Обработка Лоблолли Пайн PtGen2 кДНК Microarray

Это видео было подготовлено исследователями из Школы лесного хозяйства и природных ресурсов Уорнелла Университета Джорджии. Цель этого обучающего видео - подробно описать, как обрабатывать наш микрочип LOB lolly pine pt, gen two CDNA, уделяя особое внимание промывке и обращению с матрицей, как до, так и после гибридизации. В целом, наши протоколы соответствуют протоколам, разработанным в Институте геномных исследований Tiger и Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, где печатаются наши массивы.

Мы обнаружили, что требуется более строгая обработка PT Gen 2 для обеспечения максимальной согласованности в отношении однородности качества сигнала и низкого фона. Первым шагом является предварительная стирка. Мы делаем это, потому что наш пятнистый буфер содержит очень высокое содержание соли, и эта предварительная промывка необходима для удаления этой соли.

Предметные стекла помещаются в держатель предметного стекла для микроскопа и энергично погружаются от 15 до 20 раз в раствор SDS 0,2%, предварительно нагретый до 43 градусов. После того, как предметные стекла промыты в растворе SDS, они осторожно удаляются с помощью щипцов в банку Copeland, содержащую буфер для предварительной гибридизации. Этот буфер содержит пять XSSC 0,1% SDS и 1% BSA, а также нагревается при 43 градусах.

Баночку Copeland накрывают отдушкой и помещают в инкубатор с температурой 43 градуса на один час. После предварительной гибридизации предметные стекла перемещают на носитель предметного стекла микроскопа и последовательно обрабатывают путем пяти смен деионизированной воды, погружая ее от 15 до 20 раз при каждой замене. Наконец, предметные стекла помещают в изопропанол и погружают пять или шесть раз, прежде чем центрифугировать до полного высыхания в центрифуге чипа M mate.

После центрифугирования стекла обдуваются сжатым воздухом, пропущенным через фильтр 0,2 микрона. Затем на слайды накладываются талоны подъемника, которые также очищаются сжатым воздухом, и мы используем небольшой наконечник для пипетки для регулировки клинка подъемника в правильное положение. На слайде.

После того, как лифтеры были установлены, но до добавления буфера для гибридизации, мы добавляем 20 микролитров 100 миллимолярных дихи, три атола в колодцы влажности, расположенные в торцах камеры. Теперь мы готовы добавить целевые CDNA, которые были ресуспендированы в буфере гибридизации. Наконечник пипетки помещается на край шлифовки подъемника, а предметное стекло и раствор медленно пипетируются.

Мы обнаружили, что использование капиллярного эффекта для загрузки массивов обеспечивает наибольшую согласованность и значительно снижает количество нежелательных пузырьков. После того, как целевой материал был добавлен в массив, камера гибридизации собирается и накрывается алюминиевой фольгой. Затем гибридизационную камеру помещают в водяную баню для ночной инкубации, обычно от 14 до 16 часов.

Водяная баня установлена на 48 градусов, а шейкер — на 50 оборотов в минуту. Важно также отметить, что с момента добавления гибридизационного раствора на всех постгибридизационных промывках, процедуры проводятся при слабом освещении для предотвращения фотоокисления. На следующий день предметные стекла вынимают из камеры гибридизации и помещают в банку Copeland, содержащую промывочный раствор номер один, который был предварительно нагрет до 53 градусов.

Предметные стекла остаются в банке Коупленда примерно на минуту до тех пор, пока слипы подъемника не отпадут, после чего предметные стекла аккуратно удаляются щипцами и помещаются в держатель предметного стекла для микроскопа для продолжения промывки. Затем предметные стекла энергично погружают примерно от 15 до 20 раз во второй контейнер, также содержащий моющий раствор номер один при температуре 53 градуса. Затем контейнер накрывают отдушкой и помещают в воздушный шейкер инкубатора, установленный на 53 градуса и сто оборотов в минуту.

После 10-минутной инкубации и промывочного раствора, номер один, предметные стекла энергично погружают от 15 до 20 раз в контейнер с моющим раствором номер два, который находится при комнатной температуре контейнера. Его накрывают пара-пленкой и снова помещают в шейкер при комнатной температуре для 10-минутной инкубации. Наконец, предметные стекла вынимают из промывочного раствора No два и энергично погружают от 15 до 20 раз в емкость с моющим раствором No три.

Затем горки убирают во вторую емкость с моющим раствором номер три, покрывают перфилом и снова помещают на шейкер на 10 минут. После окончательной промывки центрифугируем предметные стекла до полного высыхания. Для этого мы помещаем колпачок Falcon 15 мил в коническую трубку 50 мил, а штрих-код матрицы помещаем вниз в коническую трубку.

Затем трубки вращаются в качающейся головке ведра со скоростью 1500 об/мин при комнатной температуре. После центрифугирования предметные стекла удаляются во второй комплект конических трубок диаметром 50 мил, которые были покрыты алюминиевой фольгой. Затем трубки продуваются газообразным азотом, который фильтруется через фильтр 0,22 микрона и крышку для транспортировки или хранения до сканирования.

Мы собираем данные сканирования на матрице сканирования PerkinElmer 5 000. Изображение массива разбивается на сетку, необработанные данные сканирования обрабатываются, а первоначальный анализ данных выполняется с помощью программного обеспечения для визуализации bio discovery. Затем данные об интенсивности точечного сигнала нормализуются по мере выполнения статистического анализа с помощью инструментов BRB Array, надежного и свободно доступного статистического пакета микрочипов, который можно загрузить в Национальном институте рака.

Другой статистический анализ и поиск шаблонов экспрессии генов выполняются с помощью набора шаблонов экспрессии и анализа генов Jeep PPA. Еще один свободно доступный пакет веб-анализа. Благодарим вас за просмотр нашего видео о том, как обрабатывать микрочип lob lolly pine PT Gen two.

Следующие лица отвечали за содержание и производство этого учебного видео.