Name: Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a detectar doença residual mensurável em amostras de medula óssea de pacientes com leucemia mieloide aguda usando citometria de fluxo. Este protocolo padronizado garante resultados reprodutíveis para decisões clínicas.

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Esta pesquisa foi apoiada pela sociedade holandesa de câncer (ALPE 2013-6371) e Fundação de Egbers por VONK. Agradecemos o grupo de trabalho de LMA-MRD holandês para a colaboração e frutíferos debates para melhoria contínua e padronização de LMA-MRD.

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<li>Ravandi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+minimal+residual+disease+assessed+by+multiparameter+flow+cytometry+is+highly+prognostic+in+younger+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia.</a> Cancer. 123 (3), 426-435 (2017).</li>
<li>Hourigan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurable+residual+disease+testing+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia.</a> Leukemia. 31 (7), 1482-1490 (2017).</li>
</ol>

Os cocktails de anticorpo usados para a validação do tubo células-tronco em vários institutos independentes foram gentilmente cedidos pela BD. Os autores não têm nada para divulgar em relação a este manuscrito.

Amplos dados estão disponíveis, que apresentam evidências de positividade MRD, sendo associada com a sobrevivência do pobre, e, portanto, avaliação MRD pode melhorar o resultado do paciente, fornecendo informações adicionais de prognósticos sobre as quais decisões clínicas podem ser feitas. Portanto, um método consistente e harmonizado para avaliação imuno-fenotípica de MRD é essencial para, finalmente, melhorar o tratamento do paciente. Isto também é importante ao comparar estudos clínicos através de centros clínicos diferentes, e pode, finalmente, ajuda na clínica a decisão fazendo e servindo como um ponto de extremidade clínico substituto para sobrevivência global. A noção de que orientações sólidas são garantidas para medições de MRD precisas e consistentes tem levado a uma acção concertada de rede europeia de leucemia (ELN), de diretrizes de design do estado da arte. Este documento abrangente será publicado atrasado-2017 e será fundamental para muitos grupos de estudo e laboratórios a avançar.
Passos críticos dentro do protocolo
Um aspecto importante e muitas vezes esquecido da análise MRD é o impacto da qualidade da amostra na determinação precisa da MRD. Isto é mais evidente quando o material tem que ser transportado para outros institutos em testes clínicos globais, tendo em conta as considerações operacionais adicionais que precisam ser tomadas em consideração neste cenário. Para reduzir o risco de mistura-se paciente informações e entrega oportuna da administração adequada de amostras é crucial. Novamente, nesta fase do transporte as formas corretas e/ou importação em sistemas eletrônicos de hospital com atribuições claras das análises solicitadas é necessária. Observar o estágio em terapia da amostragem MRD é também crucial, uma vez que pode ser relevante para a decisão clínica (por exemplo após o segundo curso de terapia) e, portanto, deve ser definido claramente. O uso de dados fictícios (como por exemplo 1 de janeiro por ano de nascimento) aumenta o risco de mistura-se análises ou pacientes. Se exigido por lei, uma forma alternativa de anónimos de identificação deve ser usada.
Todos os espécimes para immunophenotyping devem ser processados, preferencialmente dentro de 24 h de coleção. Embora não recomendável, amostras de sangue periférico e medula óssea ainda podem ser processadas e analisadas quando mantidos até 72 h à temperatura ambiente. Além disso, a todos os manejos com o material melhor podem ser realizados em condições estéreis, portanto mais criopreservação de células em biobancos (locais) continua a ser relevante: muitos estudos clínicos têm análises adicionais para investigar mais células de leucemia com respeito às características moleculares, imuno-fenotípica e funcionais para ser executada em um estágio posterior. No entanto, detalhes de biobanking não são no âmbito deste manuscrito.
Usando MRD como uma ferramenta de diagnóstico implica que ele precisa de um laboratório acreditado, não só por citometria de fluxo, mas também em matéria de controlo de qualidade da avaliação de MRD. Isso pode exigir a distribuição de amostras aos laboratórios de referência específica ou (re) analisando arquivos de fluxo com as medições de MRD por equipes de referência.
Este artigo descreve as ações mais importantes da coleção de aspirado de medula óssea para determinação de MRD em amostras clínicas - exigindo uma equipe inteira de especialistas com tarefas específicas, responsabilidades e com a comunicação frequente para efetiva caracterização e análise. Uma vez que cada tarefa é crucial para o procedimento, é recomendável ter som logística incluindo protocolos em cada laboratório e pessoal suficiente de backup que foram treinado especificamente para a tarefa. Além disso, uma vez que existem algumas etapas relativamente subjetivas em parte dos procedimentos (especialmente LAIP e LSC identificação de marcador aberrante), é essencial ter discussões sobre o resultado final pela equipe, e ter o relatório final autorizado por uma equipe de supervisores. Os esforços atuais buscam o desenvolvimento de software de computador que vai ajudar a uniformizar a análise MRD (LAIP e LSC).
Modificação e resolução de problemas
Cada laboratório pode ter seu próprio conjunto de anticorpos que podem ser usados para definir as diferentes subpopulações, apesar de ter uma espinha dorsal padronizada dos marcadores é essencial para resultados comparáveis, conforme descrito nas diretrizes de estado da arte da ELN para documento de medições de MRD acima referido. Independentemente dos marcadores de escolhido, há algumas questões que podem dificultar a análise dos resultados e precisa ser levado em consideração.
Limitações da técnica
A identificação da expressão de marcador aberrante LAIP e LSC primeiro é avaliada no momento do diagnóstico e monitorizada ao longo do tempo (durante e após a terapia) para a caracterização exata do fenótipo MRD. Enquanto mais 95% dos pacientes podem ser avaliadas através de LAIP LSC (ou ambos), ainda alguns pacientes tem não LAIPs definidos ou nenhum CD34 + CD38-LSCs apresentam com explosões de CD34 negativos ou tem uma amostra de diagnóstico a falta. Nesses casos, é ainda vale a pena tentar e medir MRD com um painel de anticorpos tão amplas como o número de células disponíveis permite e, em seguida, selecione o mais confiável (dando a mais forte distinção das células leucêmicas) LAIP. Considerando que uma proporção de pacientes que, finalmente, ter uma recaída não completamente se assemelham o imunofenótipo de diagnóstico, devido à heterogeneidade da doença AML, medir um amplo painel de anticorpos no MRD recomenda-se de qualquer maneira. Estes turnos imunofenotípica incluem blastos e LSCs e foram mostrados para ocorrer durante a terapia16 e a doença mensurável pode basear-se nestas populações próximas so-called. Neste momento, no entanto, não foi determinado se todos imunofenotípica sub-populações conduzirá a recaída da doença, e, portanto, prática não comum para relatar MRD adaptados-terapia baseia-se nessas células em ensaios clínicos. É importante observar que o risco de perder a LSC devido a deslocamentos de população é reduzido com a aproximação de um tubo em que os marcadores mais importantes de definição aberrancy estão em um fluxo cytometry (PE) canal14.
Importância no que diz respeito a métodos existentes
O método descrito neste protocolo baseia-se na definição de um ou mais LAIPs, que as células são seguidas durante a terapia. Uma desvantagem deste método é que recentemente mostrou que Roberto pode mudar durante a terapia. Desta forma, que algumas populações próximas com diferentes marcadores aberrantes podem ser perdidas. Para contornar isso, seria melhor medir todos os marcadores aberrantes em vez de apenas aquelas encontradas no momento do diagnóstico. Isto então seria semelhante à abordagem "diferente do normal" é usado por vários laboratórios17.
Aplicações futuras
Recentemente, MRD tem recebido atenção extra para projeto novo de julgamento clínico. Na era das opções de tratamento especializado e terapia com drogas específicas, o uso de MRD como uma medida de resultado irá reduzir o tempo necessário para estabelecer a eficácia clínica de novos tratamentos, em última análise, permitindo a introdução mais rápida de urgentemente necessária terapêutica opções para a clínica. O significado de logística adequada e execução prática de uma avaliação de MRD harmonizada são cruciais para o sucesso futuro do tratamento LMA como o FDA está atualmente investigando a viabilidade do uso de MRD como um ponto de extremidade do substituto em vez de sobrevivência global mede18.

Leucemia mieloide aguda (LMA) é que um tumor maligno da medula óssea caracterizadas por defeitos no programa de maturação, com proliferação anormal e acúmulo de células progenitoras mieloides, inibição da hematopoiese normal e, finalmente, falha da medula óssea . A doença é altamente heterogênea no que diz respeito a morfologia, imunofenótipo, citogenética, moleculares aberrações e assinaturas de expressão do gene, bem como a resposta do tratamento e tratamento resultado1,2. Gestão atual inclui quimioterapia de indução com o objectivo de atingir a remissão completa (CR), seguida por pós-remissão tratamento, que é guiado em grande parte pelos resultados de molecular, citogenética e imunofenotípica estudos e consiste tanto vários cursos de quimioterapia adicional ou transplante de células-tronco (autólogo ou alogênico)3. Apesar das taxas de remissão alta após quimioterapia intensiva de até 90%, sobrevida de 5 anos em adultos é somente aproximadamente 30% a 40%, principalmente devido ao desenvolvimento de recaídas que são geralmente resistente à quimioterapia e, assim, muito difícil de tratar. Resultado nas crianças é melhor, embora aproximadamente um terço também uma recaída. Portanto, a deteção adiantada de recaída iminente irá preencher uma necessidade médica não atendida e guie remissão após terapia4.
Doença residual após terapia pode refletir a soma de todos os diagnóstico e fatores/mecanismos de resistência pós-diagnóstico; Portanto, sua medição pode ser instrumental para orientar o tratamento e prognóstico. A possibilidade de deﬁning doença residual (anteriormente chamada de doença residual mínima e agora referida como mensurável de doença residual ou MRD) muito abaixo do critério morfológico de 5% de blastos está mudando a paisagem de risco classiﬁcation. Atualmente, os dois métodos utilizados principalmente para detectar MRD estão fluxo cytometry-molecular baseada e, este último sendo avaliada pela transcriptase reversa PCR (RT-qPCR)5 ou, embora numa fase prematura, pela próxima geração (NGS) de sequenciamento. Muitos estudos em adultos, bem como em crianças já demonstraram que várias abordagens MRD fornecem informação prognóstica forte na LMA, tanto após a indução e consolidação terapia6,7e uma nova definição de doença fardo ( superior ao CR morfológica) está a emergir8. Isto sugere que MRD avaliados pelo fluxo e/ou técnicas moleculares devem tornar-se e na verdade são já se tornando, padrão em cada ensaio clínico na LMA.
Este manuscrito descreve o procedimento de citometria de fluxo detalhado para obter uma caracterização imunofenotípica precisos e reprodutíveis de MRD em amostras de medula óssea, incluindo a recolha de amostras de medula óssea e procedimentos anteriores de citometria de fluxo de processamento. A disponibilidade das amostras de medula óssea de boa qualidade no diagnóstico e acompanhamento é crucial para o sucesso desta medida em locais clínicos e ensaios clínicos. Na verdade, estas considerações pré-analíticas são também de abordagens MRD de vital importância para molecular (PCR e NGS). Para caracterização imunofenotípica de MRD, aberrantly expressas marcadores são combinados com normal mieloide e marcadores do progenitor, para identificar um imunofenótipo associada a leucemia (LAIP)9. MRD mede a resultante de muitos fatores que influenciam a resposta à terapia, tais como resistência a drogas leucemia intrínseca ou adquirida, farmacodinâmica e cinética da terapia, vigilância imunológica e conformidade. Portanto, MRD é um parâmetro prognóstico muito forte de pós-diagnóstico associado com resultados clínicos quando dicotomizado em um nível de limite determinado pela análise característica operacional receptor (ROC). Para nosso adulto coorte de LMA da 42a HOVON estudo, o nível de limiar é fixado em 0,1% de LAIP células positivas/total de leucócitos. Usando este critério para determinar o status de MRD positivos vs negativos, um grupo de pacientes pode ser identificado que têm uma incidência de recaída significativamente pior, sobrevivência livre de recaída e total6. Além disso, descrevemos a medição das células de leucemia imaturos, resistentes aos medicamentos com características de células estaminais (células-tronco CD34 + CD38-leucemia, ou LSC), que oferece um forte preditor de resultado paciente10. Juntos LAIP e LSC aproxima-se forma a abordagem MRD fluxo cytometric. A abordagem LAIP é apropriada para cerca de 90% dos pacientes, enquanto que a abordagem do LSC pode ser aplicada em cerca de 80% dos pacientes. Junto sobre 95% dos pacientes podem ser avaliados para um parâmetro, ou ambos.
Por último, esta publicação fornece uma descrição detalhada e operacional para avaliar MRD por citometria de fluxo. Isto inclui: 1) harmonização e/ou padronização de procedimentos de recolha de amostras de medula óssea, orientação de transporte 2) amostra 3) descrição detalhada da detecção de células leucêmicas com FACS usando vários painéis de anticorpos, incluindo abordagens de tubo de célula única para caracterizar a LSC, 4) set-up dos FACS máquinas para medições padronizadas, 5) programas analíticos para medições de MRD e 6) programas analíticos para a deteção da LSC.
Nosso objetivo é mostrar todas as facetas do processo, incluindo a preparação da amostra, uma vez que raramente é discutido enquanto é uma questão importante para a qualidade do resultado final. Biópsia e aspiração de medula óssea são procedimentos clínicos usados para avaliar as células hematopoiéticas dentro da medula óssea. Estas são realizadas em conjunto com um hemograma completo (CBC) e o esfregaço de sangue. O método ideal para aspiração de medula óssea é crucial para o diagnóstico preciso e o acompanhamento para medição de MRD. Além disso, um aspirado de medula de óssea bem sucedida deve conter células suficientes para executar a análise de fluxo LAIP e LSC (pelo menos 10 milhões células viáveis). Aqui, descrevemos o método para a realização de uma aspiração de medula óssea e fornecer orientações, que devem resultar em adequado célula amostragem (e limite o potencial de hemodiluição) necessários para diagnósticos precisos e pesquisa adicional. Estas considerações pré-analíticas são também de abordagens MRD de vital importância para molecular (PCR e NGS). Todos os espécimes para immunophenotyping devem ser processados, preferencialmente dentro de 24 h de coleção. Embora não recomendável, amostras de sangue periférico e medula óssea ainda podem ser processadas e analisadas quando mantidos até 72 h à temperatura ambiente. Além disso, todos os manejos com o material devem ser realizados sob condições estéreis, a fim de permitir a criopreservação de células estéreis para posterior avaliação de pesquisa/qualidade etc.

<table><tbody><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>120995496,060996589 e 013729</td><td>FACS Canto II&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555360</td><td>CD7 FITC</td></tr><tr><td></td><td>DAKO</td><td>F076701</td><td>CD2 FITC</td></tr><tr><td></td><td>Sanquin</td><td>M1613</td><td>CD36 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332778</td><td>CD15 FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>335039</td><td>CD45RA FITC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345785</td><td>CD14 PE</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-801</td><td>CD133 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562566</td><td>Clec12a PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>565568</td><td>Tim-3 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>332774</td><td>CD7 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333142</td><td>CD11b PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>337899</td><td>CD22 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345810</td><td>CD56 PE</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td>CD34 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>558714</td><td>CD123 PERCP-CY5.5</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>B49221</td><td>CD117 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562854</td><td>CD33 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345791</td><td>CD19 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>333143</td><td>CD11b APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345800</td><td>CD33 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>345807</td><td>CD38 APC</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>641411</td><td>HLA-DR APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>560532</td><td>CD44 APC-H7</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>562596</td><td>CD13 BV421</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>348811</td><td>CD34 PE-CY7</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>A96416</td><td>CD45 Krome Orange</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655873</td><td>CD45 HV500c</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>contas CST&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>solução</td></tr><tr><td></td> de lise farmacêutica <td>BD Biosciences</td><td>644204</td><td>Multicolor CompBeads</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td>contas</td></tr><tr><td></td> CST <td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva software</td></tr><tr><td></td><td>Cytognos</td><td></td><td>Infinicyt&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>Euroflow RCP-30-5a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Tuerk solução</td></tr><tr><td></td><td>Spherotech</td><td>BCP-100-5</td><td>Partículas de Calibração em Branco Beads</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>HSA</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Azida</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>ddH2O</td></tr></tbody></table>

protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Critérios de resposta na leucemia mieloide aguda (LMA) foi recentemente re-estabelecido, com exame morfológico utilizado para determinar se os pacientes atingiram remissão completa (CR). Aproximadamente metade dos pacientes adultos que entraram CR será uma recaída dentro de 12 meses devido a consequência de células residuais de LMA na medula óssea. A quantificação destes restantes células de leucemia, conhecidas como doença residual mínima ou mensurável (MRD), pode ser um biomarcador robusto para a previsão dessas recaídas. Além disso, uma análise retrospectiva de vários estudos demonstrou que a presença de MRD na medula óssea de pacientes LMA correlaciona-se com a sobrevivência do pobre. Não só é o total da população leucêmicas, refletida pelas células abrigar uma leucemia associada imune-fenótipo (LAIP), associado com resultados clínicos, mas assim é a subpopulação de imaturos de baixa frequência de leucemia células-tronco (LSC), ambos dos quais podem ser monitorado através de citometria de fluxo MRD ou MRD-como abordagens. A disponibilidade dos ensaios sensíveis que permitem a detecção de células de leucemia residual (haste) com base nas características de doenças específicas ou doença associada (marcadores moleculares anormais ou aberrante immunophenotypes) tem avaliação de MRD drasticamente melhorada na LMA. No entanto, dada a heterogeneidade inerente e a complexidade da LMA como uma doença, métodos para a recolha de medula óssea e realizando análise MRD e LSC devem harmonizar quando possível. Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia detalhada de aspirado de medula de óssea adequada amostragem, transporte, processamento para avaliação de citometria de fluxo de multi cor ideal e retenção de estratégias para avaliar MRD e LSC para auxiliar na tomada de decisão terapêutica da amostra para pacientes com LMA.

Em 90% dos pacientes LMA LAIP pelo menos um pode ser identificado. A fim de gerar as percentagens precisas de células LAIP + das células primitivas explosão no momento do diagnóstico, a configuração apropriada do portão de explosão é crucial e precisa de verificação como visualizado na Figura 3. Um exemplo de cada paciente, abrigando um tipo específico de aberrancy sobre as células CD34 + primitivas é visualizado na Figura 5. Para medição de MRD no follow-up, as anteriormente definido LAIP + células são bloqueadas e definidas como a percentagem de células LAIP + do WBC. Portanto, a configuração deste portão é crucial para alcançar os resultados MRD a razão. A Figura 6 mostra um paciente que recaídas depois de ter resultados positivos MRD (≥ 0,1%) e um paciente que permanece em remissão completa após o segundo ciclo da terapia de indução.
O protocolo atual só é adequado para definir as células-tronco em células CD34 +, desde a caracterização completa deste compartimento tem mostrado que o CD38-população abriga as células-tronco mais potentes como fração. A fim de separar o CSS dentro dessa fração da LSC, marcadores adicionais são usados. Marcadores mais frequentemente selecionadas para distinguir LSC são CD45RA e o canal de combi abrigando 6 marcadores específicos do LSC rotulados com PE. Com base em novas avaliações clínicas, um nível de corte de ≥ 0,004% foi definido como LSC-positivo e foi associado com pior sobrevivência no momento do diagnóstico, enquanto um nível de corte de 0,0001% foi usado no seguindo-acima de10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig1.jpg"> Figura 1 : Esfregaço de medula óssea. A) saudável doador e paciente B) AML (subtipo FAB 5). Mancha de Giemsa mostrada na ampliação de 100x. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig2.jpg"> Figura 2 : Corrigir o material de embalagem de fluidos biológicos. Mais detalhes sobre as regras e regulamentos do transporte de fluidos biológicos podem ser encontradas no site15 de centros de controle e prevenção de doenças. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig3.jpg"> Figura 3 : Estratégia para a definição de blastos de gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + explosões.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig4.jpg"> Figura 4 : Gating linfócitos. A) células azul WBC mostrado na trama do FSC/SSC, células B) verde são linfócitos caracterizados por CD45alta/SSCbaixa, C) são exemplos de negatividade para CD34, D) negatividade para CD117 e negatividade E) para CD13, F) os diferentes tipos de células são mostrados em uma árvore de população de visão geral. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig5.jpg"> Figura 5 : LAIPs no momento do diagnóstico da LMA. A) LAIP baseado em cruz linhagem aberrancy (CD7 expressando células CD33), B) LAIP baseado na diferenciação assíncrona (CD11b na células expressando CD13), C) LAIP baseado em superexpressão em comparação com células normais (CD34muito alta na CD13 expressando células), D). LAIP baseado no underexpression em comparação com células normais (HLA-DRbaixa CD33 expressando células). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig6.jpg"> Figura 6 : LAIP seguido durante a terapia. Definição de LAIP A) no momento do diagnóstico (CD34 + / CD13 + / CD33-) e perda de LAIP durante o seguimento em um paciente que permaneceram em remissão completa contínua, definição de LAIP B) no momento do diagnóstico (CD117 + / CD7 + / CD33 +) e persistência de LAIP durante o seguimento em um paciente que teve uma recaída. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56386/56386fig7.jpg"> Figura 7 : Retenção de células-tronco. Um) Gating das diferentes CD34 + CD38 populações com base em grânulos (CD38baixa está abaixo da margem superior dos grânulos, enquanto CD38muito baixo são definidos como as verdadeiras células negativas representando a LSC e situam-se abaixo da mediana dos grânulos), B) dois exemplos de pacientes com distinção entre HSC e LSC no acompanhamento baseada CD45RAneg e CD45RApos expressão. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/56386fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo suplementar 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_1.pdf" target="_blank">Clique aqui para downoad este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Sampling_Form_MRD_2.pdf" target="_blank">Clique aqui para downoad este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56386/Supplementary_information_revised_Cloos_et_al_final2018.docx" target="_blank">Clique aqui para downoad este arquivo.</a>

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

O objetivo geral deste protocolo é realizar um teste preciso de amostras de medula óssea de pacientes com leucemia mielóide aguda para doença residual mensurável, incluindo a quantificação de células-tronco de leucemia. Este método pode fornecer uma avaliação precisa da doença residual mensurável em amostras de medula óssea de pacientes com leucemia mieloide aguda. A principal vantagem dessa abordagem é que um acompanhamento rigoroso do protocolo produz resultados altamente reprodutíveis e de alta qualidade.As implicações dessa técnica se estendem à tomada de decisões clínicas, pois pode ser usada como uma leitura da resposta dos pacientes ao tratamento. Demonstrando os procedimentos estarão Jeroen Janssen, hematologista, Gerrit Sijm, técnico do laboratório de hematologia diagnóstica e Jennifer Scheick e Sander Snel, técnicos da equipe MRD. Com o paciente em decúbito lateral, marque a espinha ilíaca posterior superior com uma caneta e desinfete a pele da área de biópsia pretendida com clorexidina 0,5 a 1% em etanol em movimentos circulares para fora.Depois de administrar um anestésico local, pegue uma agulha de calibre 15 de 2,8 polegadas com a extremidade proximal na palma da mão e o dedo indicador contra o lado da haste de metal da agulha perto da ponta para controle. Usando uma pressão suave, mas firme, introduza a agulha com um movimento rápido alternado de pronação e supinação através da pele anestesiada em direção à coluna ilíaca. Quando a agulha entrar em contato com a espinha ilíaca posterior, remova a estilette e coloque uma seringa vazia de 10 mililitros na agulha.Retire suavemente o êmbolo para criar pressão negativa dentro da seringa até que até 10 mililitros de espículas da medula óssea tenham sido colhidos. Não tome mais de 10 mils de medula óssea por aspirado para evitar hemodiluição. Retire a seringa e volte a colocá-la na agulha.Em seguida, ejete cerca de dois mililitros da medula em um vidro de relógio e certifique-se de que uma amostra suficiente seja coletada para ser injetada em um tubo de oito mililitros revestido de heparina e inverta imediatamente o tubo. Para evitar a coagulação, é importante investir o tubo contendo anticoagulante assim que a medula óssea for adicionada. Para uma avaliação morfológica ideal, use uma espátula de plástico para transferir espículas do aspirado no vidro do relógio para uma lâmina de vidro e deslize cuidadosamente outra lâmina de vidro sobre a medula.Após a secagem, corar as espículas com May-Grunwald Giemsa para análise por microscopia de luz. Coloque o tubo de medula óssea em um suporte de plástico e coloque o suporte em um recipiente de plástico com um pacote de gel ambiente e um formulário de solicitação preenchido. Antes de analisar a medula óssea por citometria de fluxo, inicie o citômetro de fluxo e abra o software de análise de citometria de fluxo para criar um novo experimento com um gráfico de pontos de dispersão direta versus lateral.Para avaliação do tamanho e granularidade das células, carregue células sanguíneas periféricas lisadas não marcadas de um doador saudável e selecione a função Adquirir células. Bloqueie os linfócitos e ajuste as tensões de dispersão direta e lateral para atingir os valores-alvo médios apropriados para a população de células fechadas. Em seguida, adquira dados para pelo menos 10.000 eventos.Para configurar as tensões do tubo fotomultiplicador do canal de florescência alvo, primeiro use partículas de calibração de esferas de arco-íris de oito picos de acordo com as instruções do fabricante para adquirir 10.000 eventos a uma baixa taxa de fluxo. Gate as contas singlete no gráfico de pontos de dispersão direta versus lateral seguida pelo 7º pico no gráfico de pontos FITC-PE. Gate as populações de grânulos resultantes para cada fluoróforo.Continue a aquisição da suspensão de cordão arco-íris de oito picos e ajuste e ajuste as tensões PMT em todos os canais de fluorescência para atingir os valores MFI alvo de acordo com as instruções do fabricante. Use Record para coletar dados de cerca de 2.000 eventos e verifique o MFI para as contas do 7º pico. Em seguida, adicione um volume suficiente de cada anticorpo conjugado com flourocromo experimental para corar as contas nos tubos de florescência correspondentes menos um controle e vórtice os tubos completamente.Crie um novo experimento em branco com os mesmos parâmetros de compensação, cuidando para que o limite de dispersão direta seja definido como 5.000 e os valores de compensação de todos os flourocromos sejam zero. Para criar os controles de compensação, selecione a função Criar controle de compensação e carregue o tubo de controle não corado. Ajuste a porta P1 ao redor da população de contas singlete e confirme se a porta P1 contém apenas contas singlete.Clique com o botão direito do mouse na porta P1 e selecione Aplicar a todos os controles de compensação. Em seguida, registre os dados de todos os tubos de florescência rotulados individualmente, confirmando que a porta P2 abrange a população positiva em cada histograma de florescência. Para corar as células para análise por citometria de fluxo, transportar a medula óssea para o laboratório, verificar o formulário de solicitação para verificar o número do estudo do paciente e a data de nascimento e determinar o que precisa ser corado.Para MRD, usamos um painel de coloração composto por quatro tubos. Aqui demonstramos a coloração do painel LSC que consiste em um tubo. Após a contagem de células, transfira o volume apropriado de medula óssea para um novo tubo de 15 mililitros.Adicione tampão de lise a 10 vezes o volume celular experimental para lisar os glóbulos vermelhos. Inverta o tubo para misturar e incubar as células por 10 minutos em temperatura ambiente. No final do período de lise, peletizar as células por centrifugação.Ressuspenda as células em 15 mililitros de tampão de lavagem à temperatura ambiente e colha o pellet celular novamente por centrifugação. Enquanto isso, pipetar a quantidade apropriada de solução de coquetel de anticorpos em tubos FACS de cinco mililitros. Aqui é mostrado o painel para o tubo de células-tronco.Ressuspenda o pellet em tampão de lavagem e adicione a suspensão da célula ao tubo FACS contendo a solução de coquetel de anticorpos monoclonais para uma incubação de 15 minutos no escuro. Em seguida, lave as células em tampão de lavagem e peletize as células por centrifugação. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 400 microlitros de tampão de lavagem fresco.Para analisar as células-tronco leucêmicas, adicione quatro microlitros de esferas em branco à suspensão celular que é corada com o coquetel de anticorpos de células-tronco. Em seguida, leia as amostras usando os parâmetros previamente definidos, adquirindo pelo menos quatro vezes 10 elevado ao 6º eventos das amostras experimentais dos pacientes. Para identificar o imunofenótipo associado à leucemia observado em aproximadamente 90% dos pacientes com leucemia mielóide aguda, é crucial que as comportas de segurança sejam ajustadas adequadamente, conforme ilustrado.Aqui, são mostrados exemplos de dados de pacientes individuais que abrigam diferentes tipos de aberração nas células primitivas CD34-positivas. Nesses gráficos, um paciente que permanece em remissão completa e um paciente que recidivou após ter resultados positivos mensuráveis de doença residual após o segundo ciclo de terapia de indução podem ser observados, ressaltando a necessidade de um ajuste preciso do portão antes da análise da amostra. A identificação e quantificação de LSC requer análise adicional de aberrâncias especificamente em células blásticas CD34-positivas CD38-negativas, conforme mostrado nesses gráficos.Ao realizar este protocolo, é muito importante ter pessoal especializado e de apoio para a amostragem da medula óssea, o transporte, o trabalho experimental e as etapas de análise deste procedimento. Este procedimento também pode ser usado para realizar análises citogenéticas e moleculares para responder a perguntas adicionais sobre a correlação entre populações de células específicas e aberrações moleculares de interesse, ou para refinar o grupo de risco de um paciente para prever o resultado clínico. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da hematologia explorarem a doença residual em pacientes com LMA após o tratamento.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificamos e quantificamos com precisão a doença residual usando citometria de fluxo, incluindo a coleta e o transporte de amostras de medula óssea de pacientes com LMA.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve a técnica de aspiração da medula óssea da coluna ilíaca e a preparação do esfregaço para biópsia. No exemplo, realizamos aspiração de medula óssea de um paciente com leucemia mieloide aguda (LMA) e examinamos as células para verificar se há doença residual mensurável (MRD), um importante biomarcador prognóstico.

Aspiração de medula óssea: um método para obter medula óssea para examinar a morfologia celular

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Aqui, um método baseado em citometria de fosfofluxo é descrito para analisar a sinalização a jusante das vias mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide humana aguda xenoenxertadas em camundongos e obtidas de aspirados de medula óssea. Os níveis de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 são medidos simultaneamente usando um citômetro de fluxo espectral de última geração com alta sensibilidade.

Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de amostras de glioma pontino intrínsecas difusas post-mortem para o estabelecimento de modelos de culturas de células derivadas de pacientes ou caracterização directa de células tumorais e microambiente.

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Este protocolo descreve o uso de centrífuga elutriation para separar as células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular.

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

A cultura ex vivo de explantas ósseas pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia óssea e a avaliação potencial de medicamentos na remodelagem óssea e doenças ósseas. O protocolo apresentado descreve a preparação e a cultura de calvarias isoladas de crânios de camundongos recém-nascidos, bem como suas aplicações.

Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

Aprenda a detectar doença residual mensurável em amostras de medula óssea de pacientes com leucemia mieloide aguda usando citometria de fluxo. Este protocolo padronizado garante resultados reprodutíveis para decisões clínicas.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda (Vídeo) | JoVE Journal

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