Identificação e classificação de variantes missense da subunidade do receptor GABA_A específicas da posição para seu papel nos neurônios piramidais do hipocampo

Nosso estudo é baseado na ideia de que mutações epileptogênicas e preditas proximais nas subunidades do receptor GABA-A podem afetar de forma semelhante o modelo de neurônio piramidal CA1. Exploramos isso por meio de uma estrutura multiescala. Experimentos de laboratório são essenciais para descobrir a verdade, mas não podem capturar totalmente a diversidade e complexidade da vida em todas as escalas, de moléculas a organismos. Existem muitas possibilidades, esse é o problema.

Nosso protocolo e descobertas abriram caminho para um cenário computacional que pode ser usado para explorar o impacto de polimorfismos, como polimorfismos de subunidade do receptor GABA-A na função neural.

Nosso estudo levanta novas questões sobre até que ponto as variantes patogênicas previstas e as mutações epileptogênicas mostram propriedades semelhantes e como essas relações podem ser efetivamente capturadas e simuladas.

Nosso foco atual está na função do microcircuito córtex entorrinal-hipocampo. Buscaremos modelos animais in vivo e modelos computacionais de microcircuitos para explorar o controle septal neste circuito, especialmente em distúrbios neuropsiquiátricos.

[Narrador] Para começar, abra o arquivo Excel original contendo os dados genéticos e remova as colunas desnecessárias do arquivo, deixando apenas quatro colunas, GRCh38Chromosome, GRCh38Location, Name e Protein change, antes de salvar o arquivo como data1.xlsx no diretório de trabalho relevante para o software R. Para limpeza e formatação de dados adicionais, abra o software R e o RStudio. Em seguida, abra o script R Data_GABAA R. Defina o diretório de trabalho e carregue as bibliotecas necessárias clicando no botão executar. Carregue o arquivo de dados e inicie a limpeza de dados para colunas que exigem esse processo. Limpe e combine ainda mais os dados em uma coluna, separados por um único espaço. Crie um novo quadro de dados para a saída combinada e adicione o ID da variante de transcrição do ensemble desejado. Grave o resultado em um novo arquivo do Excel chamado data1output.xlsx. Para construir um modelo biofísico de uma sinapse GABAérgica em um neurônio piramidal do hipocampo baseado em condutância multicompartimental, instale o Brian 2 e importe os pacotes necessários. Projete o modelo baseado em condutância definindo a cinética de passagem do canal iônico, parâmetros passivos e ativos e condutâncias pós-sinápticas. Use as condutâncias modificadas do tipo Hodgkin-Huxley para neurônios piramidais do hipocampo. Ajuste a distribuição de densidade dos canais de sódio dependentes de voltagem para soma, segmento inicial do axônio, nós de Ranvier e dendritos. Defina as condutâncias dos canais de sódio e potássio como zero nos segmentos mielinizados. Cinética de bloqueio de canal iônico construída para canais de sódio e potássio dependentes de voltagem. Introduza as correntes sinápticas como a soma de todas as sinapses glutamatérgicas e GABAérgicas em um compartimento. Inclua a corrente mediada pelo receptor AMPA rápido e a corrente mediada pelo receptor NMDA lenta na corrente glutamatérgica. Inclua apenas corrente rápida mediada pelo receptor GABA na corrente GABAérgica. Suponha que uma quantidade constante de glutamato seja liberada para a sinapse para cada pico pré-sináptico. Portanto, a ativação dos receptores é dependente do tempo de pico, e as condutâncias totais do receptor, G-AMPA e G-NMDA, refletem a quantidade de glutamato que é liberada por cada evento. Defina os parâmetros morfológicos usando o diâmetro medido experimentalmente para soma e neurites, e o comprimento de cada compartimento de neuritos e padrões de ramificação. Reduza a morfologia real do neurônio em um modelo multicompartimental, dividindo a célula em vários compartimentos que preservam com precisão a estrutura de ramificação principal e mantêm a simetria bilateral. Determine os parâmetros biofísicos para o modelo de sinapse GABAérgico avaliando as medições de controle do tipo selvagem obtidas anteriormente e importando-as para uso no modelo. Defina constantes de tempo de subida e desativação para corrente pós-sináptica mediada pelo receptor GABA-A. Projetar a topologia do modelo de neurônios e atribuir parâmetros morfológicos e biofísicos, o que inclui especificar o arranjo espacial e as interconexões dos compartimentos com base nas informações morfológicas e de ramificação obtidas anteriormente. Atribua os parâmetros morfológicos apropriados, como comprimento e diâmetro do segmento, e parâmetros biofísicos a cada compartimento do modelo. Crie a atividade pré-sináptica usando SpikeGeneratorGroup. Conecte o gerador de pico ao compartimento alvo do neurônio modelo usando a classe Synapses para modelar conexões sinápticas. Defina uma corrente constante sustentada de 0,85 nano-Ampère e coloque o eletrodo no soma para imitar a atividade subliminar impulsionada pela carga de corrente iônica da linha de base em um determinado momento. Para criar monitores de gravação, registre rastreamentos de tensão de compartimentos de destino usando StateMonitor. Por fim, construa a rede e execute-a. Trens de spike neuronais sob entrada glutamatérgica distal única e inibição somática de GABAérgicos revelaram os resultados de disparo de receptores GABA-A de tipo selvagem e mutantes. A mutação beta-3N110D prejudicou a inibição, fazendo com que o disparo do neurônio travasse na entrada excitatória de Glu-S1 após o quarto pico pré-sináptico, com um curto atraso pós-sináptico. A mutação gama-2K328M também prejudicou a inibição com o disparo de neurônios ocorrendo em torno do quinto pico de Glu-S1 e com um atraso pós-sináptico mais longo do que o beta-3N110D. Sob entrada sináptica dupla, a mutação gama-2P302L causou disparos quase sincronizados com a entrada apical medial de Glu-S2, provavelmente refletindo a soma atrasada de Glu-S1. A mutação beta-3T288N exibiu um padrão semelhante com picos alinhados às entradas Glu-S2 e um segundo pico aparecendo quase em sincronia. A mutação beta-3N110D sob condições de entrada dupla desencadeou picos para quase todas as entradas excitatórias, exceto as duas primeiras, com intervalos entre picos visivelmente encurtados. O mutante gama-2K328M mostrou um padrão de disparo comparável, mas não respondeu à segunda e terceira entradas excitatórias. Sob condições de entrada excitatória tripla, os mutantes beta-3N110D e gama-2K328M responderam a quase todos os picos pré-sinápticos, disparando pares de picos em resposta ao impulso excitatório cumulativo.