Análise da Expressão e Montagem de Complexos das Proteínas da Cadeia Respiratória Mitocondrial na Levedura de Fissão Schizosaccharomyces pombe

O escopo de nossa pesquisa é a tradução de proteínas mitocondriais, e tentamos elucidar os mecanismos que afetam a tradução e a montagem do complexo da cadeia respiratória mitocondrial. Nossa pesquisa descobriu que o shy1 desempenha um papel na sustentabilidade da função regular das mitocôndrias, participando da montagem de quatro infusões complexas. Nosso laboratório investigará o mecanismo de infusão de M=metotrexato.

[Narrador] Para começar, meça o peso úmido de um pellet celular de Schizosaccharomyces pombe. Ressuspenda as células em oito mililitros de tampão S. Adicione ditiotreitol a uma concentração final de 10 milimolares e fluoreto de fenilmetilsulfonil a um milimolar, garantindo que ambos os reagentes sejam preparados na hora. Adicione enzimas líticas à suspensão celular para digerir a parede celular de Schizosaccharomyces pombe. Gire o tubo em um agitador a 30 graus Celsius pela duração recomendada para a enzima lítica específica. Use um microscópio para observar a formação de esferoplastos. Em seguida, centrifugue a amostra por 10 minutos a 1.000 G, a 4 graus Celsius para pellet os esferoplastos. Ressuspenda o pellet em oito mililitros de tampão S gelado. Após duas lavagens, ressuspenda os esferoplastos em oito mililitros de tampão de homogeneização gelado contendo inibidores de protease. Transfira a mistura para um homogeneizador de penugem de vidro pré-resfriado contendo um pilão e um tubo de ensaio. Homogeneizar as células mecanicamente realizando aproximadamente 15 golpes para cima e para baixo com o pilão bem ajustado. Em seguida, examine os esferoplastos ao microscópio para verificar se há quebra da membrana. Agora transfira a suspensão homogeneizada para tubos de centrífuga. Centrifugue por cinco minutos a 1.000 G a 4 graus Celsius para produzir células intactas e detritos. Centrifugue o sobrenadante resultante por cinco minutos a 3.000 G a 4 graus Celsius para granular os núcleos. Em seguida, transferir o sobrenadante para tubos de centrifugação frescos. Centrifugue a 12.000 G por 15 minutos a 4 graus Celsius para pellet as mitocôndrias e outras organelas, ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de esfregão de sorbitol EDTA gelado após a decantação do sobrenadante. Em seguida, centrifugue novamente por 15 minutos a 12.000 G a 4 graus Celsius para lavar as mitocôndrias. Ressuspenda o pellet final em um mililitro de tampão de esfregonas de sorbitol EDTA gelado. Em seguida, alíquota das mitocôndrias purificadas em tubos de armazenamento para experimentos futuros. No SDS página carregando tampão em 40 microlitros de proteína total mitocondrial. Desnaturar as proteínas incubando a mistura pelo tempo indicado à temperatura adequada. Carregue aproximadamente 20 microgramas ou quatro microlitros de proteínas mitocondriais em um gel de página SDS a 12% antes do immunoblotting. Para preparar a amostra para a página BN, primeiro as mitocôndrias de alíquotas anteriores por centrifugação. Ressuspenda as mitocôndrias em 200 microlitros de tampão de gel de três páginas XBN. Em seguida, pipete dois microlitros de fluoreto de fenilmetilsulfonil 100 X e um microlitro de cloreto de magnésio molar. Centrifugue novamente por 15 minutos a 12.000 G a 4 graus Celsius. Ressuspenda o pellet mitocondrial em 160 microlitros de 5% em peso por volume dos dedos. Incube no gelo por 30 minutos, mexendo delicadamente a cada 10 minutos. Centrifugue a suspensão por cinco minutos a 20.000 G a 4 graus Celsius. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo. Adicione 80 microlitros de tampão de amostra de três páginas XBN à amostra tratada com digitorum. Ou 32 microlitros para a amostra tratada com DDM. Agora monte os géis Bis-Tris nativos pré-moldados com um gradiente de 3 a 12%. Carregue as amostras de proteína tratadas junto com marcadores de proteína de alto peso molecular para eletroforese em gel de poliacrilamida nativa. Execute o gel a uma tensão constante de 80 volts e corrente de seis miliamperes por 30 minutos usando tampão catódico contendo 0,02% de Kumasi G250. Substitua o tampão por tampão catódico sem Kumasi e continue funcionando a 10 miliamperes por três horas até que a frente do corante atinja o fundo do gel. Corte a faixa de gel que contém o marcador de proteína. Manchar o marcador com tampão Kumasi R250 durante 15 minutos. Em seguida, retire a coloração até que as faixas fiquem visíveis. Mergulhe a parte restante do gel no tampão de transferência de página BN por 30 minutos para equilibrar. Enxágue a membrana de PVDF de 0,45 micrômetro com metanol e equilibre em tampão de transferência por 10 minutos. Transfira proteínas do gel para a membrana de PVDF usando uma corrente constante de 300 miliamperes por duas horas. Enxágue a membrana de PVDF com metanol para remover o corante Kumasi. Em seguida, incube a membrana em tampão de bloqueio TBS contendo 5% de leite desnatado por uma hora a 25 graus Celsius. Incube a membrana de PVDF com os anticorpos primários especificados contra os complexos da cadeia respiratória mitocondrial Schizosaccharomyces pombe. Após uma incubação noturna a quatro graus Celsius, lave a membrana usando tampão TBST. Em seguida, incube a membrana no anticorpo secundário em uma diluição de um a 10.000 por uma hora a 25 graus Celsius. Depois de lavar a membrana com tampão TBST, exponha e escaneie a membrana de PVDF para visualizar os resultados do immunoblot. A deleção do gene shy1 levou a uma redução acentuada nos níveis de estado estacionário das proteínas da cadeia respiratória codificadas pelo DNA mitocondrial, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6. A análise da página nativa azul mostrou que a abundância dos supercomplexos de cadeia respiratória solubilizada DG 3242 e 324 foi reduzida nas células Delta shy1. Enquanto os níveis de supercomplexos 32.= e 55N permaneceram inalterados. O nível de DDM solubilizado no complexo diamétrico 3 permaneceu inalterado na linhagem Delta shy1.