Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

O objetivo geral deste protocolo é realizar um teste preciso de amostras de medula óssea de pacientes com leucemia mielóide aguda para doença residual mensurável, incluindo a quantificação de células-tronco de leucemia. Este método pode fornecer uma avaliação precisa da doença residual mensurável em amostras de medula óssea de pacientes com leucemia mieloide aguda. A principal vantagem dessa abordagem é que um acompanhamento rigoroso do protocolo produz resultados altamente reprodutíveis e de alta qualidade.

As implicações dessa técnica se estendem à tomada de decisões clínicas, pois pode ser usada como uma leitura da resposta dos pacientes ao tratamento. Demonstrando os procedimentos estarão Jeroen Janssen, hematologista, Gerrit Sijm, técnico do laboratório de hematologia diagnóstica e Jennifer Scheick e Sander Snel, técnicos da equipe MRD. Com o paciente em decúbito lateral, marque a espinha ilíaca posterior superior com uma caneta e desinfete a pele da área de biópsia pretendida com clorexidina 0,5 a 1% em etanol em movimentos circulares para fora.

Depois de administrar um anestésico local, pegue uma agulha de calibre 15 de 2,8 polegadas com a extremidade proximal na palma da mão e o dedo indicador contra o lado da haste de metal da agulha perto da ponta para controle. Usando uma pressão suave, mas firme, introduza a agulha com um movimento rápido alternado de pronação e supinação através da pele anestesiada em direção à coluna ilíaca. Quando a agulha entrar em contato com a espinha ilíaca posterior, remova a estilette e coloque uma seringa vazia de 10 mililitros na agulha.

Retire suavemente o êmbolo para criar pressão negativa dentro da seringa até que até 10 mililitros de espículas da medula óssea tenham sido colhidos. Não tome mais de 10 mils de medula óssea por aspirado para evitar hemodiluição. Retire a seringa e volte a colocá-la na agulha.

Em seguida, ejete cerca de dois mililitros da medula em um vidro de relógio e certifique-se de que uma amostra suficiente seja coletada para ser injetada em um tubo de oito mililitros revestido de heparina e inverta imediatamente o tubo. Para evitar a coagulação, é importante investir o tubo contendo anticoagulante assim que a medula óssea for adicionada. Para uma avaliação morfológica ideal, use uma espátula de plástico para transferir espículas do aspirado no vidro do relógio para uma lâmina de vidro e deslize cuidadosamente outra lâmina de vidro sobre a medula.

Após a secagem, corar as espículas com May-Grunwald Giemsa para análise por microscopia de luz. Coloque o tubo de medula óssea em um suporte de plástico e coloque o suporte em um recipiente de plástico com um pacote de gel ambiente e um formulário de solicitação preenchido. Antes de analisar a medula óssea por citometria de fluxo, inicie o citômetro de fluxo e abra o software de análise de citometria de fluxo para criar um novo experimento com um gráfico de pontos de dispersão direta versus lateral.

Para avaliação do tamanho e granularidade das células, carregue células sanguíneas periféricas lisadas não marcadas de um doador saudável e selecione a função Adquirir células. Bloqueie os linfócitos e ajuste as tensões de dispersão direta e lateral para atingir os valores-alvo médios apropriados para a população de células fechadas. Em seguida, adquira dados para pelo menos 10.000 eventos.

Para configurar as tensões do tubo fotomultiplicador do canal de florescência alvo, primeiro use partículas de calibração de esferas de arco-íris de oito picos de acordo com as instruções do fabricante para adquirir 10.000 eventos a uma baixa taxa de fluxo. Gate as contas singlete no gráfico de pontos de dispersão direta versus lateral seguida pelo 7º pico no gráfico de pontos FITC-PE. Gate as populações de grânulos resultantes para cada fluoróforo.

Continue a aquisição da suspensão de cordão arco-íris de oito picos e ajuste e ajuste as tensões PMT em todos os canais de fluorescência para atingir os valores MFI alvo de acordo com as instruções do fabricante. Use Record para coletar dados de cerca de 2.000 eventos e verifique o MFI para as contas do 7º pico. Em seguida, adicione um volume suficiente de cada anticorpo conjugado com flourocromo experimental para corar as contas nos tubos de florescência correspondentes menos um controle e vórtice os tubos completamente.

Crie um novo experimento em branco com os mesmos parâmetros de compensação, cuidando para que o limite de dispersão direta seja definido como 5.000 e os valores de compensação de todos os flourocromos sejam zero. Para criar os controles de compensação, selecione a função Criar controle de compensação e carregue o tubo de controle não corado. Ajuste a porta P1 ao redor da população de contas singlete e confirme se a porta P1 contém apenas contas singlete.

Clique com o botão direito do mouse na porta P1 e selecione Aplicar a todos os controles de compensação. Em seguida, registre os dados de todos os tubos de florescência rotulados individualmente, confirmando que a porta P2 abrange a população positiva em cada histograma de florescência. Para corar as células para análise por citometria de fluxo, transportar a medula óssea para o laboratório, verificar o formulário de solicitação para verificar o número do estudo do paciente e a data de nascimento e determinar o que precisa ser corado.

Para MRD, usamos um painel de coloração composto por quatro tubos. Aqui demonstramos a coloração do painel LSC que consiste em um tubo. Após a contagem de células, transfira o volume apropriado de medula óssea para um novo tubo de 15 mililitros.

Adicione tampão de lise a 10 vezes o volume celular experimental para lisar os glóbulos vermelhos. Inverta o tubo para misturar e incubar as células por 10 minutos em temperatura ambiente. No final do período de lise, peletizar as células por centrifugação.

Ressuspenda as células em 15 mililitros de tampão de lavagem à temperatura ambiente e colha o pellet celular novamente por centrifugação. Enquanto isso, pipetar a quantidade apropriada de solução de coquetel de anticorpos em tubos FACS de cinco mililitros. Aqui é mostrado o painel para o tubo de células-tronco.

Ressuspenda o pellet em tampão de lavagem e adicione a suspensão da célula ao tubo FACS contendo a solução de coquetel de anticorpos monoclonais para uma incubação de 15 minutos no escuro. Em seguida, lave as células em tampão de lavagem e peletize as células por centrifugação. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 400 microlitros de tampão de lavagem fresco.

Para analisar as células-tronco leucêmicas, adicione quatro microlitros de esferas em branco à suspensão celular que é corada com o coquetel de anticorpos de células-tronco. Em seguida, leia as amostras usando os parâmetros previamente definidos, adquirindo pelo menos quatro vezes 10 elevado ao 6º eventos das amostras experimentais dos pacientes. Para identificar o imunofenótipo associado à leucemia observado em aproximadamente 90% dos pacientes com leucemia mielóide aguda, é crucial que as comportas de segurança sejam ajustadas adequadamente, conforme ilustrado.

Aqui, são mostrados exemplos de dados de pacientes individuais que abrigam diferentes tipos de aberração nas células primitivas CD34-positivas. Nesses gráficos, um paciente que permanece em remissão completa e um paciente que recidivou após ter resultados positivos mensuráveis de doença residual após o segundo ciclo de terapia de indução podem ser observados, ressaltando a necessidade de um ajuste preciso do portão antes da análise da amostra. A identificação e quantificação de LSC requer análise adicional de aberrâncias especificamente em células blásticas CD34-positivas CD38-negativas, conforme mostrado nesses gráficos.

Ao realizar este protocolo, é muito importante ter pessoal especializado e de apoio para a amostragem da medula óssea, o transporte, o trabalho experimental e as etapas de análise deste procedimento. Este procedimento também pode ser usado para realizar análises citogenéticas e moleculares para responder a perguntas adicionais sobre a correlação entre populações de células específicas e aberrações moleculares de interesse, ou para refinar o grupo de risco de um paciente para prever o resultado clínico. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da hematologia explorarem a doença residual em pacientes com LMA após o tratamento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificamos e quantificamos com precisão a doença residual usando citometria de fluxo, incluindo a coleta e o transporte de amostras de medula óssea de pacientes com LMA.