Quantificação de glicose de Bergmeyer para amostras microbiológicas

A pesquisa avalia a concentração de glicose em amostras microbianas usando técnicas de quantificação de filtros bacterianos e de leveduras. O objetivo é melhorar a acurácia do grama de massa de glicose em estudos microbiológicos. Os desafios incluem quantificar com precisão a baixa concentração de glicose em amostras microbianas complexas e distinguir entre fontes microbianas e ambientais de glicose em culturas mistas.

A pesquisa mostrou uma correlação clara entre cepas microbianas específicas e suas taxas de consumo de glicose, revelando como os fatores ambientais influenciam as vias metabólicas. Nosso protocolo aprimora a detecção de glicose, melhorando a especificidade e a sensibilidade, reduzindo o tempo de processamento. O uso de ácido sulfúrico de forma controlada minimiza a interferência.

Pesquisas futuras se concentrarão na otimização de métodos de detecção de glicose para aplicações em microbiologia industrial e na investigação do papel de genes específicos no metabolismo da glicose sob condições ambientais variadas. Para começar, pesar 1,28 gramas de di-hidrogenofosfato de potássio e 0,1304 gramas de fosfato dipotássico em um copo de vidro. Adicione 70 mililitros de água deionizada e ajuste o pH para 5,5 usando ácido clorídrico 1 molar ou hidróxido de potássio.

Em seguida, transferir a solução para um balão volumétrico de 100 ml e ajustar o volume para 100 mililitros com água desionizada. Armazene a solução preparada em um recipiente âmbar a 4-8 graus Celsius por até três meses. Em seguida, pesar 0,01 gramas de dicloridrato de o-dianisidina em um tubo de centrífuga de 2 mililitros.

Usando uma pipeta de 1.000 microlitros, adicione 1 mililitro de água deionizada para dissolver o composto e misture a solução lentamente. Enrole o tubo da centrífuga em papel alumínio para protegê-lo da luz e armazene-o a 20 graus Celsius. Em seguida, adicione a solução de dicloridrato de o-dianisidina a 10 mililitros de tampão fosfato em um balão volumétrico de 100 mililitros e ajuste o volume final para 100 mililitros com o tampão fosfato.

Depois de transferir a solução para um frasco âmbar, armazene-a a 4-8 graus Celsius por 3-4 meses. Agora coloque um balão volumétrico de 100 mililitros com 30 mililitros de água deionizada em um banho de gelo. Após 10 minutos, despeje lentamente 51 mililitros de ácido sulfúrico a 98% nas paredes do frasco, agitando-o suavemente.

Posteriormente, ajuste o volume final para 100 mililitros com água deionizada e transfira a solução para um frasco âmbar de vidro para armazenamento. Para a preparação enzimática, pesar 0,01 gramas de glicose oxidase em um microtubo estéril de 2 mililitros. Adicione 1 mililitro de tampão de acetato de sódio 50 milimolar a pH 5 ao microtubo e misture delicadamente.

Em seguida, em um novo microtubo de 2 mililitros, pesar 0,0031 gramas de enzima peroxidase e dissolva-o em 1 mililitro de tampão fosfato ajustado para pH 5,5. Cubra os dois microtubos contendo enzimas com papel alumínio e armazene-os a 20 graus Celsius. Em seguida, prepare 1 grama por litro de solução padrão de D-glicose usando água deionizada.

Para começar, prepare o padrão de glicose e todas as outras soluções necessárias para o ensaio. Adicione o volume apropriado de glicose a tubos novos de 2 mililitros. Defina um termobanho seco para 37 graus Celsius e deixe-o estabilizar.

Adicione os volumes apropriados de tampão a cada microtubo, seguido por 3,3 microlitros de glicose oxidase e 1,2 microlitros de peroxidase. Incube os tubos a 37 graus Celsius e ajuste o cronômetro para 20 minutos. Imediatamente após a incubação, adicione 750 microlitros de ácido sulfúrico a 50% a cada microtubo e coloque-os em um banho de gelo por 2 minutos para esfriar.

Transfira a mistura resfriada de 1.500 microlitros para uma cubeta de plástico e meça a absorbância em 529 nanômetros. Em seguida, limpe a área de trabalho com uma solução de álcool a 70% e acenda um queimador para garantir a assepsia. Obtenha bactérias ou leveduras em um meio de cultura líquido.

Transfira 100 microlitros da cultura para microtubos de 1,5 mililitro usando pontas estéreis. Centrifugue as amostras a 7.500 G por 7 minutos a 4 graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, que contém glicose em solução.

Misture 0,5 microlitros do sobrenadante com todos os componentes necessários para preparar a mistura de reação. Incube os microtubos por 20 minutos a 37 graus Celsius e adicione imediatamente 750 microlitros de ácido sulfúrico a 50%. Deixe a mistura esfriar em banho de gelo por 2 minutos.

Finalmente, meça a absorbância em 529 nanômetros. A análise espectrofotométrica indicou um pico máximo de absorbância em 529 nanômetros. A análise do consumo de glicose por Debaryomyces hansenii demonstrou resultados consistentes entre os métodos de glicose oxidase e DNS até que surgiram diferenças significativas em 6, 8 e 12 horas.

A aplicação do método da glicose oxidase do ácido sulfúrico facilitou a análise de altas concentrações de glicose de até 100 gramas por litro, com resultados confiáveis após a diluição.