Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução
10 de novembro de 2023
A aplicação de camadas de suporte a grades de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) pode aumentar a densidade de partículas, limitar as interações com a interface ar-água, reduzir o movimento induzido pelo feixe e melhorar a distribuição das orientações das partículas. Este artigo descreve um protocolo robusto para o revestimento de grades de crioEM com uma monocamada de grafeno para melhorar a preparação de amostras criogênicas.
Um desafio comum na preparação de amostras por microscopia crio-eletrônica é a localização de partículas na interface ar-água, fazendo com que as partículas adotem orientações preferenciais e desnaturem. Em vez disso, é melhor ter as partículas apoiadas na superfície da grade, que o filme fino suporta, como o grafeno, promove. Outro desafio é a exigência de concentrações de amostra relativamente altas, o que também poderia ser resolvido pelo grafeno.
As grades revestidas com grafeno fornecem inúmeras vantagens para a determinação da estrutura crioEM, mas historicamente têm sido difíceis de fabricar internamente de forma reprodutível, bem como o custo proibitivo para comprar comercialmente. Este protocolo permite a deposição robusta de grafeno monocamada, diminuindo assim a barreira para os usuários que empregam essas grades em suas pesquisas. O grafeno é único por causa de suas propriedades materiais.
É uma monocamada de carbono e, portanto, exibe um ruído de fundo mínimo. Outros suportes de grade crioEM, como uma fina camada de carbono amorfo ou flocos de óxido de grafeno, não podem ser aplicados como uma única monocamada e contribuem com mais sinal de fundo. Agora que estabelecemos um protocolo robusto para a aplicação de grafeno a grades crioEM, gostaríamos de buscar a funcionalização de grades revestidas de grafeno com alças de afinidade para captura on-grid diretamente de lisados celulares.
Isso poderia aliviar outro gargalo na preparação de amostras de crioEM.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para revestir grades de microscopia eletrônica criogênica (cryoEM) com uma monocamada de grafeno. O uso de grafeno melhora a densidade de partículas, minimiza as interações com a interface ar-água e melhora a distribuição de orientação das partículas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia eletrônica criogênica
- Ciência de materiais
- Técnicas de preparação de amostras
Fundo
- A localização das partículas na interface ar-água é um desafio comum na cryo-EM.
- Orientações preferenciais podem levar à desnaturação das partículas.
- Suportes de grafeno podem ajudar as partículas a repousarem na superfície da grade.
- Historicamente, as grades revestidas com grafeno têm sido difíceis e caras de fabricar.
Propósito do Estudo
- Fornecer um protocolo robusto para a deposição de grafeno monocamada em grades cryoEM.
- Baixar as barreiras para os pesquisadores utilizarem grades revestidas com grafeno.
- Melhorar as vantagens da determinação da estrutura cryo-EM.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de um protocolo para revestimento de grafeno.
- Avaliação da densidade e orientação das partículas.
- Comparação de grades revestidas com grafeno e grades tradicionais.
- Avaliação da reprodutibilidade na fabricação da grade.
Principais Resultados
- Grades revestidas com grafeno melhoram significativamente a localização das partículas.
- Densidade de partículas aprimorada permite melhor determinação da estrutura.
- Protocolo robusto facilita a fabricação in-house de grades de grafeno.
- Custos mais baixos e melhor acessibilidade para os pesquisadores.
Conclusões
- O uso de grafeno em grades cryo-EM aborda desafios-chave na preparação da amostra.
- Este protocolo permite uma adoção mais ampla de grades revestidas com grafeno na pesquisa.
- As propriedades únicas do grafeno melhoram as capacidades da cryo-EM.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Sample preparation bottlenecks in cryo-electron microscopy (cryoEM) limit the throughput and reliability of high-resolution structure determination in early discovery and structural biology pipelines. The application of monolayer graphene to cryoEM grids addresses critical challenges of particle localization, orientation bias, and sample concentration requirements, directly impacting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Robust, reproducible graphene grid protocols enable broader enterprise adoption, supporting risk-adjusted portfolio advancement and efficient resource allocation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular targets at near-atomic resolution.
- Reduces sample denaturation and orientation bias, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates confident target validation by improving particle density and imaging consistency.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible grid supports for downstream cryoEM workflows.
- Improves assay reliability by minimizing background noise and enhancing quantitative imaging outputs.
- Supports scalable screening of structurally diverse complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Enables structural studies of disease-relevant complexes, supporting translational biomarker alignment.
- Provides continuity from discovery-stage structure elucidation to preclinical validation of molecular mechanisms.
- Reduces risk of late-stage biological failure by ensuring structural data quality.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene grid preparation integrates into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structure determination and mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports robust null hypothesis testing by enabling accurate structural comparisons across conditions.
- Screening: Delivers reproducible, low-background grids for quantitative imaging and assay standardization.
- Analytics: Provides high-quality diffraction patterns and density maps for statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Maintains structural data continuity for disease-relevant targets and complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reproducible grid preparation capability for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, enhances reproducibility, and lowers sample input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing sample preparation bottlenecks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in graphene handling and cryoEM grid preparation.
- Needs access to spin coaters, glow discharge units, and UV ozone cleaners.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or sample types.
- Practical limitations include handling fragility and ensuring monolayer integrity during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:35
Preparing MMA‐Coated CVD Graphene for Fabrication of Graphene‐Coated CryoEM Grids
3:27
Preparing Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares for Attaching to CryoEM Grids
5:14
Fabricating Graphene‐Coated Cryo‐EM Grids Using Grid‐Sized MMA‐Coated CVD Graphene Squares
