Очистка плазмид

Плазмиды представляют собой кольцевые, внехромосомные молекулы ДНК, и в молекулярной биологии они выступают в качестве носителей или векторов для определенного фрагмента ДНК. Бактерии используются для репликации плазмид, так что интересующая вас ДНК производится массово. Процесс, с помощью которого исследователи получают плазмиды из бактерий, называется очисткой плазмид, о чем будет рассказано в этом видео.

Очевидно, что очистка плазмид включает в себя очистку плазмид, но что именно это означает? Чтобы очистить плазмиды, их необходимо выделить из бактериальной хромосомы, белков, бактериальной мембраны и бактериальных рибосом.

Несмотря на то, что существует множество различных наборов для очистки плазмид, основной принцип очистки плазмид остается неизменным для всех. Во-первых, выбранная колония бактерий выращивается в соответствующей питательной среде, содержащей правильные антибиотики. Благодаря гену устойчивости к антибиотикам, кодируемому плазмидой, в этой среде будут расти только бактерии, содержащие плазмиду. Бактерии собирают и лизируют при высоком pH. pH нейтрализуется, добавляется соль, а затем смесь вращается вниз для удаления мусора и геномной ДНК.

Нейтрализованный лизат клеток добавляется в колонку с кремнеземом. Считается, что плазмидная ДНК прикрепляется к колонке через механизм, называемый анионным обменом, где ДНК, сильный анион, связывается с отрицательно заряженной колонкой через мостик катионной соли. Другой материал из лизата, такой как белки, промывается через колонку с буферами с высоким содержанием солей. Наконец, очищенная плазмида высвобождается из колонки при добавлении буфера с низким содержанием солей, разрушающего солевой мостик.

Для этой процедуры следует надеть лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки.

Бактериальные культуры, которые трансформируются с помощью желаемой плазмидной ДНК, должны быть выращены в течение ночи в питательных средах с соответствующим антибиотиком в инкубаторе с температурой 37°C.

На следующий день культуру бактерий гранулируют центрифугированием и удаляют надосадочную жидкость. Оставшаяся гранула ресуспендируется в буфере для лизиса.

После ресуспендирования бактерии могут быть перенесены в пробирку меньшего размера, где добавляется буфер для лизиса. Буфер для лизиса имеет высокий pH и содержит детергенты, такие как додецилсульфат натрия, которые разрушают бактериальные мембраны, тем самым лизируя бактерии. При добавлении лизисного буфера раствор помутнеет, а после смешивания раствор станет более прозрачным. Смесь не должна подвергаться вихревому образованию из-за возможности сдвига или разрыва геномной ДНК, что может привести к загрязнению плазмидной ДНК при очистке.

Затем добавляется нейтрализующий буфер для нейтрализации щелочных условий и снижения pH. При бережном смешивании геномная ДНК, а также любые связанные с ней белки будут осаждаться, в то время как плазмидная ДНК останется в растворе. Опять же, избегайте вортексинга, так как ваши плазмиды свободны от геномного загрязнения ДНК.

Затем смесь центрифугируют и гранулируют геномный осадок ДНК/белка. Надосадочная жидкость содержит плазмидную ДНК, а также растворимые белки.

Эта надосадочная жидкость помещается на колонку путем декантации, причудливого названия для его выливания, или пипетирования. Пеллеты можно выбросить.

Затем промывочный буфер с высоким содержанием солей проходит через колонку, в то время как ДНК остается связанной с диоксидом кремния. Повторные этапы промывки с высоким содержанием соли удаляют эндонуклеазы, РНК, белки, красители и низкомолекулярные примеси. От протекания этапов промывки следует отказаться. После заключительного этапа промывки убедитесь, что фильтр полностью сухой и в нем не осталось буфера. ДНК плазмиды все еще находится на фильтре.

ДНК плазмиды элюируют стерильной водой или элюирующим буфером. ДНК легко доступна для немедленного использования в широком спектре приложений.

Существует несколько способов проверки чистоты плазмид после очистки. Спектрометр может быть использован для сравнения поглощения на разных длинах волн для определения концентрации плазмидной ДНК. Анализ очищенной плазмиды в агарозном геле может определить, имеет ли плазмида правильный размер и нет ли в ней загрязняющих веществ. Этот шаг гарантирует, что не произойдет загрязнения геномной ДНК и плазмида не будет модифицирована бактериями.

Процедура очистки плазмид может быть модифицирована для адаптации к различным размерам плазмид, числу копий, объему культуры, а также может включать в себя различное оборудование для этапов связывания, промывки и элюирования. Выход продукции является одним из наиболее заметных различий между плазмидными препаратами, и их часто делят на минипрепарат, или минипреп, мидипреп, максипреп и мегапреп в зависимости от желаемого выхода.

С точки зрения последующих применений, одной из процедур, которая обычно следует за очисткой плазмид, является трансфекция, которая включает в себя введение плазмидной ДНК в эукариотические клетки. Часто целью эксперимента по трансфекции является визуализация структуры клеток и тканей с помощью репортерных белков, таких как те, которые помечают нейроны на изображениях, которые вы видите здесь.

Иногда несколько плазмид, очищенных несколькими препаратами очистки, могут быть введены в одну и ту же бактерию, тем самым воспроизводя весь биосинтетический путь через производство ряда ферментов, кодируемых плазмидами. Конечным результатом является производство сложным соединением, подобным антибиотику, который вы видите здесь, клетками.

Очищенные плазмиды могут быть повторно введены в организм бактерий с целью получения большого количества белка, кодируемого плазмидой. Здесь вы видите, как бактериальные клетки гомогенизируются и лизируются перед тем, как можно будет выполнить метод, называемый аффинной очисткой, для выделения целевого белка. Очищенный белок кристаллизуется, а затем идентифицируется его структура.

Вы только что посмотрели введение JoVE в очистку плазмид. В этом видео мы обсудили основные принципы этого метода, его пошаговое описание и несколько применений вашей плазмидной подготовки. Как всегда, спасибо за просмотр!