Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução
10 de novembro de 2023
A aplicação de camadas de suporte a grades de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) pode aumentar a densidade de partículas, limitar as interações com a interface ar-água, reduzir o movimento induzido pelo feixe e melhorar a distribuição das orientações das partículas. Este artigo descreve um protocolo robusto para o revestimento de grades de crioEM com uma monocamada de grafeno para melhorar a preparação de amostras criogênicas.
Um desafio comum na preparação de amostras por microscopia crio-eletrônica é a localização de partículas na interface ar-água, fazendo com que as partículas adotem orientações preferenciais e desnaturem. Em vez disso, é melhor ter as partículas apoiadas na superfície da grade, que o filme fino suporta, como o grafeno, promove. Outro desafio é a exigência de concentrações de amostra relativamente altas, o que também poderia ser resolvido pelo grafeno.
As grades revestidas com grafeno fornecem inúmeras vantagens para a determinação da estrutura crioEM, mas historicamente têm sido difíceis de fabricar internamente de forma reprodutível, bem como o custo proibitivo para comprar comercialmente. Este protocolo permite a deposição robusta de grafeno monocamada, diminuindo assim a barreira para os usuários que empregam essas grades em suas pesquisas. O grafeno é único por causa de suas propriedades materiais.
É uma monocamada de carbono e, portanto, exibe um ruído de fundo mínimo. Outros suportes de grade crioEM, como uma fina camada de carbono amorfo ou flocos de óxido de grafeno, não podem ser aplicados como uma única monocamada e contribuem com mais sinal de fundo. Agora que estabelecemos um protocolo robusto para a aplicação de grafeno a grades crioEM, gostaríamos de buscar a funcionalização de grades revestidas de grafeno com alças de afinidade para captura on-grid diretamente de lisados celulares.
Isso poderia aliviar outro gargalo na preparação de amostras de crioEM.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para revestir grades de microscopia eletrônica criogênica (cryoEM) com uma monocamada de grafeno. O uso de grafeno aumenta a densidade de partículas, minimiza interações com a interface ar-água e melhora a distribuição da orientação das partículas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia eletrônica criogênica
- Ciência dos materiais
- Técnicas de preparação de amostras
Antecedentes
- A localização de partículas na interface ar-água é um desafio comum na microscopia eletrônica de criogenia (cryo-EM).
- Orientações preferenciais podem levar à desnaturação de partículas.
- Os suportes de grafeno podem ajudar as partículas a assentarem-se na superfície da grade.
- Historicamente, as grades revestidas com grafeno têm sido difíceis e custosas de fabricar.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo robusto para a deposição de grafeno em monocamada em grades de criomicroscopia eletrônica.
- Reduzir as barreiras para que pesquisadores utilizem grades revestidas com grafeno.
- Ampliar as vantagens da determinação de estruturas por criomicroscopia eletrônica.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de um protocolo para revestimento com grafeno.
- Avaliação da densidade e orientação das partículas.
- Comparação de grades revestidas com grafeno com grades tradicionais.
- Avaliação da reprodutibilidade na fabricação de grades.
Principais Resultados
- Grades revestidas com grafeno melhoram significativamente a localização de partículas.
- A maior densidade de partículas permite uma melhor determinação da estrutura.
- Um protocolo robusto facilita a fabricação interna de grades de grafeno.
- Custos mais baixos e maior acessibilidade para pesquisadores.
Conclusões
- O uso de grafeno em grades para microscopia crioeletrônica resolve desafios fundamentais na preparação de amostras.
- Este protocolo permite a adoção mais ampla de grades revestidas com grafeno na pesquisa.
- As propriedades únicas do grafeno aprimoram as capacidades da microscopia crioeletrônica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os gargalos na preparação de amostras em microscopia eletrônica criogênica (crioEM) limitam a produtividade e a confiabilidade da determinação de estruturas de alta resolução nas fases iniciais de descoberta e em fluxos de trabalho de biologia estrutural. A aplicação de grafeno em monocamada em grades para crioEM resolve desafios críticos relacionados à localização de partículas, viés de orientação e requisitos de concentração da amostra, impactando diretamente a confiança preditiva em estudos de validação de alvos e mecanismos. Protocolos robustos e reprodutíveis para grades de grafeno permitem uma adoção mais ampla na área, apoiando o avanço de portfólios com ajuste de risco e a alocação eficiente de recursos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite interrogar com alta fidelidade a estrutura de alvos macromoleculares em resolução quase atômica.
- Reduz a desnaturação da amostra e o viés de orientação, auxiliando na eliminação de riscos mecanicistas.
- Facilita a validação confiável de alvos ao melhorar a densidade de partículas e a consistência da imagem.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara suportes de grade padronizados e reprodutíveis para fluxos de trabalho downstream de criomicroscopia eletrônica.
- Melhora a confiabilidade do ensaio ao minimizar o ruído de fundo e aprimorar os resultados quantitativos de imagem.
- Permite triagem em larga escala de complexos estruturalmente diversos em concentrações mais baixas de amostra.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Permite estudos estruturais de complexos relevantes para doenças, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Oferece continuidade desde a elucidação estrutural em estágio de descoberta até a validação pré-clínica de mecanismos moleculares.
- Reduz o risco de falha biológica em estágios avançados ao garantir a qualidade dos dados estruturais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A preparação da grade de grafeno em monocamada integra-se ao fluxo de trabalho de microscopia crioeletrônica desde a descoberta inicial até a identificação de compostos promissores e pesquisas pré-clínicas, apoiando a determinação de estruturas orientada por hipóteses e o entendimento mecanicista.
- Biologia de Descoberta: Permite comparações estruturais precisas entre condições, apoiando testes robustos de hipóteses nulas.
- Triagem: Fornece grades reprodutíveis com baixo fundo para imageamento quantitativo e padronização de ensaios.
- Análises: Fornece padrões de difração e mapas de densidade de alta qualidade para análise estatística e tomada de decisões.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade dos dados estruturais para alvos e complexos relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade escalável e reprodutível de preparação de grades para diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos estruturais.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de grades, melhora a reprodutibilidade e reduz os requisitos de quantidade de amostra.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao reduzir gargalos na preparação de amostras.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos validados estruturalmente.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de grafeno e na preparação de grades para microscopia crioeletrônica (cryoEM).
- Necessita de acesso a centrífugas de espalhamento (spin coaters), unidades de descarga por ionização (glow discharge) e limpeza por ozônio ultravioleta.
- Exige padronização entre equipes para garantir reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes sistemas macromoleculares ou tipos de amostras.
- As limitações práticas incluem a fragilidade do material e a garantia da integridade da monocamada durante a transferência.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
