Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

[Narrador] Usando proteômica espacial, nomeada Método do Ano de 2024 da Nature Methods, as localizações precisas das células imunes, juntamente com as interações célula-célula, podem ser mapeadas nos tecidos. Isso revela padrões espaciais ligados a resultados clínicos. A construção de painéis complexos de anticorpos e tecidos de imagem com alta fluorescência endógena apresentam desafios significativos de tempo, recursos e experiência para IBEX e outras técnicas de microscopia de fluorescência. Usando o IBEX, características específicas do tumor foram identificadas em pacientes com linfoma folicular de alto risco e com colegas do Human Cell Atlas. Um mapa espacial abrangente do timo humano foi criado. Pouco se sabe sobre a composição das células imunes, interações espaciais e diferenças na produção de citocinas em diversas patologias pulmonares micobacterianas. Este protocolo preenche essa lacuna. Este protocolo oferece um método de fotoirradiação adaptável e de baixo custo para reduzir significativamente a autofluorescência do tecido de amplo espectro, especialmente em amostras FFPE difíceis, preservando o sinal de anticorpos para análise espacial. Para começar, mergulhe as lâminas com tecido em PBS após completar a recuperação do antígeno. Remova uma lâmina do PBS e use um pano sem fiapos para secar cuidadosamente todo o excesso de tampão sem tocar no tecido. Com uma caneta hidrofóbica, desenhe uma borda ao redor da seção de tecido na lâmina. Depois de repetir o processo para as lâminas restantes, deixe as barreiras hidrofóbicas secarem por 10 minutos. Em seguida, usando um pano sem fiapos, retire o PBS da seção de tecido sem tocar diretamente no tecido. Agora adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio na lâmina e feche a câmara de umidade. Coloque a câmara em um micro-ondas científico sem aquecimento com um mecanismo regulador de temperatura e execute o programa previamente estabelecido por cinco ciclos. Durante a incubação de bloqueio, preparar a solução primária de coloração de anticorpos 1 com ganchos e o tampão de bloqueio contendo o bloco Fc. Combine os anticorpos e misture delicadamente o coquetel. Quando o ciclo de micro-ondas terminar, remova e abra a câmara da lâmina e retire o tampão de bloqueio da lâmina sem tocar no tecido. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução primária de coloração de anticorpos 1 à lâmina. Retorne a câmara ao micro-ondas e execute o programa de anticorpos primários novamente por aproximadamente 30 minutos. Quando a marcação do anticorpo primário estiver concluída, segure a lâmina verticalmente. Para lavar a lâmina, pipete 1.000 microlitros de PBS no tecido, permitindo que ele escorra. Retire o excesso de PBS e fixe a lâmina com paraformaldeído a 1% por 10 minutos em temperatura ambiente na câmara de umidade. Após a fixação, lave bem a lâmina com 1.000 microlitros de PBS três a cinco vezes e deixe uma camada de PBS no tecido até a etapa de fotoirradiação. Para preparar a caixa de fotoirradiação, reúna uma lâmpada LED de 150 watts, uma lâmpada LED de inundação RGBW de 40 watts, um grande recipiente de plástico com capacidade de 75,71 litros ou mais, PBS fresco e uma placa de Petri. Agora encha a placa de Petri com 1x PBS para submergir completamente a lâmina. Realize o procedimento de fotoirradiação em uma câmara fria para minimizar o calor das lâmpadas. Em seguida, coloque a lâmina na placa de Petri, certificando-se de que esteja totalmente submersa em PBS. Em seguida, coloque a lâmpada de 40 watts diretamente acima da placa de Petri com a fonte de luz voltada para baixo em direção ao slide e defina a lâmpada para o modo de luz vermelha. Por fim, ligue as lâmpadas de 150 watts e 40 watts e cubra toda a configuração com a tampa do recipiente de plástico. Após duas horas, mude a lâmpada para luz verde e incube por 16 horas. Os fluoróforos mais brilhantes compatíveis com o protocolo de inativação do corante foram identificados e emparelhados com marcadores de baixa expressão para melhorar a detecção do sinal. A autofluorescência foi reduzida significativamente após a fotoirradiação e em comprimentos de onda de imagem mais longos. Anticorpos diretamente conjugados direcionados a marcadores estruturais altamente expressos, actina de músculo liso alfa e pan-citoqueratina, substituídos no canal infravermelho próximo a 750 nanômetros. O sinal de fundo foi subtraído computacionalmente usando uma imagem de referência não corada e aritmética SimpleITK, e os sinais verdadeiros foram aprimorados por meio de limiar. A imagem de lâmina inteira dos cortes corados com IBEX revelou granulomas com núcleos necróticos e neutrófilos CD15 positivos. Mycobacterium tuberculosis ou micobactérias não tuberculosas foram detectadas perto do núcleo necrótico do granuloma usando anticorpo antiantígeno 85B. O tecido linfóide associado ao granuloma continha células B CD20-positivas, células T CD4-positivas, algumas células T CD8-positivas e marcação CD45 de todas as células imunes no pulmão. A imagem IBEX também permitiu a visualização das características anatômicas pulmonares, incluindo células epiteliais brônquicas, músculo liso arterial e macrófagos CD68-positivos.