Name: Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a integrar microscopia intravital com ressonância magnética em modelo de câmara de janela dorsal em camundongos. Este método combina alta resolução óptica com penetração profunda para estudar resposta tumoral à radioterapia hipofracionada e identificar biomarcadores preditivos.

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Agradecemos à Dra. Carla Calçada (pós-doutoranda, Princess Margaret Cancer Centre) e ao Dr. Timothy Samuel (Ph.D. Student, Princess Margaret Cancer Center) pela ajuda na cultura de células tumorais e no desenvolvimento do protocolo de inoculação. A Dra. Kathleen Ma, a Dra. Anna Pietraszek e a Dra. Alyssa Goldstein (Animal Research Centre, Princess Margaret Cancer Center) ajudaram no desenvolvimento do protocolo de cirurgia. Jacob Broske (Tecnólogo de Engenharia Médica, Princess Margaret Cancer Center) e Wayne Keller (Executivo de Clientes de Hardware, Javelin Technologies – Uma Empresa do Grupo TriMech) imprimiram em 3D as câmaras das janelas. James Jonkman (Advanced Optical Microscopy Facility, University Health Network) forneceu orientações valiosas para a aquisição de imagens de microscopia de campo claro e fluorescência.

Inoculação tumoral guiada e imagem multimodal em camundongos

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Neste trabalho, desenvolvemos um fluxo de trabalho para realizar microscopia intravital e imagens clinicamente aplicáveis (TC, RM e PET) no mesmo animal. Isso foi feito com o objetivo de traduzir os achados da microscopia pré-clínica para a clínica por correlação direta da microscopia intravital com modalidades de imagem clínica, como ressonância magnética. Embora os designs convencionais do DSFC sejam feitos de metal 2,3, adaptamos o DSFC para ser compatível com MR usando câmaras de janela impressas em 3D feitas de uma resina plástica biocompatível. O registro das modalidades foi realizado pelo uso de marcadores fiduciais para as modalidades de imagem clínica e pela obtenção de uma imagem de microscopia de campo amplo para combinar as localizações dos marcadores fiduciais no DSFC com os pontos de referência vasculares que podem ser vistos na imagem de microscopia de campo amplo, bem como as imagens microvasculares de microscopia intravital de alta resolução. Um código MATLAB para co-registro das modalidades foi desenvolvido e está incluído no Arquivo Suplementar 2.
DSFCs não são novos na pesquisa pré-clínica 2,3,27,29,30,31,32 com alguns estudos desenvolvendo DSFCs compatíveis com RM a partir de plásticos biocompatíveis para microscopia intravital e imagens clinicamente aplicáveis27,29,30,31,32. No entanto, esses estudos realizam correlações no nível de todo o tumor com achados de ressonância magnética e microscopia intravital. A novidade deste trabalho é nossa capacidade de co-registrar diretamente imagens de microcópia intravital para modalidades de imagem clinicamente aplicáveis usando um marcador fiducial anexado ao DSFC, permitindo uma análise direta de correlação espacial. Gaustad et al. também realizaram análise de correlação espacial entre RM e microscopia intravital; no entanto, não estão incluídas etapas detalhadas específicas sobre o processo de co-registro entre modalidades29. Este trabalho fornece um protocolo para correlacionar espacialmente várias modalidades entre si usando a fixação do anel marcador fiducial e inclui um pipeline MATLAB.
Existem vários detalhes do design e procedimento do DSFC que oferecem características aprimoradas de imagem e crescimento do tumor em comparação com outros estudos semelhantes. Primeiro, a maioria dos métodos de câmara de janela envolve a inoculação do tumor após a cirurgia de câmara de janela. Isso normalmente é feito, pois é mais fácil centralizar o tumor no campo de visão da câmara da janela; no entanto, trabalhos anteriores mostraram que isso é abaixo do ideal, levando a um crescimento tumoral de camada única 'irreal' com regressão espontânea em muitos casos33. Em vez disso, permitimos que o tumor cresça sem restrições na pele por várias semanas antes da implantação do DSFC, o que permite um tumor 3D mais realista com características de crescimento aprimoradas33.
Este design DSFC também é extremamente leve com 0,83 g com uma grande janela de imagem FOV (lamínula de vidro de 1,2 cm de diâmetro). Uma característica única do nosso design DSFC é que ele não inclui um anel elástico para prender a lamínula de vidro à moldura frontal. Em vez disso, a lamínula de vidro é fixada permanentemente com cola curada por UV, permitindo que a parte inferior da estrutura frontal fique completamente plana. Além disso, a moldura frontal é presa sob a pele do mouse. Isso foi feito para minimizar a chance de qualquer espaço de ar entre a interface tumor-vidro. Foi observado em projetos anteriores que, se houver uma lacuna na interface tumor-vidro, há uma alta probabilidade de acúmulo de fluido nessa região. Isso afeta significativamente os resultados, atenuando o sinal da microscopia intravital, reduzindo assim a qualidade da imagem. Além disso, torna mais difícil direcionar as fatias de ressonância magnética para o tumor, uma vez que esse acúmulo de fluido aparecerá brilhante nas varreduras de localização T2w. Isso torna difícil identificar quais fatias estão visualizando o tecido e quais fatias estão visualizando o acúmulo de fluido no DSFC. Uma desvantagem desse design é que, se a lamínula de vidro quebrar, ela não poderá ser facilmente substituída. Também projetamos uma moldura frontal feita inteiramente de plástico opticamente transparente, eliminando assim o problema de quebra de vidro34.
Ao longo deste procedimento, várias etapas cruciais são tecnicamente mais desafiadoras do que outras. Uma etapa que pode causar dificuldades é durante a cirurgia DSFC ao suturar a estrutura frontal à pele (etapas do protocolo 3.18-3.24). É importante manter um pouco de pele solta extra ao longo da parte superior da estrutura frontal do DSFC. Se isso não for feito, a pele dessa região perderá o suprimento sanguíneo e ficará necrótica, arruinando a preparação. Outra tarefa tecnicamente desafiadora é o direcionamento do pacote de corte de ressonância magnética para incluir a parte mais superficial do tecido sob o vidro. Se esse corte não for direcionado precisamente para a região, podem ocorrer efeitos parciais de volume com o vidro, levando a resultados errôneos de ressonância magnética. Superfícies irregulares do tecido sob o vidro do DSFC podem tornar isso ainda mais desafiador. É importante garantir que a pele esteja esticada dentro do DSFC para manter a superfície do tecido o mais plana e uniforme possível para reduzir essa fonte de erro.
Aqui demonstramos o uso desse fluxo de trabalho DSFC usando svOCT, que tem um grande FOV de imagem de 6 x 6 mm2. Esse grande FOV não é comum em outros tipos de microscopia intravital, com muitos métodos de imagem com FOVs de 1 mm2 ou menores13. Isso pode causar alguns desafios ao co-registrar a imagem de microscopia de campo amplo para as imagens de microscopia intravital de alta resolução, uma vez que os marcos microvasculares podem ser difíceis de identificar. Para superar isso, outra imagem de microscopia de campo amplo pode ser necessária com um FOV menor (~ 6 x 6 mm2) para atuar como uma etapa intermediária adicional de co-registro entre as modalidades de imagem para refinar ainda mais a região de interesse para aquela fotografada por microscopia intravital.
Neste trabalho, nos concentramos na imagem da microvasculatura tumoral, mas outros componentes microambientais do tumor também podem ser visualizados usando esse modelo. Por exemplo, a microscopia intravital demonstrou obter imagens bem-sucedidas do estroma tumoral35, e métodos de ressonância magnética ponderados em difusão, como imagem por tensor de difusão ou curtose por difusão, podem ter a capacidade de fornecer informações sobre a estrutura do estroma tumoral 36,37. Esse fluxo de trabalho pode fornecer oportunidades interessantes para traduzir informações de tumores estromais para a clínica, registrando diretamente imagens de microscopia intravital de alta resolução do estroma tumoral com medições baseadas em ressonância magnética do estroma. No entanto, deve-se notar que, como esse método usa pontos de referência vasculares para co-registro, eles também devem estar presentes nas imagens estromais de microscopia intravital.
O fluxo de trabalho apresentado pode ser um passo importante para preencher a lacuna entre a microscopia intravital pré-clínica e as modalidades de imagem clinicamente aplicáveis. Este modelo pode ser usado para validar métodos de imagem clínica com imagens de microscopia intravital de verdade fundamental, desenvolver novos métodos de imagem clinicamente aplicáveis por meio da comparação com microscopia intravital e monitorar longitudinalmente a resposta de tratamentos usando múltiplas modalidades de imagem.

A microvasculatura tumoral é um componente importante do microambiente tumoral que pode ser um alvo para terapia e um determinante da resposta ao tratamento. No cenário pré-clínico, a microvasculatura é tipicamente estudada usando microscopia intravital em modelos animais ortotópicos ou heterotópicos de câmara de janela 1,2. Isso tem várias vantagens em relação aos estudos histológicos, uma vez que a imagem é feita em tecidos vivos e o tumor pode ser monitorado longitudinalmente por várias semanas ou até meses 2,3. Esses estudos podem aproveitar os recursos de imagem de alta resolução da microscopia intravital para estudar a administração terapêutica ao tumor 4,5, as causas da resistência ao tratamento6 e a resposta dos microvasos a terapias como tratamento antiangiogênico 7,8 e radioterapia 2,9.
A microscopia intravital claramente desempenha um papel importante na pesquisa pré-clínica do câncer; no entanto, como as características microambientais do tumor podem ser medidas na clínica? As informações microvasculares seriam úteis na clínica para medir o suprimento sanguíneo e a hipóxia das células tumorais, o que é importante para determinar a resistência ao tratamento em radioterapia10, bem como a capacidade da microvasculatura de fornecer agentes quimioterápicos às células tumorais circundantes11. Por exemplo, na radioterapia, informações espaciais sobre a estrutura e função da microvasculatura tumoral podem ajudar a personalizar o plano de tratamento de um paciente, ajustando o esquema de fracionamento ou aumentando preferencialmente a dose para regiões avasculares e provavelmente hipóxicas12.
A microscopia intravital pode medir essas importantes características microvasculares, pois tem uma resolução muito alta (escala de μm); no entanto, sua penetração em profundidade no tecido é limitada a várias centenas de mícrons ou alguns milímetros, no máximo tornando a implementação clínica desafiadora. De fato, existem algumas novas aplicações da microscopia intravital na clínica13; no entanto, estes ainda estão limitados a exames de tecido próximo à superfície, como a pele14 ou revestimentos mucosos/endoteliais de várias cavidades corporais por meio de cateteres/endoscópios flexíveis15,16.
Mais comumente, a microvasculatura é estudada usando modalidades de imagem como TC17 ou RM18. Essas modalidades de imagem clínica podem obter imagens em qualquer profundidade dentro do corpo, mas têm uma resolução espacial muito menor (escala de mm). Assim, há a necessidade de preencher essa lacuna de resolução entre a microscopia intravital pré-clínica e as modalidades de imagem clínica para trazer informações microvasculares detalhadas e de alta resolução para a clínica19. Vários métodos de imagem funcional foram desenvolvidos para melhorar as capacidades de imagem microvascular das modalidades de imagem clínica, como ressonância magnética com contraste dinâmico (DCE) e TC20 e ressonância magnética de movimento incoerente intravoxel (IVIM)21. No entanto, esses são métodos baseados em modelos que fornecem medições indiretas da microvasculatura e, portanto, devem ser validados com medições apropriadas de "verdade fundamental" da microvasculatura19,22.
Desenvolvemos um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobras cutâneas dorsais (DSFC) para preencher essa lacuna entre a microscopia intravital pré-clínica e as modalidades de imagem clinicamente aplicáveis, como tomografia computadorizada e ressonância magnética. O DSFC fornece acesso direto ao tumor para imagens de microscopia intravital de alta resolução através de uma janela de vidro, mas também imagens clinicamente aplicáveis, como ressonância magnética, pois é feito de materiais compatíveis com RM (plástico e vidro). Além disso, um código MATLAB incluído realiza o co-registro 3D multimodal para correlações espaciais diretas entre microscopia intravital pré-clínica e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis. Aqui descreveremos o desenho e a cirurgia para instalar o DSFC, bem como o procedimento para co-registrar a microscopia intravital e as modalidades de imagem clinicamente aplicáveis.

<table><tbody><tr><td>Materiais de Cultura de Células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BxPC-3 Células de Câncer Pancreático Humano</td><td>ATCC (American Type Culture Collection)</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, sem LDEV, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td><td>Corning</td><td>07-202-350</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem vermelho, cálcio, magnésio ou fenol, 500 mL</td><td>de soro</td> fetal <td>bovino 14190144</td><td></td>Gibco</tr><tr><td>(Canadá), 500 mL</td> de penicilina-estreptomicina <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>100x (líquido, estabilizado, filtrado estéril, testado para cultura de células)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x), líquido; com L-glutamina, 500 mL</td><td>de Gibco</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Enzima TrypLE Express, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais para Câmara de Janela</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm Lamínula de Vidro</td><td>Aparelho Harvard&nbsp; &nbsp;</td>Impressora 3D <td>CS-12R No. 1.5</td><td></td></tr><tr><td>Connex 500</td><td>Stratasys</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Resina MED610 transparente biocompatível</td><td>Stratasys</td><td>&nbsp; RGD810</td><td></td></tr><tr><td>Loctite AA 3105 Cola curável UV</td><td>Loctite</td><td>LCT1214249</td><td></td></tr><tr><td>Moldura traseira da câmara da janela</td><td>Trimech Inc</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Marcador fiducial da câmara da janela</td><td>Trimech Inc</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Moldura frontal da câmara da janela</td><td>Trimech Inc</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Clipe de suporte da câmara da janela</td><td>Trimech Inc</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>inoculação e Materiais de Cirurgia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Seringas de Insulina SafetyGlide com Agulhas Permanentemente Anexadas, 0.5 mL, 29 G x 1/2"</td><td>BD</td><td>Solução CABD305932</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td></td><td>Betadine AP-B002C2R98U</td><td></td></tr><tr><td>Cidex OPA Solução de 14 Dias 3.8 L</td><td>ASP</td><td>JOH20394</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas Cirúrgicas Descartáveis 23 polegadas x 24 polegadas</td>Lubrificante para os <td>olhos Kendall</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>Optixcare</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>Creme de depilação</td><td>Nair</td><td>&lrm; </td><td></td></tr><tr><td>061700222611 Pinça Hemostática Halstead</td><td>Almedic</td><td>7742-A12-150</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento</td><td>Sunbeam&nbsp;</td><td></td><td></td>B086MCN59R</tr><tr><td>Tesoura de Íris</td><td>Almedic</td><td>7601-A8-690</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>&nbsp; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc</td><td>NDC 0010-6015-03</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Rag1tm1Mom&nbsp; Il2rgtm1Wjl/SzJ rato</td><td>o laboratório Jackson</td><td>7799</td><td></td></tr><tr><td>Peanut Clipper & Aparador</td><td>Wahl</td><td>8655-200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sutura Cirúrgica Não Absorvível SOFSILK #5-0 com agulha de ponta cônica de 3/8" (17 mm) (Revestida com Cera, Seda Preta Trançada, Estéril)&nbsp;</td><td>&nbsp; Sinetura&nbsp;</td><td>&nbsp; VS880</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Fragmentação</td><td>Almedic</td><td>7725-A10-634</td><td></td></tr><tr><td>MR Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D dispositivo de imobilização da câmara da janela.</td><td></td><td></td><td>impresso em 3D personalizado, consulte a figura 3 para obter detalhes.</td></tr><tr><td>Dispositivo de aquecimento por convecção</td><td>3M Bair Hugger</td><td>70200791401</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de injeção de drogas</td><td>Harvard Apparatus&nbsp; &nbsp;</td><td>PY2 70-2131</td><td>PHD 22/2200 Bomba de seringa compatível com ressonância magnética</td></tr><tr><td>Gadovist 1.0</td><td>Bayer</td><td>2241089</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de monitoramento respiratório</td><td>SAII</td><td>Modelo 1030</td><td>Sistema de monitoramento e gating compatível com MR para pequenos animais.</td></tr><tr><td>Cateter da veia da cauda (27 G 0.5")</td> <td>Terumo Medical Corp</td><td>15253</td><td></td></tr><tr><td>Optical Imaging3D</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>impresso estágio</td><td></td><td></td><td>de imagem Impresso em 3D personalizado, consulte a figura suplementar 3 para obter detalhes.</td></tr><tr><td>Placa de Aquecimento de Poliimida Flexível 12 V 7 W Adesivo Fino PI Filme de Aquecimento 25 mm x 50 mm</td><td>BANRIA&nbsp;</td><td>B09X16XCVS</td><td>Elemento de aquecimento usado para regulação de temperatura do corpo do rato.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação elétrica CC</td><td>BK Precission</td><td>1761</td><td>Usado para alimentar o elemento de aquecimento.</td></tr><tr><td>Leica MZ FLIII</td><td>Leica Microsystems</td><td>15209</td><td></td></tr><tr>sistema <td></td><td></td> de<td>imagem svOCT</td><td>Sistema de imagem feito internamente. Os detalhes podem ser encontrados na referência 23.</td></tr><tr><td><software>forte</software forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2020A</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

A Dorsal Skinfold Window Chamber Tumor Mouse Model for Combined Intravital Microscopy and Magnetic Resonance Imaging in Translational Cancer Research

Imagens intravitais pré-clínicas, como microscopia e tomografia de coerência óptica, provaram ser ferramentas valiosas na pesquisa do câncer para visualizar o microambiente tumoral e sua resposta à terapia. Essas modalidades de imagem têm resolução em escala de mícron, mas têm uso limitado na clínica devido à sua profundidade de penetração rasa no tecido. Modalidades de imagem mais clinicamente aplicáveis, como TC, RM e PET, têm profundidade de penetração muito maior, mas têm resolução espacial comparativamente menor (escala de mm). 
Para traduzir os achados de imagem intravital pré-clínica para a clínica, novos métodos devem ser desenvolvidos para preencher essa lacuna de resolução micro a macro . Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com tumor de câmara de janela de dobra cutânea dorsal projetado para permitir imagens intravitais pré-clínicas e clinicamente aplicáveis (TC e RM) no mesmo animal, e a plataforma de análise de imagem que liga esses dois métodos de visualização díspares. É importante ressaltar que a abordagem da câmara de janela descrita permite que as diferentes modalidades de imagem sejam co-registradas em 3D usando marcadores fiduciais na câmara da janela para concordância espacial direta. Este modelo pode ser usado para validação de métodos de imagem clínica existentes, bem como para o desenvolvimento de novos por meio de correlação direta com achados intravitais de alta resolução "ground truth". 
Finalmente, a resposta do tumor a vários tratamentos - quimioterapia, radioterapia, terapia fotodinâmica - pode ser monitorada longitudinalmente com esta metodologia usando modalidades de imagem pré-clínicas e clinicamente aplicáveis. O modelo de camundongo de tumor de câmara de dobra cutânea dorsal e as plataformas de imagem descritas aqui podem, portanto, ser usados em uma variedade de estudos de pesquisa de câncer, por exemplo, na tradução de achados de microscopia intravital pré-clínica para modalidades de imagem mais clinicamente aplicáveis, como tomografia computadorizada ou ressonância magnética.

A tomografia de coerência óptica de variância de speckle (svOCT) foi realizada para obter imagens microvasculares 3D de grande campo de visão (FOV) (6 x 6 mm,2 laterais x 1 mm de profundidade). Para obter essas imagens, foi utilizado um sistema OCT de fonte varrida previamente descrito baseado em um interferômetro de quadratura23. As imagens de OCT foram adquiridas pela junção de duas varreduras de 3 x 6 mm2 FOV adjacentes lateralmente. Cada B-scan consistiu em 400 A-scans e foi realizado 24x por local (25 ms de intervalo) para permitir o processamento preciso da variância do speckle, conforme descrito em nosso trabalho anterior24.
Para co-registrar o conjunto de dados de ressonância magnética no conjunto de dados microvascular svOCT, várias etapas foram realizadas. A primeira etapa foi realizada na etapa 5.12 e está ilustrada na Figura 4. Esta etapa registra os dois conjuntos de dados ao longo da direção da profundidade (eixo z na Figura 4). Para co-registrar os conjuntos de dados ao longo das dimensões laterais (plano xy na Figura 4), o anel marcador fiducial junto com uma série de dois registros afins baseados em pontos são usados. Primeiro, o conjunto de dados de ressonância magnética é co-registrado na imagem de microscopia de campo claro, combinando os locais dos marcadores fiduciais no anel, com os divots correspondentes ao redor do perímetro da janela de vidro na moldura frontal (pontos verdes na Figura 5B, C). Em seguida, os pontos de referência vasculares que são identificáveis no conjunto de dados microvasculares svOCT e na imagem de microscopia de campo claro são usados para co-registrar a imagem de campo claro (e o conjunto de dados de ressonância magnética correspondente) no conjunto de dados svOCT (pontos azuis na Figura 5A, B). Portanto, a imagem de microscopia de campo claro atua como uma imagem de resolução intermediária que contém recursos da ressonância magnética (locais de divot para marcadores fiduciais) e da imagem microvascular svOCT (marcos microvasculares) para permitir o co-registro multimodal em resoluções de imagem muito diferentes.
As imagens do co-registro bem-sucedido entre as três modalidades (imagem microvascular, microscopia de campo amplo e ressonância magnética) para um camundongo de preparação de câmara de janela sem tumor (pele nua saudável) e tumor são mostradas na Figura 6A-C e na Figura 6D-F, respectivamente. Uma vez que todas as três modalidades são co-registradas, a análise de correlação pode ser realizada. Para aproveitar os conjuntos de dados co-registrados, as correlações espaciais devem ser realizadas voxel por voxel ou usando técnicas de média apropriadas sobre volumes selecionados de interesse. A Figura 7 mostra alguns resultados representativos da correlação entre as métricas microvasculares derivadas do svOCT e as métricas macrovasculares derivadas da ressonância magnética funcional. Esses gráficos incluem os dados de dois camundongos portadores de tumor e um camundongo de pele nua "saudável". Essas parcelas foram geradas usando uma técnica de volume de interesse (VOI) de janela deslizante de 1 mm2 x 500 μm de profundidade com um tamanho de degrau lateral de 500 μm, com cada ponto representando uma posição do VOI. Para o camundongo saudável, a análise vascular foi restrita a uma região de interesse de 3 x 3 mm2 no centro do FOV para corresponder à extensão espacial 3D dos tumores examinados. Um estudo mais detalhado envolvendo correlações de svOCT para ressonância magnética usando esse método de análise pode ser encontrado em nosso trabalho recente22.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig06.jpg"> Figura 6: Conjuntos de dados de imagem saudáveis e tumorais co-registrados. A linha superior mostra o (A) svOCT codificado em profundidade de cor, (B) imagem de microscopia de campo claro co-registrada com região de análise mostrada pela linha pontilhada azul e (C) mapa de parâmetros DCE-MRI co-registrado para um camundongo de pele nua saudável. A linha inferior mostra o (D) svOCT codificado em profundidade colorida, (E) imagem de microscopia de campo claro co-registrada com contorno tumoral mostrado pela linha pontilhada azul e (F) mapa de parâmetros DCE-MRI co-registrado para um camundongo portador de tumor. Os voxels pretos em C e F estão fora da região de análise e do tumor, respectivamente, e, portanto, não são considerados. Barras de escala = 1 mm. Abreviaturas: svOCT = tomografia de coerência óptica de variância speckle; DCE-MRI = ressonância magnética dinâmica com contraste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 7A mostra o parâmetro ktransda ressonância magnética versus a fração de volume vascular (VVF) medida pelo svOCT. VVF é a proporção de tecido que é ocupada por vasos e ktrans é a constante de taxa para o gadolínio se mover do espaço intravascular para o espaço extravascular. ktransé obtido pelo ajuste do modelo de Toft às curvas de concentração de tempo de gadolínio em uma base voxel a voxel25,26. As medições de VVF do svOCT mostram que os tumores têm um VVF menor do que o tecido saudável, potencialmente indicando a presença de regiões pouco vascularizadas dentro do tumor. Como o ktransé dependente do fluxo sanguíneo, da permeabilidade vascular e da área de superfície capilar25,26, espera-se uma correlação positiva entre ktranse VVF, uma vez que um VVF maior implica uma maior área de superfície vascular e fluxo sanguíneo. No entanto, mais estudos, como experimentos de extravasamento de dextrana, são necessários para elucidar ainda mais o impacto da permeabilidade dos vasos tumorais nessa relação27.
A Figura 7B mostra a correlação entre o tempo da ressonância magnética até o pico de realce do contraste (TTP) versus a distância média do svOCT até o vaso mais próximo (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">). O TTP é uma métrica semiquantitativa que mede o tempo necessário para que a curva de concentração de tempo de gadolínio atinja seu valor máximo e é calculado voxel a voxel26. A <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> é uma métrica microvascular svOCT que mede a distância média até o vaso mais próximo dentro do volumeanalisado 22. Em geral, há um tecido saudável menor <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> em comparação com o tecido tumoral, indicando que a microvasculatura saudável é mais densamente compactada, levando a um tecido oxigenado mais uniformemente, e o tecido tumoral é menos vascularizado28. Os valores mais elevados <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> no tecido tumoral podem indicar a presença de regiões de tecido avascular. A Figura 7B mostra uma correlação positiva entre TTP e <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">. Isso demonstra que o tecido saudável é bem vascularizado com o gadolínio entrando e saindo do tecido de forma eficiente e rápida. No entanto, a microvasculatura tumoral é mais malformada com maiores distâncias intervasculares, o que aumenta o tempo para o gadolínio atingir o tecido, resultando em um aumento da PTT.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig07.jpg"> Figura 7: Correlações espaciais macro a microvasculares de ressonância magnética para svOCT. Esses gráficos contêm os achados de dois camundongos portadores de tumor e um camundongo saudável de pele nua usando um VOI de janela deslizante x 1 x 1 mm2 lateral × 500 μm de profundidade com um tamanho de passo de 500 μm, com cada ponto representando os valores médios da métrica dada para uma posição da janela deslizante VOI. Abreviaturas: svOCT = tomografia de coerência óptica de variância speckle; DCE-MRI = ressonância magnética dinâmica com contraste; VOI = volume de interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo suplementar 1: Arquivos STL 3D de componentes da câmara da janela. Um arquivo zip contendo os 4 componentes da câmara DSFC (estrutura frontal, estrutura traseira, clipe de suporte e anel marcador fiducial), que foi usado para imprimir as peças em 3D. Abreviatura: DSFC = câmara de janela de dobras cutâneas dorsais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20file%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Script MATLAB para co-registro de imagem multimodal. Este script MATLAB (Multimodal_Image_Register.m) recebe a microscopia de campo claro, dados de imagens microvasculares e imagens de RM estruturais e funcionais (mapas de parâmetros DCE e/ou IVIM) e gera todos os conjuntos de dados co-registrados no conjunto de dados microvascular. O script MATLAB foi escrito para suportar os seguintes formatos de arquivo: MRI - .dcm, svOCT - .mat e microscopia - .jpg ou . TIF. O código MATLAB é escrito para acomodar os tamanhos/resoluções de arquivo descritos na seção de protocolo: MRI - campo de visão de 32 x 32 mm com matriz de 64 x 64 para resolução no plano de 0,5 x 0,5 mm; 10 cortes de imagem contíguos, microscopia - imagem 2D com campo de visão de &gt;1,5 cm2 (qualquer resolução aceitável) e svOCT - campo de visão de 6 x 6 mm com resolução de 7,5 μm. O código MATLAB deve ser modificado se diferentes formatos de arquivo, resolução de imagem ou campos de visão de imagem forem usados. Abreviaturas: DCE = contraste dinâmico realçado; IMIV = movimento incoerente intravoxel; RM = ressonância magnética; svOCT = tomografia de coerência óptica de variância de speckle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Multimodal_Image_Register.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S1 suplementar: Suturas temporárias para fixar a câmara da janela na pele do camundongo. A sutura começa em (1) e passa pela pele frontal do mouse e pela moldura frontal da câmara da janela. (2) A sutura então passa pela pele traseira do camundongo e sai pela moldura traseira da câmara da janela. A sutura é então enfiada de volta através da estrutura traseira, (3) na pele traseira, através da estrutura frontal e (4) de volta para fora da pele frontal. (5) A sutura é então trazida de volta através de ambas as estruturas DSFC e camadas de pele. (6) Finalmente, a sutura é trazida de volta através do orifício superior da câmara da janela e de todas as camadas da pele. O conjunto DSFC + pele é então unido apertando e amarrando as suturas em (1). Abreviatura: DSFC = câmara de janela de dobras cutâneas dorsais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S2: Colocação ideal de suturas permanentes. As suturas permanentes devem ser enfiadas através da pele/estrutura frontal para fora da pele/estrutura traseira, de volta por todo o conjunto e amarradas na frente. Cada número representa uma sutura individual. As suturas devem ser colocadas na ordem dos números para aplicar pressão uniformemente em todo o conjunto à medida que é fixado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S3 suplementar: Platina impressa em 3D para imagens de microscopia intravital. (A) Um estágio impresso em 3D com acessório de anestesia com gás isoflurano é usado para imagens de microscopia intravital. (B) A câmara da janela é presa ao palco por três parafusos para imobilizá-la e eliminar qualquer movimento respiratório. (C) Dois elementos de aquecimento conectados em série a uma fonte de alimentação CC são colados na parte inferior do stage para manter a temperatura corporal do mouse enquanto anestesiado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Preclinical intravital imaging such as microscopy and optical coherence tomography have proven to be valuable tools in cancer research for visualizing the ...

A imagem intravital pré-clínica tem resolução muito alta, mas penetração de profundidade limitada no tecido, o que a torna muito boa para estudos de imagem pré-clínica. Por outro lado, a ressonância magnética é muito mais aplicável clinicamente e tem uma penetração de profundidade mais alta, mas resolução espacial muito baixa. O objetivo deste estudo é correlacionar essas duas modalidades entre si, a fim de melhor traduzir nossos achados da microscopia intravital pré-clínica para a clínica por meio de ressonância magnética.Métodos de imagem sensíveis à perfusão em ressonância magnética e biofotônica, incluindo nossa tomografia de coerência óptica e sistema geográfico, estão revelando como a microvasculatura afeta a resposta do tumor à radioterapia hipofracionada. A impressão 3D também está auxiliando na fabricação de ferramentas personalizadas econômicas, facilitando estudos longitudinais. Finalmente, a análise de imagem de IA está facilitando a identificação de novos biomarcadores preditivos de radioterapia.Fizemos várias descobertas sobre a resposta do tumor à radioterapia hipofracionada, incluindo, mais recentemente, a cinética temporal das métricas de resposta tecidual derivadas de IA radiobiologicamente significativas e abstraídas. Além disso, demonstramos a promessa de imagens multimodais serem realizadas com mais precisão, correlacionando métricas derivadas de ressonância magnética, macroscópica e tomografia de coerência óptica, microscópica e derivada de angiografia. Ao estender a duração efetiva dos estudos longitudinais, podemos identificar melhor os biomarcadores preditivos para a resposta ao tratamento do tumor a longo prazo.Além disso, ao melhorar a robustez do co-registro entre as modalidades de imagem macroscópica clinicamente disponíveis e as modalidades de imagem pré-clínica microscópica, podemos melhorar a traduzibilidade de nossos achados da bancada para a beira do leito. Durante uma radioterapia estereotáxica corporal, altas doses de radiação estão fornecendo um número reduzido de frações. Um alvo radiobiológico potencial associado ao aumento da morte celular na SVRT é a microvasculatura tumoral.Ao combinar angiografia óptica de alta resolução e ressonância magnética, queremos permitir imagens microvasculares de ressonância magnética funcional para planejamento de tratamento de SVRT específico do paciente e melhores resultados.

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