Análise otimizada de proteínas de oócitos e embriões de Xenopus por immunoblotting

Ao longo da vida de um animal, as decisões de sulfato ocorrem continuamente, o que permite o desenvolvimento normal e a saúde de um organismo adulto. Essas decisões dependem de proteínas específicas referidas a reguladores de sulfato. O objetivo de nossa pesquisa é encontrar os mecanismos que controlam a síntese desses reguladores críticos.

Além de fornecer um esboço detalhado de oócitos e embriões de immunoblotting e Xenopus, nosso protocolo fornece informações sobre os desafios comuns a esse organismo modelo, como a aquisição de anticorpos. Por meio de um estudo aprofundado dos mecanismos de ligação e repressão do C Bicaudal, nossa pesquisa ajudou a estabelecer uma base de informações para comparar outros reguladores translacionais. Para iniciar o processamento de células para immunoblotting, adicione 10 microlitros de tampão de lise celular resfriado diluído a uma concentração única com água deionizada dupla por embrião ou oócito.

Usando um micropilão, homogeneizar as amostras no gelo. Coloque os tubos em uma centrífuga de bancada e gire as amostras a 5.000 g a quatro graus Celsius por 10 minutos para granular detritos, incluindo gema e pigmentos insolúveis. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo de 1,5 mililitro, garantindo que o pellet não seja perturbado durante a transferência.

Adicione um volume igual de tampão de amostra Laemmli duas vezes suplementado com 5% de peso por volume de 2-mercaptoetanol ao sobrenadante coletado. Aqueça a mistura a 95 a 100 graus Celsius por 10 minutos para desnaturar as proteínas. Agora, remova um gel pré-moldado SDS de 4 a 12% bis-tris de sua embalagem e retire o adesivo da parte inferior do gel.

Insira o gel no conjunto do eletrodo oposto a uma barragem tampão e coloque todo o conjunto em um tanque de eletroforese vertical. Em seguida, encha o conjunto do eletrodo e o fundo do tanque com o amortecedor de corrida Tris-MOPS-SDS. Remova suavemente o pente de gel e a pipeta que passa o tampão nos poços para eliminar bolhas e equilibrar o tampão.

Agora, carregue cinco microlitros de padrões de proteína pré-corados no primeiro poço e 10 microlitros de cada amostra preparada nos poços restantes. Coloque a tampa no tanque de eletroforese e conecte-o a uma fonte de alimentação. Em seguida, defina a tensão para 200 volts para iniciar a eletroforese.

Pare a eletroforese assim que a frente do corante tampão de amostra sair do gel. Antes que a eletroforese seja concluída, comece a montar o sanduíche de transferência no clipe de transferência. Encha uma assadeira de vidro com tampão de transferência resfriado e mergulhe todos os materiais de transferência neste tampão durante a montagem.

Coloque o clipe de transferência no prato com a metade preta encostada no fundo, a metade branca apontada para cima e o clipe aberto para a esquerda. Coloque uma ou duas esponjas de fibra planas na metade preta do clipe de transferência. Depois de cortar dois pedaços de papel de cromatografia de celulose de 0,35 milímetros no tamanho certo, coloque um em cima das esponjas.

Quando a eletroforese estiver concluída, remova o gel do tanque de eletroforese. Usando a alavanca de abertura do de gel, retire cuidadosamente as placas de gel, garantindo que o gel permaneça preso a um lado. Apare os poços da parte superior do gel usando o liberador de gel.

Coloque o gel, ainda preso a uma metade do de plástico, no papel de filtro e remova a metade restante do para que o gel fique plano no papel. Em seguida, corte um pedaço de membrana de nitrocelulose de 0,45 micrômetro para corresponder às dimensões do gel. Remova a membrana de seu papel protetor, umedeça-a brevemente em tampão de transferência e coloque-a cuidadosamente em cima do gel.

Em seguida, coloque um segundo pedaço de papel de filtro em cima da membrana de nitrocelulose. Usando um rolo, pressione suavemente, mas com firmeza, todas as bolhas de ar. Empilhe uma ou duas esponjas de fibra adicionais em cima do papel de filtro para completar o sanduíche.

Feche o de transferência e prenda-o firmemente para selar o sanduíche montado. Em seguida, insira o sanduíche de transferência fechado no núcleo de transferência com o clipe voltado para cima e certifique-se de que o lado preto do clipe esteja voltado para o lado preto do núcleo. Coloque o núcleo de transferência no tanque de eletroforese.

Adicione uma bolsa de gelo e uma barra de agitação ao tanque, garantindo que a barra de agitação possa girar livremente. Encha o tanque com tampão de transferência resfriado até que o aparelho esteja totalmente submerso e prenda a tampa na parte superior. Conecte o aparelho à fonte de alimentação, combine as cores do eletrodo e defina as condições para 100 volts por uma hora com a barra de agitação girando.

Quando a transferência estiver concluída, abra cuidadosamente o e desmonte o sanduíche. Remova a membrana de nitrocelulose e marque o lado que estava em contato com o gel. Em seguida, coloque a membrana de nitrocelulose em um pequeno recipiente de forma que fique plana contra o fundo.

Cubra a membrana completamente com a mancha Ponceau e balance suavemente em uma cadeira de balanço por 5 a 10 minutos. Depois de derramar a mancha de Ponceau, enxágue a membrana várias vezes com água deionizada dupla até que o excesso de mancha seja removido e as faixas de proteína se tornem visíveis nas faixas. Em seguida, execute o bloqueio da membrana, a incubação de anticorpos e as etapas de lavagem, conforme mostrado.

Uma vez concluída a incubação e lavagem do anticorpo secundário, a membrana está pronta para a imagem. Em uma sala escura, ligue o revelador de filme e deixe-o aquecer. Corte dois quadrados de filme plástico grandes o suficiente para cobrir totalmente a membrana.

Usando uma pinça, coloque a membrana de nitrocelulose voltada para cima no primeiro quadrado de filme plástico. Em um tubo de 1,5 mililitro, misture volumes iguais de luminol de quimioluminescência aprimorado e reagentes intensificadores. Em seguida, use aproximadamente um mililitro da mistura para cobrir a maioria das membranas.

Usando o filme plástico, manipule suavemente a membrana para garantir que toda a superfície seja revestida uniformemente e incube por um minuto. Em seguida, remova o excesso de reagente ECL segurando a membrana com uma pinça e sacudindo levemente o líquido. Coloque a membrana voltada para cima no segundo quadrado de filme plástico, dobre-a frouxamente sobre a membrana e prenda o envoltório com fita adesiva em um de autorradiografia.

Em seguida, crie uma imagem da membrana usando um filme de autorradiografia em uma sala escura seguindo as etapas mostradas. Depois que a visualização desejada da proteína for alcançada, alinhe o filme revelado com os marcadores que brilham no escuro e use-os como guia para marcar a posição dos padrões de proteína pré-corados no filme. Quando a imagem estiver concluída, remova cuidadosamente a membrana do filme plástico e mergulhe-a em TBSTW para lavar o reagente residual de ECL.

A coloração de Ponceau da membrana confirmou o sucesso da transferência de proteínas. A proteína B1 endógena não foi detectada em amostras de oócitos, mas foi claramente detectada em amostras de embriões de estágio sete e estágio 10,5 em aproximadamente 107 kilodaltons. Uma banda de proteína menor de 70 kilodalton foi detectada em amostras injetadas em todos os estágios usando o anticorpo Bicc1, indicando a expressão bem-sucedida da fusão C-terminal HA-Bicc1.

O anticorpo HA detectou a mesma banda de 70 kilodalton apenas nas amostras injetadas, confirmando a especificidade do anticorpo Bicc1 para a proteína de fusão. Duas bandas de alto peso molecular, aproximadamente 250 e 270 kilodaltons, foram detectadas em todas as amostras usando o anticorpo CNOT1. A expressão da proteína DDX6 de 54 kilodalton foi detectada em todas as amostras, mas foi visivelmente reduzida nos embriões do estágio 10,5.