$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Окрашивание по Граму позволяет быстро визуализировать морфологию бактерий и проводить широкое клеточное различие из широкого спектра образцов окружающей среды. Чтобы испачкать бактерии, равномерный мазок наносят на стеклянную сторону и дают ему высохнуть. После термофиксации мазка наносится хрустальная фиалка.
Обесцвечивающий агент вымывает кристаллический фиолетовый цвет из грамотрицательных клеток, но не из грамположительных. Второй краситель, обычно сафранин, используется в качестве фонового окрашивания для визуализации грамотрицательных клеток. После окрашивания клетки могут быть оценены по морфологии, размеру и расположению клеток, таких как цепочки или кластеры.
В этом видео будет показано, как подготовить образец окружающей среды, изолировать обнаруженные в нем виды бактерий и выполнить окрашивание по Граму изолированных колоний
Окрашивание по Граму позволяет разделить большинство бактерий на два широких структурных класса: грамположительные и грамотрицательные. В то время как оба класса имеют фосфолипидную плазматическую мембрану, структура клеточной стенки сильно варьирует. Грамположительная клеточная стенка в основном состоит из толстого слоя пептидогликана, который представляет собой полимер, состоящий из сахаров и аминокислот. Грамотрицательные клеточные стенки имеют более тонкий слой пептидогликана, зажатый между второй липидной мембраной. Эта внешняя мембрана обычно содержит липополисахариды.
Положительно заряженный кристаллический фиолетовый слабо связывается с отрицательно заряженной клеточной стенкой бактерии. Йод Грама образует нерастворимый комплекс с кристаллическим фиолетовым красителем, тем самым фиксируя его в клеточной стенке.
На этапе обесцвечивания пептидогликан в грамположительных клетках обезвоживается, в результате чего он сокращается и захватывает кристаллические фиолетово-йодные комплексы. В грамотрицательных клетках обесцвечивающий агент компрометирует внешнюю мембрану, увеличивая ее пористость. Это позволяет вымываться кристаллическим фиолетово-йодным комплексам.
Теперь, когда вы понимаете принципы окрашивания почвенных бактерий по Граму, давайте посмотрим на процесс, выполняемый на почвенных бактериях в лаборатории.
После сбора образца почвы в поле, принесите его в лабораторию для анализа. Очистите пробу с помощью сита, а просеянного грунта взвесьте 10 г с помощью аналитических весов.
Разведите образец в 95 мл фосфатно-солевого буфера и смешайте вортекс. Выполните еще от 1 до 10 разведений, делая вихри между каждым разведением. Перенесите аликвоты не менее 3 последовательных разведений на повторяющиеся пластины с низким содержанием питательных веществ.
После стерилизации этанолом и охлаждения изогнутого стеклянного стержня путем постукивания по среде распределите образец по поверхности планшетов. Инкубируйте пластины при комнатной температуре. После инкубации в течение 3-5 дней выберите наибольшее разведение с 30-300 дискретными колониями. С помощью стерильной инокуляционной петли выберите интересующие колонии для изоляции.
Выложите колонию на одну часть свежей тарелки. Стерилизуя петлю между полосами, сделайте последовательные полосы зигзагообразным узором на каждом участке пластины, чтобы обеспечить последующую изоляцию дискретных одиночных колоний. Выдержите тарелки от 1 до 2 суток при комнатной температуре.
Чтобы начать подготовку бактериальных мазков, прикрепите клипсу к предварительно очищенному предметному стеклу для удобства обращения. Для каждого бактериального мазка очистите и простирание простиранной петли. Поместите 2 полные петли стерильной дистиллированной воды на центр предметного стекла.
После повторной стерилизации петли извлеките небольшое количество культуры из изолированной колонии, и смешайте с водой на горке. Важно охладить петлю перед тем, как прикасаться к культуре, постукивая по неинокулированной части агара несколько раз. Мазок должен напоминать разбавленное молоко. Дайте предметному стеклу высохнуть при комнатной температуре. После высыхания термически закрепите мазок, быстро пропустив его через пламя.
После высыхания нанесите пипетку на мазок с кристаллическим фиолетовым цветом и оставьте на 2-3 минуты. Тщательно промойте предметное стекло дистиллированной водой, направив прямой поток к верхней части предметного стекла, позволяя воде плавно стекать вниз. Не направляйте поток воды прямо на мазок.
Накройте предметное стекло йодом по Граму. Через 2 минуты аккуратно смойте дистиллированной водой. Обесцвечивайте предметное стекло 95% этанолом, пока пятно не перестанет смываться. Сразу же смойте дистиллированной водой. Это ограничит чрезмерное обесцвечивание мазка.
Добавьте сафранин в качестве противопятника в мазок на 30 с. Это приведет к окрашиванию любых присутствующих грамотрицательных клеток. Аккуратно промойте дистиллированной водой и промокните насухо впитывающей бумагой. Понаблюдайте за полученным предметным стеклом с помощью микроскопа. Сначала используйте объектив с низким энергопотреблением, чтобы выполнить грубую регулировку и найти идеальную часть мазка, прежде чем переходить к меньшему полю зрения при больших увеличениях.
После дальнейшей визуализации и корректировки мазка с помощью объектива средней мощности добавьте погружное масло непосредственно в мазок. Масло необходимо для целей с высокой мощностью, которые обеспечат наилучшие микрофотографии. Грамположительные бактерии будут иметь синий или фиолетовый цвет, в то время как грамотрицательные клетки будут красными или розовыми. Помимо структуры, формы и расположения клеточной стенки выясняются полученные микрофотографии.
Способность окрашивания по Граму качественно изучать бактерии важна для широкого круга научных областей.
Почва является лишь одним из источников окружающей среды, из которого можно выделить и проанализировать бактерии. Для питьевой воды пробоподготовку необходимо модифицировать. Образцы водопроводной воды могут быть взяты из крана и нанесены на питательную среду, что способствует росту разнообразных, гетеротрофных колоний бактерий. При нанесении покрытия на такую среду, как R2A, процесс практически идентичен процедуре обработки почвы.
Для некоторых методов идентификации бактерий параметры зависят от типа клеточной стенки интересующей бактерии. В этом примере кровь пациента с сепсисом была проверена, и было обнаружено, что в ней содержатся грамположительные бактерии.
На основе этой информации были выбраны видоспецифичные пептидные нуклеиновые кислоты, которые будут связываться с рРНК клеток. Эти зонды были связаны с флуоресцентными красителями, которые использовались для идентификации присутствующих видов.
Из-за фундаментальных различий в грамположительных и отрицательных клеточных структурах, бактерии обладают уникальными реакциями на другие соединения, помимо кристаллического фиолетового. Этот эксперимент был направлен на выделение грамположительной бактерии Clostridium difficile из образцов фекалий. В агаровую пластину добавляли циклосерин, который подавляет рост грамотрицательных клеток. Грамположительные клетки, которые росли на планшете, были дополнительно выделены с помощью других методов.
Вы только что посмотрели введение JoVE в окрашивание по Граму для экологических исследований. Теперь вы должны понять преимущества этого процесса, а также то, как выполнять технику и использовать результаты. Спасибо за просмотр!
