Цитогенетика

Цитогенетика — это изучение структуры и свойств хромосом, а также их поведения при делении клеток и их роли в наследственности. Хромосому, которая представляет собой молекулу ДНК и связанных с ней белков, можно наблюдать под микроскопом с помощью красителей и зондов. Такие наблюдения являются мощным подходом к выявлению дефектов в структуре и количестве хромосом, которые часто связаны с заболеваниями и нарушениями.

В этом видео будут рассмотрены принципы цитогенетики, протокол широко используемого метода выделения специфических особенностей хромосом, известного как флуоресцентная гибридизация in situ, и некоторые применения этого метода.

Давайте начнем с обсуждения важности цитогенетики и принципов, лежащих в основе некоторых классических и современных методов в этой области.

Цитогенетика включает в себя непосредственное наблюдение за структурой и количеством хромосом клетки, известным как ее «кариотип». Она может быть использована для обнаружения отклонений от нормального диплоидного, или парного, числа хромосом, что называется анеуплоидией, а также дефектов в структуре хромосом.

Многие заболевания и нарушения являются результатом хромосомных аномалий. Например, филадельфийская хромосома, которая возникает в результате реципрокной транслокации между частями хромосом 9 и 22, связана с хроническим миелолейкозом. Другим примером является трисомия 21, наиболее распространенная причина синдрома Дауна, при котором наследуется дополнительная копия хромосомы 21.

Кариотипирование обычно проводится на клетках, которые готовятся к делению, когда их хромосомы конденсированы и их можно легко различить.

Хромосомы в кариотипе можно обрабатывать с помощью пятен, которые выявляют характерные полосатые узоры. Окрашенные хромосомы затем могут быть упорядочены по размеру и форме для анализа кариотипа. Для выделения конкретных хромосомных особенностей может быть применено несколько красителей. Окрашивание Гимзой, или G-полосами, отмечает плотно упакованные, обычно бедные генами области, богатые A-T основаниями. R-полосатость — это окрашивание по методу Гимзы, которое выделяет хромосомные области, богатые основаниями G-C. С-полосы выделяют самые плотные хромосомные области вокруг центромеры, структуры, которая соединяет идентичные половины дублированной хромосомы, в то время как Т-полосы выделяют концы хромосом или теломер.

Другой метод, называемый флуоресцентной гибридизацией in situ, или FISH, позволяет обнаруживать определенные хромосомы, участки ДНК или транскрипты РНК. Это достигается путем инкубации образца с высокоспецифичными олигонуклеотидными зондами, которые флуоресцентно мечены. Поскольку эти зонды могут быть гибридизованы с неконденсированными хромосомами в неделящихся клетках, FISH может применяться более широко, чем классические методы кариотипирования.

Наконец, исследователи также разработали метод, называемый сравнительной геномной гибридизацией, для скрининга отсутствующих или дублированных хромосомных областей. Геномная ДНК испытуемого и контрольного субъекта изолируется, фрагментируется и мечется флуорофорами разного цвета. Затем фрагментированные геномные препараты смешивают и конкурентно гибридизуют с нормальным распространением хромосом. Цвета полученного кариотипа указывают, дублируется ли регион в тестовом образце, что генерирует больше фрагментов для связывания распространения, или же регион удаляется, что приводит к преимущественной привязке к более многочисленным контрольным фрагментам.

Теперь, когда вы понимаете принципы цитогенетики, давайте применим их на практике и подробнее рассмотрим, как выполняется FISH.

Во-первых, изолированные ткани или клетки обрабатываются фиксатором, таким как параформальдегид, для сохранения морфологии и целостности хромосомы. Затем подготавливается хромосомное распространение, например, путем механического разрушения материала. Затем хромосомы обезвоживают в серии растворов с возрастающими концентрациями этанола и проникают в раствор пепсина, чтобы сделать последовательности-мишени более доступными для зондов. Затем хромосомы промывают и стабилизируют постфиксом, денатурируют формамидом, чтобы теперь одноцепочечная ДНК могла связывать зонды, и обезвоживают во второй серии все более концентрированных растворов этанола.

Флуоресцентно меченные, высокоспецифичные ДНК-зонды подготавливаются и смешиваются с немечеными повторяющимися фрагментами ДНК для блокирования неспецифического связывания. Затем зонд прикладывают к распространению хромосомы, где он гибридизуется со своей целевой последовательностью, а несвязанный зонд удаляется с помощью серии размывок.

Наконец, хромосомы помещают в среду, которая сохраняет образец и содержит общее противопятно ДНК, такое как DAPI, которое помечает фоновую геномную ДНК, и наносится покровное стекло. На этом этапе образцы можно наблюдать под флуоресцентным микроскопом с использованием соответствующих наборов фильтров для визуализации геномной ДНК и специфичных для последовательности особенностей.

Увидев, как выполняется FISH, давайте рассмотрим некоторые применения этой мощной техники.

FISH может быть использован для подтверждения того, что кариотип эмбриона является нормальным до имплантации. Здесь одна клетка, известная как бластомер, была взята из эмбриона через три дня после оплодотворения, а затем лизирована и зафиксирована непосредственно на предметном стекле микроскопа. Затем хромосомный разброс был гибридизован с зондами, специально подобранными для выявления потенциальных хромосомных нарушений. В этом случае отклонения от ожидаемой картины сигналов гибридизации указывают на нарушения в количестве или структуре хромосом.

Также были разработаны инновационные методы маркировки всех хромосом из одного биологического образца. Один из таких методов включает в себя октохромное устройство, восьмиклеточное стеклянное стекло с предварительно загруженным флуоресцентными зондами. Все 22 хромосомы, не определяющие пол, называемые аутосомами, и две половые хромосомы были помечены путем их распределения по восьми окнам, каждое из которых содержало по три хромосомо-специфичных флуорофора. Это позволило проводить одновременный скрининг всех хромосом в результате одной гибридизации.

Наконец, вместо того, чтобы разделять зонды на разные окна на предметном стекле, все хромосомы могут быть помечены, а затем обнаружены вместе с помощью подхода, называемого спектральным кариотипированием или SKY. Несколько хромосомно-специфичных зондов с различными флуоресцентными метками были гибридизированы с каждой хромосомой, придав каждой из них уникальный спектральный цвет. Одновременные наблюдения за объединенной смесью хромосом особенно полезны для идентификации дефектов кариотипа и могут быть использованы для выявления анеуплоидий, а также хромосомных делеций и транслокаций.

Вы только что посмотрели видео JoVE о цитогенетике. В этом видео вы узнали о принципах цитогенетики, методах, таких как кариотипирование и FISH, которые используются для выделения конкретных особенностей хромосом, и применении этих методов. Последние достижения в области цитогенетики расширили их возможности как в исследовательских, так и в патологических лабораториях, и они продолжат находить широкое применение на переднем крае исследований и диагностики заболеваний. Спасибо за просмотр!