mude para o modo de foco, ajuste o foco e defina um valor de desfocagem normalmente entre 0.5 e 2.5 micrômetros. Em seguida, mude para o modo de exposição e defina um tempo de exposição de 0,3 a 0,5 segundos para uma dose de 15 elétrons por angstrom ao quadrado. Colete as imagens em uma câmera de placa, permitindo que os filmes se estabilizem por 10 segundos antes de uma exposição ser feita.

Após a coleta de imagens, vá para a próxima posição salva e repita esse processo para coletar mais imagens. Revele os filmes com força total D 19 por 12 minutos. Em seguida, digitalize as imagens usando um scanner Nikon Super cool scan 9, 000 ED com um tamanho de pixel de 6.35 micrômetros.

Um objeto helicoidal pode ser indexado por dois parâmetros. A ordem de Bessel N e o número da linha de camada L na transformada anterior da rede de superfície de um objeto helicoidal. Cada linha de camada é caracterizada por N e L e corresponde a um conjunto de linhas na rede de superfície, conforme denotado pelos índices H e K.

Para iniciar a indexação helicoidal, use o boxer Helix do programa de Iman para encaixotar um tubo relativamente longo e reto com diâmetro uniforme e salvar a imagem no formato MRC. Em seguida, meça o raio do tubo usando o boxer do programa de Iman. Determine a distância de repetição HEL usando um programa baseado em correlação cruzada, como I-M-G-C-C-F no pacote MRC.

Em seguida, calcule o foyer. Transforme com um novo comprimento de caixa que seja uma integral da distância de repetição. Em seguida, escolha duas linhas de camada principais que definem dois vetores de rede de superfície básicos, um zero e zero um em unidades de pixel FFT.

Determine os números das linhas de camada, bem como os raios de amplitude máxima para as duas linhas de camada principais na transformada de Fourier. Dados os números das linhas de camada e os valores das ordens de Bessel para as duas linhas de camada principais, a rotação entre as subunidades e a elevação axial da hélice de uma estrela podem ser obtidas usando a regra de seleção conforme descrito no procedimento escrito. Esses dois números reais descrevem a simetria do parafuso do tubo.

A reconstrução 3D começa com a segmentação de partículas usando o programa Iman. Pugilista. Depois de abrir uma micrografia contendo partículas helicoidais, corte uma partícula em segmentos sobrepostos no painel de controle do boxer. Escolha o modo hélice e defina os parâmetros para boxe.

O tamanho da caixa deve ser maior que o diâmetro da partícula e o valor do OLA deve ser de cerca de 90% do tamanho da caixa. Depois de esquerda, clicar em qualquer extremidade do boxeador de partículas gerará automaticamente uma série de caixas de partículas ao longo do comprimento da hélice, salvando os segmentos encaixotados, bem como suas coordenadas. O próximo passo é realizar a reconstrução 3D inicial usando o método iterativo de reconstrução helicoidal do espaço real I-H-R-S-R antes do processamento com I-H-R-S-R.

Inverta o contraste das imagens crio-EM e aplique a filtragem LOWPASS. Em seguida, abra a interface gráfica do programa I-H-R-S-R digitando gerador. Forneça à interface gráfica todas as informações para a pilha de partículas encaixotadas, incluindo o nome e o caminho da pilha, o número de imagens na pilha e os valores dos parâmetros de simetria.

Clique no botão Concluir para criar o script de reconstrução. B 25 SP. Eu uso um cilindro sólido ou oco como referência inicial e permito que o procedimento circule até que não haja alterações na simetria do parafuso definida, o que geralmente ocorre após alguns ciclos. Uma simetria de hélice direita deve fornecer uma reconstrução convergente de forma estável.

A reconstrução gerada no último ciclo será utilizada como referência inicial para posterior refinamento. Finalmente, execute a reconstrução 3D com refinamento iterativo usando o mapa de densidade 3D gerado pelo I-H-R-S-R como referência inicial para refinamento adicional durante o refinamento. A simetria helicoidal é fixada na rotação entre as subunidades e a elevação axial, que são determinadas a partir do procedimento I-H-R-S-R.

Em seguida, determine o desfoque e o astigmatismo presentes na micrografia usando os programas CTF find three e CTF tilt usando programas de aranha denominados FT e mu multiplicam segmentos de partículas pela função de transferência de contraste. O CTF abreviado realiza a correspondência de projeção comparando as projeções dos volumes de referência com as imagens corrigidas pelo CTF usando o alinhamento de múltiplas referências. A variação no ângulo de inclinação fora da planície é limitada a mais ou menos 10 graus e amostrada em etapas de um grau introduz restrições como altos coeficientes de correlação em ângulos lisos próximos a zero graus ou 180 graus e deslocamentos X limitados.

Para os parâmetros de alinhamento de cada segmento, inclua na reconstrução apenas os segmentos que satisfazem as restrições. Após cada ciclo de refinamento iterativo, uma reconstrução 3D é gerada usando projeção reversa e dividida por alguns sobre o CTF ao quadrado que impõe a simetria helicoidal para gerar um volume de simetrias. O refinamento iterativo é encerrado quando não ocorre nenhuma melhoria adicional na resolução da nova reconstrução 3D.

Um único conjunto de capsídeo HIV um, um tubo 92 e, foi encaixotado e sua transformada de Fourier é calculada para indexação helicoidal dos dois raios, os números das linhas da camada e os raios de amplitude máxima para as linhas da camada um zero e zero um foram determinados. Os valores finais de menos 12 e 11 foram então calculados para um zero e zero um, respectivamente, com uma distância de repetição de 5195,48 angstroms. A simetria do parafuso do tubo foi determinada como delta Z igual a 6,81 angstroms e delta cinco igual a 328,88 graus, delta Z e delta cinco foram refinados para 7,13 angstroms e 328,86 graus usando I-H-R-S-R e uma reconstrução inicial foi gerada após 10 ciclos iterativos.

A reconstrução final após o refinamento iterativo melhorou significativamente o mapa de densidade em relação ao modelo inicial calculado com I-H-R-S-R. O mapa de densidade dos tubos de montagem do capsídeo é exibido como três fatias ortogonais paralelas ao eixo do tubo e próximas à superfície, perpendiculares ao eixo do tubo e paralelas e através do eixo do tubo. A estrutura exibida resulta da renderização da superfície do mapa de densidade 3D contornado em 1,8 Sigma envolvendo 100% do volume.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como obter uma estrutura 3D de molécula montada aliada usando microscopia eletrônica de corvo.