Name: Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprenda a reduzir autofluorescência tecidual usando fotoirradiação de baixo custo para análise espacial de células imunes em amostras clínicas arquivadas. Este protocolo preserva sinais de anticorpos e permite imagem multiplexada de tecidos complexos.

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<ol><li>Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,3% Tritão-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Solução para bloquear o buffer</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rolamento A4503</td><td>Solução para bloquear o buffer</td></tr><tr><td>1% Bloco BD Fc Humano</td><td>BD Biociências</td><td>564220</td><td>Bloqueio Fc necessário para bloquear o buffer</td></tr><tr><td>Lâmpada LED de 150 W</td><td>Amazona</td><td>B07VH3CVSF</td><td>Fonte de luz LED para fotoirradiação de tecido</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Solução para bloquear o buffer e as etapas de lavagem</td></tr><tr><td>Recipiente de armazenamento de 20 galões</td><td>Amazona</td><td>B001B1C4G0</td><td>Recipiente para processo de fotoirradiação</td></tr><tr><td>Lâmpada LED de inundação RGBW de 40 W&nbsp;</td><td>Amazona</td><td>B08QFPJSMD</td><td>Fonte de luz RGB para fotoirradiação de tecido</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Actina de músculo liso alfa DyLight 755</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Kit de bloqueio Avidin/Biotina</td><td>Abcam</td><td>ab64212</td><td>Solução de bloqueio de avidina e biotina</td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm</td><td>BD Biociências</td><td>554714</td><td>Solução de fixação</td></tr><tr><td>Solução de desparafinação BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221076</td><td>Solução de desparafinização</td></tr><tr><td>Solução de recuperação de epítopos BOND 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235529</td><td>Solução de recuperação de epítopos de pH 6 à base de citrato (ER1)</td></tr><tr><td>Solução de Recuperação de Epítopos BOND 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235530</td><td>Solução de recuperação de epítopos de pH 9 à base de EDTA (ER2)</td></tr><tr><td>Sistema de detecção de pesquisa BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0396648</td><td>Reagente de coloração de pesquisa automatizado</td></tr><tr><td>Corante de pesquisa BOND RX</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td>Plataforma automatizada de coloração de pesquisa</td></tr><tr><td>Solução de lavagem BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221077</td><td>Tampão de lavagem</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biociências</td><td>347420/AB_400298</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>50-0202-82/AB_11150959</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& D Sistemas</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>CD45 Ficoeritrina (PE)</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotecnologias</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Sistema de coloração EasyDip</td><td>Fornecimento para recém-chegados</td><td>5300KIT</td><td>Sistema de coloração de lâminas</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>00-4958-02</td><td>Mídia de montagem</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Coloração nuclear para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Conversor de arquivos Imaris x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instrumentos</td><td></td><td>Conversor de arquivos gratuito</td></tr><tr><td>Software ImarisViewer x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instrumentos</td><td></td><td>Software de processamento de imagem gratuito</td></tr><tr><td>Caneta ImmEdge</td><td>Laboratórios de vetores</td><td>H-4000</td><td>Caneta de barreira hidrofóbica</td></tr><tr><td>Borohidreto de lítio (1 grama)</td><td>Produtos químicos STREM</td><td>93-0397</td><td>Produto químico para inativação de corantes, compre pequenas alíquotas deste produto químico (1 grama)</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& D Sistemas</td><td>BAF2846</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Micro Óculos de Cobertura</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>Tampas de slides de vidro</td></tr><tr><td>Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Sistema de micro-ondas PELCO BioWave Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>36500-230</td><td>Microondas científicas sem aquecimento</td></tr><tr><td>PELCO SteadyTemp Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>50062</td><td>Controle de temperatura totalmente automatizado para micro-ondas científico</td></tr><tr><td>SimpleITK</td><td>Software de código aberto</td><td></td><td>Software de registro e processamento de canais</td></tr><tr><td>Estreptavidin Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>S11227</td><td>Reagente de marcação para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.</td></tr><tr><td>Microscópio de campo amplo</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Gerador de imagens THUNDER da Leica Microsystems com fonte de luz LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Para imagens de fluorescência, um filtro quad-band personalizado com roda de filtro externo (PN: 11536075) com dois filtros adicionais de banda única (PN: 8118215) foi usado para obter imagens de sete canais de corante por passagem. As linhas de excitação, dicróica e de emissão do filtro são (1) cubo de banda quádrupla: dicróico em 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sem filtros de excitação ou emissão; (2) Roda do filtro externo posição 1: 434/32, posição 2: 520/40, posição 3: 585/20, posição 4: 720/60, posição 5: passagem; (3) banda única 1&mdash; 585/22 excitação, 594 dicróica, 625/30 emissão; (4) banda única 2&mdash; 635/20 excitação, 647 dicróica, 667/30 emissão.</td></tr><tr><td>Limpador de lentes ópticas Zeiss</td><td>Amazona</td><td>B00GPVQVCO</td><td>Limpador de lentes objetivas para microscópio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>AB43019</td><td>IgG policlonal de coelho, ciclo 1</td></tr><tr><td>Actina de músculo liso alfa DyLight 755</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& D Sistemas</td><td>FAB8165G</td><td>IgG policlonal de cabra, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD8 Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>372906</td><td>C8/144B, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotecnologias</td><td>1064135</td><td>KP1, ciclo 1</td></tr><tr><td>Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Rolamento A32814</td><td>Burro Policlonal, ciclo 1</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Rolamento A32787</td><td>Burro Policlonal, ciclo 1</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>Rolamento A32794</td><td>Burro Policlonal, ciclo 1</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Rótulo nuclear, ciclo 1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biociências</td><td>347420</td><td>MMA, ciclo 2</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>50-0202-82</td><td>L26, ciclo 2</td></tr><tr><td>CD45 Ficoeritrina (PE)</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26, ciclo 2</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020</td><td>Burro Policlonal, ciclo 2</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& D Sistemas</td><td>BAF2846</td><td>IgG policlonal de cabra, ciclo 2</td></tr><tr><td>Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3, ciclo 2</td></tr><tr><td>Estreptavidin Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>S11227</td><td>N/A, ciclo 2</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Ciclo 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluções</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio (Ciclo 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritão-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,3% em volume</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rolamento A4503</td><td>1% em volume</td></tr><tr><td>Bloco BD Fc Humano</td><td>BD Biociências</td><td>564220</td><td>1% em volume</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>97,7% em volume</td></tr><tr><td><forte>Solução de coloração de anticorpos primários #1 (Ciclo 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio (ciclo 1)</td><td>Veja acima</td><td></td><td>Aumente o volume após adicionar anticorpos</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>BioLegend</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td><forte>Solução de coloração de anticorpos primários #2 (Ciclo 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio (ciclo 1)</td><td>Veja acima</td><td></td><td>Aumente o volume após adicionar anticorpos</td></tr><tr><td>CD4&nbsp; AF488</td><td>R& D Sistemas</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td><forte>Solução de coloração de anticorpos secundários #1 (Ciclo 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio (ciclo 1)</td><td>Veja acima</td><td></td><td>Aumente o volume após adicionar anticorpos</td></tr><tr><td>Burro Anti-Cabra AF Plus 488</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Burro anti-coelho AF Plus 555</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Burro anti-rato AF Plus 647</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td><forte>Solução de coloração de anticorpos primários #3 (Ciclo 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio (ciclo 1)</td><td>Veja acima</td><td></td><td>Aumente o volume após adicionar anticorpos</td></tr><tr><td>CD68 iF594</td><td>Caprico Biotecnologias</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td>BSA-free Blocking Buffer (Ciclo 2)&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritão-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,3% em volume</td></tr><tr><td>Bloco BD Fc Humano</td><td>BD Biociências</td><td>564220</td><td>1% em volume</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>98,7% em volume</td></tr><tr><td><forte>Solução de coloração de anticorpos primários #4 (Ciclo 2)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio sem BSA (Ciclo 2)</td><td>Veja acima</td><td></td><td>Aumente o volume após adicionar anticorpos</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biociências</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& D Sistemas</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Pan-citoqueratina AF750</td><td>Novus Biológicos</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td><forte>Solução de coloração de anticorpos secundários #2 (Ciclo 2)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio sem BSA (Ciclo 2)</td><td>Veja acima</td><td></td><td>Aumente o volume após adicionar anticorpos</td></tr><tr><td>Burro anti-rato IgM AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Estrepavidina AF594</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>S11227</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

Projetar um painel de imagem multiplexado baseado em anticorpos requer tempo, esforço e recursos significativos12. Esses desafios são especialmente pronunciados ao projetar um painel para amostras FFPE arquivadas de tecidos altamente autofluorescentes, conforme descrito aqui (Figura 1). Para superar esses desafios, primeiro identificamos os fluoróforos mais brilhantes compatíveis com nosso protocolo de inativação de corante (Tabela 1). Por exemplo, os...

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

The prevalence of pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing globally. Though NTM-induced pulmonary disease often ...

optimized-workflow-for-iterative-bleaching-extends-multiplexity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fundo autofluorescência de amostras biológicas muitas vezes complica a técnicas de imagem baseada em fluorescência, especialmente em tecidos postmitotic humanos envelhecidos. Este protocolo descreve como autofluorescência destas amostras pode ser efetivamente removida usando uma luz disponível comercialmente, emitindo luz de diodo fonte para photobleach a amostra antes da imunocoloração.

Simples eliminação da fluorescência de fundo no tecido do cérebro humano fixada em formol para microscopia de imunofluorescência

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Multiplex fluorescente imunoistoquímica é uma tecnologia emergente que permite a visualização de vários tipos de células dentro de formalina intacta-fixo, parafina incorporado (FFPE) tecido. Apresentados são diretrizes para garantir um multiplex de 7 cores bem sucedido com instruções para otimizar anticorpos e reagentes, preparando slides, design e dicas para evitar problemas comuns.

Otimização, design e evitando armadilhas em manual multiplex fluorescente imuno-histoquímica

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

A imunohistoquímica cíclica multiplex permite a detecção in situ de múltiplos marcadores simultaneamente usando incubação antígeno-anticorpo repetida, varredura de imagens e alinhamento e integração de imagens. Aqui, apresentamos o protocolo operacional para identificação de substratos de células imunes com essa tecnologia em amostras de câncer de pulmão e metástases cerebrais pareadas.

Imunohistoquímica Fluorescente Cíclica Multiplex

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

Aqui, descrevemos a aplicação do método Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) utilizando corantes de tecidos automatizados disponíveis comercialmente e considerações de otimização para o uso de reagentes baseados em amplificação de sinal de tiramida.

O branqueamento iterativo amplia a multiplicidade com o uso da automação de coloração para instalações principais

Este artigo descreve um protocolo de imunofluorescência multiplex otimizado para caracterizar a arquitetura tridimensional de metástases peritoneais.

Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

A imunofluorescência multiplexada permite a marcação sequencial de múltiplos marcadores de anticorpos dentro de uma única seção de tecido para apoiar a análise espacial da arquitetura do tecido e das populações celulares. Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho para a detecção multiplex de marcadores estruturais, estruturais e imunológicos associados à senescência, incluindo preparação manual e automatizada de lâminas, imagens iterativas e análise de células únicas usando software digital de...

Ensaio de Imunofluorescência Multiplexada para Avaliação Espacial de Marcadores de Senescência in vivo

Aprenda a reduzir autofluorescência tecidual usando fotoirradiação de baixo custo para análise espacial de células imunes em amostras clínicas arquivadas. Este protocolo preserva sinais de anticorpos e permite imagem multiplexada de tecidos complexos.

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes (Vídeo) | JoVE Journal

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

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