Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

A preparação de células dendríticas da medula óssea fornece uma excelente fonte de células apresentadoras de antígenos que podem ser usadas para experimentos in vitro ou in vivo em duas imagens inferiores do sistema imunológico. A introdução de células apresentadoras de antígenos permite o estudo das interações celulares antígeno-específicas no contexto do linfonodo vivo. Aqui demonstramos o isolamento estéril da medula óssea e técnicas de cultura para a produção de células dendríticas maduras.

Além disso, acompanhamos o desenvolvimento das células dendríticas desde o primeiro dia até o dia 11. Este desenvolvimento é retratado com imagens estáticas e em vídeos de incubadora feitos usando tecnologias de perfume incus site. Finalmente, mostramos células dendríticas derivadas da medula óssea apresentando antígeno de enseada para OT duas células T no linfonodo espelhado.

Olá, sou Melanie Matthew no laboratório de Micah Halen na Universidade da Califórnia nas proximidades. Você já se perguntou o que está acontecendo dentro durante a sondagem enquanto suas células estão crescendo? Hoje?

Como parte do nosso protocolo, mostraremos como usar alguns instrumentos S no local. O local com tinta permite que você acompanhe o crescimento da cultura de células em sua incubadora. Neste protocolo, mostraremos como isolar e preparar células derivadas da medula óssea e agrupar células de camundongos.

Então, a primeira coisa que vou mostrar como fazer é remover os ossos do fêmur e isolar a medula óssea Primeiro, prenda o animal. Em seguida, molhe o animal com etanol 70%. Faça sua primeira incisão ao longo da linha média do animal.

Em seguida, corte dentro da perna, como estou mostrando aqui. Para expor o tecido muscular acima do fêmur, você deve ser capaz de afastar o músculo e agarrar o osso do fêmur grande com sua pinça de dissecção. Enquanto segura o osso com a pinça de dissecação, desça pelo osso e faça o primeiro corte logo abaixo da articulação.

Em seguida, trabalhe sua tesoura ao longo do comprimento do fêmur e corte-o o mais próximo possível do corpo. Isso pode resultar em um pouco de sangue, especialmente se você cortar a artéria femoral. Ao remover o fêmur, é extremamente importante que o osso seja mantido intacto.

Como você pode ver aqui, nas extremidades do osso não foram cortadas ou interrompidas. Uma vez que o fêmur tenha sido removido, corte qualquer tecido adicional e coloque o fêmur em um pequeno prato de nossa mídia PMI. Ao remover tecido adicional, certifique-se de que o osso do fêmur não seque.

Neste ponto, os ossos do fêmur devem ser transferidos para um prato contendo 70% de etanol e colocados no gelo por cinco a 10 minutos. Para o propósito deste vídeo, continuaremos na bancada do laboratório. No entanto, nesta fase do experimento, tudo deve ser transferido para uma capa de cultura de tecidos.

Depois que os ossos forem embebidos em etanol, você pode movê-los para um prato maior de meio estéril para a remoção da medula óssea. Agora estamos prontos para remover e ressuspender a medula óssea. Encha uma seringa de insulina com meio estéril e coloque-a de lado para uso posterior.

Segure o osso com sua pinça estéril. Segure-o sobre um pequeno prato para pedaços descartados e corte a epífise ou as pontas do osso de cada lado. Coloque sua seringa de insulina em um lado do osso e lave a medula do osso em 15 mils de meio.

Lave o osso mais uma ou duas vezes até que toda a medula seja eliminada. Uma vez que a medula é eliminada do osso, ela ficará quase completamente branca. Coloque o osso limpo no prato de descarte e repita o processo do outro fêmur.

Depois de concluído, interrompa suavemente todos os pedaços de medula que não foram quebrados pelo processo de lavagem para criar uma suspensão de célula única. Isso levará de cinco a 10 minutos de pipetagem. Coloque uma suspensão de célula única em um tubo cônico de 50 mil, lave a placa pelo menos três vezes com 10 mils de mídia.

A cada vez, gire as células, remova a mídia e ressuspenda as células escovando os dedos com firmeza e rapidez contra o fundo do tubo. Para remover os glóbulos vermelhos ou hemácias, realizamos uma lise de água. Outro método para remoção de glóbulos vermelhos é uma lise de cloreto de amônio.

Ambos os métodos foram descritos em artigos de vídeo JoVE anteriores. Isolamento de células T positivas para CD quatro de linfonodos de camundongos usando a purificação máxima de Milão JoVE edição nove e a preparação do fator de crescimento de células T de citos de ratos JoVE. Edição 10.

Após a remoção de suas hemácias, agora você está pronto para se cultivar. Então, antes de levá-lo através da cultura de células dendri, gostaria de apresentá-lo ao site da bigorna. O local da bigorna permitirá subtrair prever o crescimento da cultura de células dentro da incubadora para que possamos nos observar como elas se comportam ou se comportam mal.

Depois que uma cultura é configurada, você a coloca na bandeja de tamanho apropriado e fecha o local da bigorna. Em seguida, no seu computador, basta definir o intervalo de tempo e, em seguida, escolher os poços que deseja criar e deixar o site com tinta coletar dados para você. Os filmes mostrarão neste protocolo, demonstrar alterações na morfologia das células dendríticas in vitro.

Esses vídeos foram exportados diretamente do programa do site Incus. À medida que as células dendríticas são desenvolvidas do primeiro ao 11º dia, você pode ver uma verdadeira mudança morfológica à medida que elas aumentam e assumem o fenótipo das células dendríticas. Após a lisagem, hemácias e sua remoção, as células são lavadas em meio de células dendríticas primárias e plaqueadas a 5 milhões por mil.

Essas células devem ser inicialmente cultivadas em meios de cultura de células dendríticas primárias e, posteriormente, cultivá-las em meios DC secundários, que são suplementados com 40 nanogramas por mil IL quatro e cem nanogramas por mil TNF alfa. Essas citocinas ajudarão no desenvolvimento de células dendríticas maduras que se assemelham a células dendríticas derivadas de monócitos. Então, agora vou mostrar como são as culturas à medida que se desenvolvem e como mantê-las ao longo do tempo.

Depois de plaquear as células, você pode cultivar as células dendríticas por 72 horas antes de sua primeira troca de meio. Aqui está como será sua cultura típica logo após você colocar as células no primeiro dia. E aqui está uma olhada nas células.

No terceiro dia, você pode ver que as células começaram a aderir à placa, mas não assumiram o fenótipo clássico de células dendríticas. No quarto dia, remova a mídia e adicione 10 mils de nova aspiração de mídia DC primária da mídia. No quarto dia, removeremos os linfócitos de quaisquer outras células não aderentes.

Agora você pode se colocar de volta na incubadora por mais três dias, sete dias após o revestimento inicial. Aqui está como será sua cultura típica. Você pode dizer que é hora de dividir as células e substituí-las.

No sétimo dia, as células dendríticas são removidas da placa aspirando o meio e, em seguida, adicionando 300 EDTA estéril milimolar e incubando-o por cinco minutos. Em seguida, a placa é enxaguada repetidamente segurando em um ângulo de 45 graus e pipetando a solução de EDTA contra a parte de trás da placa. Isso é feito por vários minutos para garantir que você remova todas as células dendríticas aderentes.

As células são coletadas em um tubo cônico de 50 mili e lavadas duas vezes com meio DC secundário. As células são então ressuspensas e plaqueadas a 5 milhões de células por placa. As células dendríticas recém-revestidas do sétimo dia se estabelecem rapidamente no fundo da placa, aderem e começam a se espalhar.

Como você pode ver aqui no vídeo do site de Zichy, este vídeo foi feito na incubadora ao longo de dois dias para mostrar o desenvolvimento das células dendríticas desde a recolocação inicial feita no sétimo dia até o início do nono. As células dendríticas morfológicas podem ser ativadas no pulso de antígeno adicionando dois microgramas por LLPS aqui com cem microgramas para óvulos para uso com células T purificadas de OT dois camundongos, que têm óvulos específicos CD quatro células T positivas. Se você estiver usando um antígeno diferente, é importante certificar-se de usar uma concentração ideal de antígeno para pulsar seu dcs aqui, o OV e o LPS são adicionados ao meio primário de modo que a concentração final de LPS seja de dois microgramas por mil em 20 mils, e os óvulos sejam de cem microgramas por mil em 20 mils.

Aqui está uma fotografia de como é uma cultura típica de células dendríticas do dia 10. Você pode ver nesta fotografia que a morfologia é muito típica de uma célula apresentadora de antígeno. Você deve sempre verificar a porcentagem de células dendríticas positivas para CD 11 C por fax.

Isso é para garantir que você tenha uma cultura relativamente pura de células dendríticas para uso em seus experimentos. Aqui, usamos o sítio de tinta dos instrumentos SEN para monitorar a ativação de células dendríticas que foram tratadas com LPS em antígeno pulsado no dia 10. Este vídeo abrange um período de 24 horas imediatamente após a adição de LPS e o val e peptídeo, e nele as células dendríticas se tornam mais ativas e há algumas mudanças morfológicas óbvias.

Uma vez que suas células dendríticas tenham sido ativadas no pulso de antígeno, você pode coletá-las novamente por incubação com 300 milimolares EDTA e lavagem da placa. Agora gire suas células para baixo, lave duas vezes com 50 mils de mídia RPMI para remover qualquer antígeno adicional e rotule-as com o corante rastreador de células apropriado. Neste experimento, estarei visualizando as células do linfonodo inguinal.

Precisaremos injetar de dois a 5 milhões de células dendríticas por via dérmica na região do flanco do camundongo mostrada aqui. Em seguida, permitimos 24 horas para que as células dendríticas abriguem o linfonodo de treinamento. Aqui neste vídeo, as células dendríticas são marcadas com CMF two hc, um corante rastreador de células azuis.

Você pode ver as células dendríticas interagindo com células T marcadas que são antígenos específicos para volina. Essas células T são marcadas com ccf SE. Você também pode usar C-M-T-M-R ou qualquer um dos outros corantes rastreadores de células para sondas moleculares. Este é o estágio inicial de ativação das células T interagindo com dcs.

Por serem específicos do antígeno, você pode ver que as células T estão aderindo aos tentáculos dos dcs marcados em azul. Isso conclui nosso protocolo demonstrando a preparação e o uso de células dendríticas da medula óssea derivadas de camundongos em um experimento de imagem de dois bottons. Obrigado por assistir e boa sorte com seus próprios experimentos.