Name: Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a isolar populações estromais da medula óssea em modelos murinos de síndrome mielodisplásica e leucemia mielóide aguda usando citometria de fluxo. Este protocolo robusto revela alterações microambientais cruciais para o desenvolvimento de novas terapias contra cânceres hematológicos.

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Agradecemos ao Núcleo de Citometria de Fluxo da URMC. Este trabalho foi apoiado pela American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award e NIH grants R01DK133131 and R01CA266617 concedido a J.B.

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos foram criados e mantidos nas instalações de cuidados com animais da Universidade de Rochester. Para modelar a SMD de alto risco, o modelo murino NHD13 comercialmente disponível19 é empregado. Neste modelo, as células estromais da medula óssea são analisadas em camundongos NHD13 fêmeas com 8 semanas de idade, antes do início da doença. De novo A LMA é gerada conforme previamente descrito 6,11,20. Os oncogenes usados para induzir LMA, como MLL-AF9 e NRas, são marcados com GFP ou YFP, permitindo a análise das populações não leucêmicas de GFP- medula óssea usando citometria de fluxo. Em resumo, camundongos fêmeas C57BL/6J de 10 semanas de idade são transplantados com células murinas GFP/YFP+ AML, e a medula óssea é colhida 2 semanas após o transplante. Enquanto camundongos fêmeas são usados neste estudo para fins de demonstração, este protocolo pode ser conduzido com camundongos machos ou fêmeas. Também pode ser realizado usando um fêmur ou todos os ossos longos.
1. Colheita de medula óssea
NOTA: Para detalhes sobre o protocolo de dissecção dos animais, consulte Amend et al.26.
<ol><li>Limpar a argamassa e o pilão com etanol 70%, enxaguar com tampão FACS resfriado (Tabela 1) e colocá-los no gelo para esfriar antes de iniciar a colheita. Além disso, coloque o tampão MACs (Tabela 1) na bancada para permitir que ela atinja a temperatura ambiente.</li>
	<li>Eutanasiar o animal seguindo as orientações e protocolos institucionais de cuidados e uso dos animais.</li>
	<li>Na bancada, borrife bem o rato com etanol a 70% até molhar o pelo. Usando pinça e tesoura curva, levante a pele sobre o abdômen e faça duas incisões de aproximadamente 0,5 mm de comprimento em ambos os lados do mouse, lateralmente do abdômen. Em seguida, faça uma incisão de 0,5 mm distal ao abdome. Puxe para baixo para remover a pele e o pelo das pernas do rato.</li>
	<li>Coloque uma tesoura perpendicular à pelve, pressione para baixo enquanto puxa o fêmur com pinças. A cabeça femoral deve se desprender da pelve. Separe o fêmur e a tíbia na articulação patelofemoral. Coloque os ossos em tampão FACS em uma placa de 6 poços sobre gelo.</li>
	<li>Remova o tecido dos ossos usando tecido de nível laboratorial e coloque os ossos limpos em uma nova placa de 6 poços com tampão FACS fresco no gelo.</li>
	<li>Coloque todos os ossos na argamassa com 2-5 mL de tampão FACS para que todos os ossos fiquem imersos no tampão (ajuste o volume do tampão com base em quantos ossos você está processando). Esmague e triture os ossos usando o pilão em movimento circular até que o tecido da medula óssea seja liberado.</li>
	<li>Com uma seringa de 3 mL, homogeneizar a medula óssea puxando para cima e lavando o líquido da argamassa.</li>
	<li>Usando uma seringa de 3 mL, puxe o líquido da argamassa e filtre-o através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL sobre gelo. Enxaguar os pedaços de osso/tecido do filtro de volta para a argamassa com tampão FACS e retornar ao passo 1.7 para homogeneizar e coar uma segunda vez. Esta constitui a fração da medula óssea.</li>
	<li>Enxaguar os pedaços ósseos restantes (espículas) de volta na argamassa com tampão FACS e lavá-los em um tubo de 15 mL usando tampão FACS para garantir o máximo rendimento celular. Esta é a fração das espículas ósseas.</li>
</ol>2. Digestão da medula óssea
<ol><li>Centrifugar a medula óssea a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender a medula óssea em 2 mL da mistura de digestão da medula óssea (Tabela 1) e transferi-la para um tubo de 15 mL. Incubar a 37 °C durante 45 min num rotador.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.</li>
	<li>Pellet a mistura a 400 x g durante 7 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender a pastilha de medula óssea em 1 mL de tampão de lise eritrocitária (ver Tabela de Materiais). Incubar por 4 min no gelo.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a lise. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.</li>
	<li>Pellet a mistura a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão FACS.</li>
</ol>3. Digestão das espículas ósseas
<ol><li>Vórtice as espículas ósseas a partir do passo 1.9 e deixe-as assentar. Decantar o sobrenadante e reter o osso na parte inferior.</li>
	<li>Ressuspender as espículas ósseas em 1 mL da mistura de digestão da espícula óssea (Tabela 1).</li>
	<li>Colocar os tubos num rotador de tubo durante 60 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para o tubo de 50 mL contendo medula óssea lisada e digerida por hemácias.</li>
</ol>4. Coloração
<ol><li>Misture suavemente as espículas ósseas e a suspensão de células da medula óssea.</li>
	<li>Utilizar 10 μL da suspensão celular para contar o número de células vivas em um hemocitômetro utilizando coloração à base de azul de Tripano 0,4%, conforme descrito em protocolos publicados27. Coletar 50.000 células para um controle sem manchas da suspensão celular.</li>
	<li>Centrifugar as células restantes a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o em 100 μL de tampão FACS. NOTA: Os anticorpos podem ser titulados para determinar a diluição ideal. A seleção de anticorpos (epítopos e fluorocromos) pode ser personalizada.</li>
	<li>Para coloração com anticorpos para depleção magnética, adicionar FC Block (1 μL por 25 x 106 células), CD45-APC (10 μL por 25 x 106 células) e Ter119-APC (4 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar no gelo por 20 min. Lavar com tampão FACS, remover 50.000 células (~50 μL) para o controle corado com APC, centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C e ressuspender em 100 μL de tampão FACS.</li>
	<li>Para coloração da suspensão celular com microesferas para depleção magnética, adicionar mIgG (8 μL por 25 x 106 células) e microesferas Anti-APC (20 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 10 ml de tampão FACS, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
</ol>5. Depleção da amostra por triagem magnética
NOTA: Esta etapa é realizada usando um separador magnético manual disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. Esta etapa também pode ser executada com um separador automatizado (consulte a Tabela de Materiais).
<ol><li>Preparar a coluna DL lavando-a com 2 mL de tampão MACs (Tabela 1). Descarte o efluente e troque o tubo coletor.</li>
	<li>Ressuspenda até 1 x 108 células em tampão MACs e filtre-as através de um tubo de ensaio de 5 mL com uma tampa de filtro de células de 35 μm.</li>
	<li>Coloque a coluna LD no suporte do separador magnético. Posicionar um tubo de ensaio de 5 ml abaixo da coluna para recolher o eluato.</li>
	<li>Adicione a suspensão da célula à coluna LD preparada. Permitir que a fração negativa flua para o tubo de coleta. Lavar a coluna duas vezes com 1 mL de tampão MACs, coletando o eluato no mesmo tubo. Esta é a fração negativa usada na etapa 5.6 abaixo.</li>
	<li>Retire a coluna LD do suporte do separador magnético e coloque-a num novo tubo de ensaio de 5 ml. Use uma pipeta para distribuir 3 mL de tampão na coluna para liberar as células que foram marcadas positivamente, usando o êmbolo de coluna.</li>
	<li>Centrifugar as fracções negativa e positiva a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspendê-los em 100 μL de tampão FACS.</li>
	<li>Contar 10 μL das frações negativa e positiva com 0,4% de azul de Tripano. Os volumes para a coloração do painel endotelial abaixo serão baseados nesta contagem celular.</li>
	<li>Use 50.000 células vivas da fração positiva para controles de contagem de citometria de fluxo.</li>
</ol>6. Osteoanálise/coloração do painel endotelial
NOTA: A compensação deve ser realizada seguindo os protocolos padrão de citometria de fluxo, incluindo todos os controles apropriados de coloração e limitação.
<ol><li>Para coloração da fração negativa CD45/Ter119 (1 μL de cada anticorpo por 1 x 106 células), adicionar CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE e CD140a-PE-Cy5 (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 2 ml de tampão FACS e, em seguida, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de tampão FACS e uma diluição de 1:1000 de IP para coloração viva/morta e, em seguida, filtrar a amostra através de um tubo de ensaio de 5 ml com uma tampa de filtro de células de 35 μm.</li>
	<li>Analise as células em um citômetro de fluxo multicolorido.</li>
</ol>

Isolamento e caracterização do microambiente da medula óssea em neoplasias mieloides

<ol><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li>
<li>Pinho, S., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+activity+and+interactions+with+the+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).</li>
<li>Kfoury, Y., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cell+contributions+to+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).</li>
<li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li>
<li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd98-mediated+adhesive+signaling+enables+the+establishment+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).</li>
<li>Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+stem+cells+and+microenvironment%3A+Biology+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting.</a> J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).</li>
<li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+notch+activation+in+microenvironment+leads+to+myeloproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease.</a> Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microenvironment-induced+myeloproliferative+syndrome+caused+by+retinoic+acid+receptor+gamma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency.</a> Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+%CE%B2-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Hanoun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myelogenous+leukemia-induced+sympathetic+neuropathy+promotes+malignancy+in+an+altered+hematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li>
<li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053(2020).</li>
<li>Sekeres, M. A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+myelodysplastic+syndromes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review.</a> Jama. 328 (9), 872-880 (2022).</li>
<li>Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot%3A+Acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Snapshot: Acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).</li>
<li>Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mll+translocations%2C+histone+modifications+and+leukaemia+stem-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development.</a> Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).</li>
<li>Yoshimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+alterations+in+rna+splicing+and+epigenetic+regulation+drive+leukaemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis.</a> Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup98-hoxd13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Kwon, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+3+is+required+for+the+development+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).</li>
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<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+mll-af9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
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<li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Modelos de leucemia murina têm sido extensivamente utilizados para identificar sinais intrínsecos e de nicho celular que promovem progressão agressiva da leucemia mieloide 6,19,21. Aqui, um protocolo abrangente baseado em citometria de fluxo para definir a composição celular do microambiente da medula óssea em modelos murinos de SMD e LMA é apresentado.
Antes de adquirir dados de citometria de fluxo d...

O microambiente da medula óssea é constituído por células hematopoéticas, células estromais não hematopoéticas e matrizextracelular1,2. Esse microambiente pode promover a auto-renovação das células-tronco hematopoéticas, regular a diferenciação de linhagens e fornecer suporte estrutural e mecânico ao tecido ósseo1,2,3,4,5. O nicho estromal inclui células de osteolinhagens, fibroblastos, células nervosas e células endoteliais6, enquanto o nicho hematopoiético é constituídopelas populações linfoide e mielóide1,2,3. Além de suportar CTHs normais, o microambiente da medula óssea também pode desempenhar um papel no desenvolvimento de desordens de células-tronco hematopoéticas, como SMD e LMA7,8,9,10,11. Demonstrou-se que mutações em células de osteolinhagens promovem o desenvolvimento de SMD, LMA e outras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.
As síndromes mielodisplásicas são um grupo de doenças pré-leucêmicas que surgem a partir de mutações em células-tronco hematopoéticas. A SMD está frequentemente associada a um bloqueio na diferenciação das CTH e à produção de células displásicas, o que muitas vezes pode levar à falência da medula óssea. A SMD é a neoplasia mieloide mais comumente diagnosticada nos Estados Unidos e está associada a uma taxa de sobrevida de 3 anos de 35%-45%15. A SMD está frequentemente associada a um alto risco de transformação para leucemia mieloide aguda. Isso pode ser uma complicação fatal, já que a LMA derivada da SMD é resistente à maioria das terapias e tem probabilidade de recidiva. A LMA que surge de novo devido a translocações ou mutações no tronco hematopoético e progenitores também é frequentemente resistente à quimioterapia padrão16,17. Como a SMD e a LMA são principalmente doenças de idosos, sendo a maioria diagnosticada acima de 60 anos, a maioria dos pacientes não é elegível para transplante curativo de medula óssea. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Uma vez que o microambiente da medula óssea pode fornecer suporte para célulasmalignas14, a definição de alterações no nicho medular com a progressão da doença pode levar à identificação de novas terapêuticas que visem inibir o remodelamento do nicho tumoral. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Para tanto, é fundamental identificar e caracterizar alterações nas populações de células estromais da medula óssea que possam dar suporte às células malignas.
Vários modelos murinos de LMA e SMD foram gerados e podem ser usados para estudar alterações no microambiente da medula óssea durante o início e progressão da doença 6,1,19,20,21,22. Neste estudo, são descritos protocolos para identificar alterações nas populações de células estromais da medula óssea utilizando modelos murinos deLMA induzida retroviricamente6,20, bem como o modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) comercialmente disponível de MDS de alto risco para transformação de LMA19. Camundongos transplantados com células de novo da LMA sucumbem à doença em 20-30 dias6. Os camundongos NHD13 desenvolvem citopenias e displasia da medula óssea em torno de 15-20 semanas, que eventualmente se transforma em LMA, e quase 75% dos camundongos sucumbem à doença em torno de 32 semanas. Para analisar as populações do microambiente da medula óssea modelo murino, os ossos são colhidos, a medula óssea e as espículas ósseas são digeridas usando digestão enzimática, e as células são então enriquecidas para populações não-hematopoiéticas CD45-/Ter119- por classificação magnética. Embora análises semelhantes tenham sido descritas anteriormente 11,13,22,23,24,25, elas frequentemente se concentram na medula óssea ou no osso e não incorporam células de ambas as fontes em suas análises. A caracterização combinada dessas populações, em conjunto com análises de expressão gênica, pode fornecer uma compreensão abrangente de como o microambiente hematopoético celular fornece suporte para o início e progressão da doença (Figura 1). Embora o protocolo descrito abaixo se concentre no modelo de LMA induzida retroviricamente e em um modelo genético de SMD, essas estratégias podem ser facilmente adaptadas para estudar alterações no nicho da medula óssea de qualquer modelo murino de interesse.

<table><tbody><tr><td>Pontas de pipeta de 1 mL</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td>Tubos de Microcentrífuga <td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL</td><td>AVANT</td><td>L211511-CS</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Pontas de pipeta</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-140RL</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetas serológicas estéreis embaladas individualmente</td><td>Globe scientific</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Balão de filtração a vácuo</td><td>NEST</td><td>344021</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>VWR</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de aspiração de 2 mL</td><td>NEST</td><td>325011</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Pontas de pipeta</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-150-RL</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipetas Sorológicas Estéreis Embaladas Individualmente</td><td>Globe scientific</td><td>1780</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Sorológicas Estéreis Embaladas Individualmente 5 mL</td><td>Globe scientific</td><td>1740</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mL&nbsp; Tubo de Fundo Redondo</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5 mL de Poliestireno com Tampa de Filtro de Células 12 x 75 mm estilo</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>Tubo de Centrífuga de 50 mL</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>6 Poços, Fundo Plano com Tampa de Baixa Evaporação Falcon</td><td></td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Absorventes com Barreira à Prova d'Água</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr><tr><td>APC MicroBeads</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separador</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>4425745</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Purificado Rato Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>0,5 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>66.000 g/mol</td></tr><tr><td>Violeta brilhante 421 anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1) Anticorpo (D7)</td><td>Invitrogen</td><td>404-5981</td><td>0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6J Camundongos</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de Gás de Dióxido de Carbono</td><td>Airgas</td><td>CD50</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) Anticorpo Monoclonal (390), PE-Cyanine7</td><td>Invitrogen</td><td>25-0311-82</td><td>0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo Monoclonal (30-F11), APC</td><td>Invitrogen</td><td>17-0451-82</td><td>0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &micro; m Nylon&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials Almofariz e Pilão; Ágata, 125 mL</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-63100-62</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase Tipo I</td><td>STEMCELL</td><td>7415</td><td></td></tr><tr><td>Corning Mini Centrífuga</td><td>CORNING</td><td>6770</td><td></td></tr><tr><td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td><td>Corning</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, pó</td><td>Gibco</td><td>117105041</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto, KOPTEC, atende às especificações analíticas da BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td><td>VWR</td><td>89125-174</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina - afiada</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Foundation B Fetal Soro Bovino</td><td>GeminiBio</td><td>900-208</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Kits Iniciais de Pipeta PIPETMAN L</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>F167370G</tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td><td>gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora&nbsp;</td><td>BINDER</td><td>C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>K222101</td><td></td></tr><tr><td>LABGARD Classe II, Tipo A2 Gabinete de Segurança Biológica</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>LD Colunas</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LSE Misturador de Vórtice</td><td>CORNING</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>647800L6</td><td></td></tr><tr><td>MACS MULTI STAND&nbsp;</td><td>Rotador de Tubo MACsmix Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>mIgG</td><td>Millipore-Sigma</td><td>18765-10mg</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Laboratório</td><td>Jackson de Camundongos&nbsp;</td><td></td><td></td>010505</tr><tr><td>PE anti-camundongo CD51 Anticorpo (RMV-7)</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td>0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>PE/Cianina5 anti-camundongo CD140a Anticorpo (RUO)</td><td>Biolegend</td><td>135920</td><td>0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Seringa de 3 mL Plastipak 10.000 U/mL</td></tr><tr><td></td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide - Solução de 1,0 mg/mL em Água</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS&nbsp; Separador&nbsp;</td><td>Centrífuga Miltenyi Biotec GmBH</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall X Pro / ST Plus Series</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75009521</tr><tr><td>TER-119 Anticorpo Monoclonal (TER-119), APC</td><td>Invitrogen</td><td>17-5921-82</td><td>0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripano 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de populações microambientais de medula Óssea na síndrome mielodisplásica e leucemia mielóide aguda

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

O microambiente da medula óssea consiste em populações celulares distintas, como células estromais mesenquimais, células endoteliais, células osteolinhagens e fibroblastos, que fornecem suporte para células-tronco hematopoéticas (CTHs). Além de suportar as CTHs normais, o microambiente da medula óssea também desempenha um papel no desenvolvimento de doenças de células-tronco hematopoéticas, como síndromes mielodisplásicas (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA). Mutações associadas à SMD em HSCs levam a um bloqueio na diferenciação e falência progressiva da medula óssea, especialmente em idosos. A SMD pode frequentemente evoluir para LMA resistente à terapia, uma doença caracterizada por um rápido acúmulo de blastos mieloides imaturos. Sabe-se que o microambiente da medula óssea está alterado em pacientes com essas neoplasias mieloides. Aqui, um protocolo abrangente para isolar e caracterizar fenotipicamente células microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndrome mielodisplásica e leucemia mieloide aguda é descrito. Isolar e caracterizar as alterações nas populações de nicho da medula óssea pode ajudar a determinar seu papel na iniciação e progressão da doença e pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas direcionadas a alterações promotoras de câncer nas populações estromais da medula óssea.

Este artigo descreve um método baseado em citometria de fluxo para análise de populações microambientais da medula óssea, como células do estroma endotelial e mesenquimal, a partir de modelos murinos de SMD e leucemia (Figura 1). A Figura 2 ilustra a estratégia de gating para detecção das populações de interesse, iniciando-se com a seleção de células (P1) na fração digerida e CD45/Ter119 depletada através do perfil de dispersão anterior e lateral. Exemplos de ag...

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

Nossa pesquisa visa explorar como o ambiente em mudança da medula óssea influencia o crescimento do tumor. Desenvolvemos um protocolo de citometria de fluxo para analisar as células não imunes da medula óssea e dos tecidos ósseos, com foco nas neoplasias hematológicas murinas. Este método é adaptável para o estudo da medula óssea em vários modelos murinos.Nosso estudo se concentra em isolar e identificar alterações nas populações estromais da medula óssea durante a progressão do câncer. Compreender seu impacto no início e no avanço da doença pode abrir caminho para novos tratamentos que visam essas mudanças facilitadoras do câncer nas células estromais da medula óssea. Nosso protocolo combina exclusivamente digestãos mecânicas e enzimáticas, depleções magnéticas e citometria de fluxo para delinear a composição celular do microambiente da medula óssea.Destaca-se por empregar a separação magnética e incorporar células do osso e da medula, oferecendo uma representação mais abrangente desse microambiente.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping para a caracterização da diferenciação de megacaitos, e mostramos como essa estratégia permite a classificação de megacaiócitos em diferentes estágios com um classificador celular ativado pela fluorescência. A metodologia pode ser aplicada aos tecidos primários humanos, mas também aos megacaitos gerados na cultura in vitro.

Imunofenoftipagem e Triagem celular de MKs humanos de fontes primárias humanas ou in vitro diferenciados de progenitores hematopoiéticos

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Aqui, descrevemos um sistema microfisiológico padronizado e fácil de implementar que reflete a complexidade da estrutura in vivo da medula óssea humana, fornecendo um modelo pertinente para estudar finamente uma ampla gama de eventos normais e patológicos.

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Este protocolo serve como um esquema para a criação de um sistema funcional de Tet-ON em linhas de células de câncer e sua utilização posterior, em especial para estudar o papel das proteínas derivado de células de tumor no recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do tumor.

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

Aprenda a isolar populações estromais da medula óssea em modelos murinos de síndrome mielodisplásica e leucemia mielóide aguda usando citometria de fluxo. Este protocolo robusto revela alterações microambientais cruciais para o desenvolvimento de novas terapias contra cânceres hematológicos.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

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