Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

Este protocolo permite aos pesquisadores identificar se a atividade da caspase ocorre em conjunto com a morte celular, identificando assim diferentes modos de morte celular. A vantagem desta técnica é a flexibilidade para avaliar a atividade da caspase em um ensaio de base populacional ou célula única. Demonstrando o procedimento estarão Stefanie Rufli, uma graduada em PhD, e Jing Tong, um estudante de doutorado visitante do laboratório de Wendy Wei-Lynn Wong.

Depois de diferenciar e colher os macrófagos derivados da medula óssea ou BMDMs, conforme descrito no manuscrito, semeie-os em uma placa de seis poços na densidade de uma vez 10 para a sexta célula por mililitro. Trate as células com SMAC mimético por 16 horas. Para preparar o lisado celular, transfira a placa contendo células tratadas para o gelo e colete o meio de cultura celular em um tubo de 1,5 mililitro.

Centrífuga a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar o meio e colocar o tubo no gelo. Em seguida, adicione um mililitro de PBS frio à placa de cultura celular para lavar as células.

Depois de aspirar todo o PBS, adicione 100 microlitros de tripsina às células. Uma vez que as células são separadas da placa, colete-as no tubo de 1,5 mililitro. Depois de centrifugar a suspensão celular, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em tampão de lise DISC de 100 microlitros.

Incubar a amostra no gelo durante 20 minutos e, em seguida, centrifugar o lisado para peletizar a fracção insolúvel. Transfira 25 microlitros de lisado para uma placa branca de fundo plano de 96 poços para o ensaio de atividade de caspase-3/7 e 10 microlitros para uma placa transparente de fundo plano de 96 poços para o ensaio de ácido bicinchonínico ou BCA. Para a quantificação de proteínas, preparar uma gama de concentrações séricas de albumina ou BSA bovinas como proteína padrão.

Uma vez que o BSA padrão é adicionado à placa de fundo plano de 96 poços contendo as amostras, misture os reagentes BCA um e dois na proporção de 50 para um e adicione 200 microlitros a cada amostra no padrão. Após incubação a 37 graus Celsius por 30 minutos, medir a absorbância a 562 nanômetros em um instrumento fluorométrico e quantificar a concentração de proteína com a curva padrão. Para realizar um ensaio de base populacional, inicie o instrumento fluorométrico e aqueça a máquina a 30 graus Celsius.

Defina o comprimento de onda de excitação e emissão em 360 e 465 nanômetros, respectivamente. Em seguida, prepare uma mistura de reação mestre no gelo, conforme descrito no manuscrito, para determinar a atividade da caspase. Adicione 75 microlitros da mistura a cada amostra e padrão para obter um volume total de reação de 100 microlitros.

Meça imediatamente a fluorescência usando a configuração do instrumento fluorométrico e registre leituras individuais a cada minuto por 40 minutos para determinar a cinética da reação. Após a semeadura, colha as células aderentes, conforme demonstrado anteriormente, em um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Em seguida, centrifugar a amostra a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante.

Para preparar a mistura de coloração, pegue um microlitro do substrato fluorogênico e dilua-o com 150 microlitros de PBS. Adicione 50 microlitros de mistura de coloração por amostra, incube-a no escuro a 37 graus Celsius por 30 minutos e misture a cada 15 minutos. Neste ensaio de base populacional, os dados representativos do ensaio cinético para a atividade da caspase-3/7 mostraram aumento da clivagem do substrato com aumento da concentração mimética de SMAC.

No entanto, o aumento na concentração nanomolar de 500 foi insignificante com base em uma ANOVA one-way comum com comparações múltiplas. A análise da atividade da caspase-3/7 por citometria de fluxo indicou uma mudança na fluorescência para as células tratadas com miméticos SMAC em comparação com as células não tratadas, o que também foi evidente na intensidade de fluorescência mediana plotada e o aumento na concentração nanomolar de 500 foi significativo. O procedimento deve ser realizado no gelo.

No entanto, no ensaio de base populacional, as amostras não podem ser deixadas no gelo indefinidamente. Após a etapa de lise, as amostras devem ser processadas ou congeladas imediatamente. A imagem da atividade da caspase usando microscopia de células vivas seria um método adicional para obter informações cinéticas em um único nível celular.