Name: Análise da Expressão e Montagem de Complexos das Proteínas da Cadeia Respiratória Mitocondrial na Levedura de Fissão Schizosaccharomyces pombe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a analisar complexos respiratórios mitocondriais em Schizosaccharomyces pombe usando SDS-PAGE e BN-PAGE. Este método revela o papel essencial do gene shy1 na montagem da cadeia respiratória celular.

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<ol><li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+mitochondria+to+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Getting mitochondria to center stage.</a> Biochem Biophys Res Comm. 434 (3), 407-410 (2013).</li>
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<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
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<li>Sellem, C. H., Lemaire, C., Lorin, S., Dujardin, G., Sainsard-Chanet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+Between+the+oxa1+and+rmp1+Genes+Modulates+Respiratory+Complex+Assembly+and+Life+Span+in+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Interaction Between the oxa1 and rmp1 Genes Modulates Respiratory Complex Assembly and Life Span in Podospora anserina.</a> Genetics. 169 (3), 1379-1389 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido 6-aminocaproice</td><td>Sangon</td><td>A430196</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida/Bis (37,5: 1) 40%&nbsp;</td><td>Biolab</td><td>GS1374</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sangon</td><td>A100486</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Atp6</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Cob1</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Cox1</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Cox2</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Cox3</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Hsp60</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:3000</td></tr><tr><td>Kit de quantificação de proteínas BCA</td><td>LEAGENE</td><td>PT0001</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>YEASEN</td><td>60105ES25</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>SERVA</td><td>17524.01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul brilhante R-250</td><td>Sangon</td><td>A100472</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sangon</td><td>A100691</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Solarbio</td><td>E8030</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de gradiente</td><td>Millet scientific</td><td>MGM-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Solarbio</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteína de alto peso molecular para PÁGINA nativa</td><td>Real Times</td><td>RTD6142</td><td></td></tr><tr><td>IgG-Alexa Fluor Plus 800 (anticorpo secundário anti-coelho)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32735</td><td>IB: 1:10000</td></tr><tr><td>Immobilon-FL 0.45 &mu; m Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPFL00005</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Moedor de tecidos Dounce</td><td>Thermo Fisher</td><td>K8853000015</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sangon</td><td>A610441</td><td></td></tr><tr><td>Lallzyme MMX</td><td>Lallemand</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de lise</td><td>Sigma</td><td>L3768</td><td></td></tr><tr><td>Lyticase</td><td>Sigma</td><td>L4025</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sangon</td><td>A601336</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sangon</td><td>A421333</td><td></td></tr><tr><td>Géis Bis-Tris nativos (pré-moldados)</td><td>Solarbio</td><td>PG41510-N</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sangon</td><td>A610425</td><td></td></tr><tr><td>Gel pré-moldado em execução tampão para coquetel</td> de inibidor de protease <td>Solarbio</td><td>PG00020-N</td><td></td>Native-PAGE</tr><tr><td>para extratos de levedura</td><td>Beyotime</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon</td><td>A610498&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td>Vinotaste</td><td>Novozymes</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase</td><td>MP Biomedicals</td><td>320921</td><td></td></tr></tbody></table>

análise da expressão e montagem de complexos das proteínas da cadeia respiratória mitocondrial na levedura de fissão schizosaccharomyces pombe

Analysis of the Expression and Complexes Assembly of the Mitochondrial Respiratory Chain Proteins in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Anteriormente, usamos este protocolo para investigar os efeitos da deleção de shy1, o homólogo de S. pombe de SURF1 humano, na expressão de proteínas da cadeia respiratória codificadas em mtDNA e na montagem de complexos da cadeia respiratória mitocondrial. Descobrimos que os níveis de estado estacionário de Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6 foram significativamente reduzidos na cepa Δshy1 (Figura 3), indicando que Shy1 é necessário para a expressão de proteín...

Análise da Expressão e Montagem de Complexos das Proteínas da Cadeia Respiratória Mitocondrial na Levedura de Fissão Schizosaccharomyces pombe

The mitochondrial respiratory chain is crucial for cellular energy metabolism, serving as the core of oxidative phosphorylation. The mitochondrial ...

analysis-expression-complexes-assembly-mitochondrial-respiratory

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós apresentamos um protocolo de como coletar e eletrônica processo de crio-tomograms de toda mitocôndrias. A técnica fornece informações detalhadas sobre a estrutura, função e organização de grandes complexos de proteínas de membrana em membranas biológicas nativas.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Este protocolo descreve a separação de complexos funcionais de cadeia de transporte de elétrons mitocondriais (Cx) IV e supercomplexos usando eletroforese nativa para revelar informações sobre sua montagem e estrutura. O gel nativo pode ser submetido a imunotransferência, ensaios em gel e purificação por eletroeluição para caracterizar ainda mais complexos individuais.

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

Este protocolo demonstra a análise dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul. Aqui, é descrito o método aplicado para culturas de células humanas.

Análise dos complexos de cadeia respiratória mitocondrial em células humanas cultivadas usando electroforese em Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Aqui apresentamos um protocolo para extrair, resolver e identificar supercomplexos mitocondrial que minimiza a exposição a detergentes e Coomassie Blue. Este protocolo oferece um equilíbrio ideal entre a resolução e a preservação das atividades enzimáticas, minimizando o risco de perda de interações proteína-proteína lábil.

Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na+, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.

Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Este trabalho explica como transformar mitocôndrias de levedura usando um método biolístico. Também mostramos como selecionar e purificar os transformantes e como introduzir a mutação desejada na posição alvo dentro do genoma mitocondrial.

Transformação mitocondrial em Baker

A respiração mitocondrial em células inteiras de levedura é um indicador valioso da bioenergética celular. Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar esse fenótipo aplicável a diferentes espécies de leveduras.

Quantificação da respiração mitocondrial em células inteiras de levedura

Aprenda a analisar complexos respiratórios mitocondriais em Schizosaccharomyces pombe usando SDS-PAGE e BN-PAGE. Este método revela o papel essencial do gene shy1 na montagem da cadeia respiratória celular.

Análise da Expressão e Montagem de Complexos das Proteínas da Cadeia Respiratória Mitocondrial na Levedura de Fissão Schizosaccharomyces pombe (Vídeo) | JoVE Journal

Análise da Expressão e Montagem de Complexos das Proteínas da Cadeia Respiratória Mitocondrial na Levedura de Fissão Schizosaccharomyces pombe

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