Обработка Лоблолли Пайн PtGen2 кДНК Microarray
20 марта 2009 г.
КДНК микрочипов PtGen2 был разработан для изучения экспрессии генов в ладанной сосна, П. taeda, И других хвойных пород. Здесь мы покажем, пре-и пост-гибридизация обработки и мытья методов, которые могут быть использованы с этого массива для получения лучшей консистенции, снижение артефактов, и нижний фон.
Это видео было подготовлено исследователями из Школы лесного хозяйства и природных ресурсов Уорнелла Университета Джорджии. Цель этого обучающего видео - подробно описать, как обрабатывать наш микрочип LOB lolly pine pt, gen two CDNA, уделяя особое внимание промывке и обращению с матрицей, как до, так и после гибридизации. В целом, наши протоколы соответствуют протоколам, разработанным в Институте геномных исследований Tiger и Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, где печатаются наши массивы.
Мы обнаружили, что требуется более строгая обработка PT Gen 2 для обеспечения максимальной согласованности в отношении однородности качества сигнала и низкого фона. Первым шагом является предварительная стирка. Мы делаем это, потому что наш пятнистый буфер содержит очень высокое содержание соли, и эта предварительная промывка необходима для удаления этой соли.
Предметные стекла помещаются в держатель предметного стекла для микроскопа и энергично погружаются от 15 до 20 раз в раствор SDS 0,2%, предварительно нагретый до 43 градусов. После того, как предметные стекла промыты в растворе SDS, они осторожно удаляются с помощью щипцов в банку Copeland, содержащую буфер для предварительной гибридизации. Этот буфер содержит пять XSSC 0,1% SDS и 1% BSA, а также нагревается при 43 градусах.
Баночку Copeland накрывают отдушкой и помещают в инкубатор с температурой 43 градуса на один час. После предварительной гибридизации предметные стекла перемещают на носитель предметного стекла микроскопа и последовательно обрабатывают путем пяти смен деионизированной воды, погружая ее от 15 до 20 раз при каждой замене. Наконец, предметные стекла помещают в изопропанол и погружают пять или шесть раз, прежде чем центрифугировать до полного высыхания в центрифуге чипа M mate.
После центрифугирования стекла обдуваются сжатым воздухом, пропущенным через фильтр 0,2 микрона. Затем на слайды накладываются талоны подъемника, которые также очищаются сжатым воздухом, и мы используем небольшой наконечник для пипетки для регулировки клинка подъемника в правильное положение. На слайде.
После того, как лифтеры были установлены, но до добавления буфера для гибридизации, мы добавляем 20 микролитров 100 миллимолярных дихи, три атола в колодцы влажности, расположенные в торцах камеры. Теперь мы готовы добавить целевые CDNA, которые были ресуспендированы в буфере гибридизации. Наконечник пипетки помещается на край шлифовки подъемника, а предметное стекло и раствор медленно пипетируются.
Мы обнаружили, что использование капиллярного эффекта для загрузки массивов обеспечивает наибольшую согласованность и значительно снижает количество нежелательных пузырьков. После того, как целевой материал был добавлен в массив, камера гибридизации собирается и накрывается алюминиевой фольгой. Затем гибридизационную камеру помещают в водяную баню для ночной инкубации, обычно от 14 до 16 часов.
Водяная баня установлена на 48 градусов, а шейкер — на 50 оборотов в минуту. Важно также отметить, что с момента добавления гибридизационного раствора на всех постгибридизационных промывках, процедуры проводятся при слабом освещении для предотвращения фотоокисления. На следующий день предметные стекла вынимают из камеры гибридизации и помещают в банку Copeland, содержащую промывочный раствор номер один, который был предварительно нагрет до 53 градусов.
Предметные стекла остаются в банке Коупленда примерно на минуту до тех пор, пока слипы подъемника не отпадут, после чего предметные стекла аккуратно удаляются щипцами и помещаются в держатель предметного стекла для микроскопа для продолжения промывки. Затем предметные стекла энергично погружают примерно от 15 до 20 раз во второй контейнер, также содержащий моющий раствор номер один при температуре 53 градуса. Затем контейнер накрывают отдушкой и помещают в воздушный шейкер инкубатора, установленный на 53 градуса и сто оборотов в минуту.
После 10-минутной инкубации и промывочного раствора, номер один, предметные стекла энергично погружают от 15 до 20 раз в контейнер с моющим раствором номер два, который находится при комнатной температуре контейнера. Его накрывают пара-пленкой и снова помещают в шейкер при комнатной температуре для 10-минутной инкубации. Наконец, предметные стекла вынимают из промывочного раствора No два и энергично погружают от 15 до 20 раз в емкость с моющим раствором No три.
Затем горки убирают во вторую емкость с моющим раствором номер три, покрывают перфилом и снова помещают на шейкер на 10 минут. После окончательной промывки центрифугируем предметные стекла до полного высыхания. Для этого мы помещаем колпачок Falcon 15 мил в коническую трубку 50 мил, а штрих-код матрицы помещаем вниз в коническую трубку.
Затем трубки вращаются в качающейся головке ведра со скоростью 1500 об/мин при комнатной температуре. После центрифугирования предметные стекла удаляются во второй комплект конических трубок диаметром 50 мил, которые были покрыты алюминиевой фольгой. Затем трубки продуваются газообразным азотом, который фильтруется через фильтр 0,22 микрона и крышку для транспортировки или хранения до сканирования.
Мы собираем данные сканирования на матрице сканирования PerkinElmer 5 000. Изображение массива разбивается на сетку, необработанные данные сканирования обрабатываются, а первоначальный анализ данных выполняется с помощью программного обеспечения для визуализации bio discovery. Затем данные об интенсивности точечного сигнала нормализуются по мере выполнения статистического анализа с помощью инструментов BRB Array, надежного и свободно доступного статистического пакета микрочипов, который можно загрузить в Национальном институте рака.
Другой статистический анализ и поиск шаблонов экспрессии генов выполняются с помощью набора шаблонов экспрессии и анализа генов Jeep PPA. Еще один свободно доступный пакет веб-анализа. Благодарим вас за просмотр нашего видео о том, как обрабатывать микрочип lob lolly pine PT Gen two.
Следующие лица отвечали за содержание и производство этого учебного видео.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен cDNA микрочип PtGen2, разработанный для исследований экспрессии генов в лоблолийной сосне и других видах хвойных. В ней описываются методы обработки до и после гибридизации и техники промывания для повышения согласованности и уменьшения артефактов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Анализ экспрессии генов
- Технология микрочипов
- Биология растений
Предисловие
- cDNA микрочипы необходимы для изучения экспрессии генов.
- PtGen2 специально разработан для лоблолийной сосны и хвойных.
- Правильные методы обработки важны для получения надежных результатов.
- Высокий содержание соли в буфере для нанесения требует предварительного промывания.
Цель исследования
- Улучшить согласованность данных по экспрессии генов.
- Снизить фоновый шум в результатах микрочипов.
- Предоставить стандартизированный протокол для исследователей.
Использованные методы
- Предварительное промывание для удаления соли из буфера нанесения.
- Строгие методы промывания после гибридизации.
- Сравнение с протоколами известных исследовательских центров.
- Оценка качества сигнала и уровней фона.
Основные результаты
- Наблюдалась улучшенная согласованность качества сигнала.
- С помадой техник достигнуты более низкие уровни фона.
- Эффективность протоколов была продемонстрирована в нескольких экспериментах.
- Были предоставлены рекомендации для будущих исследований.
Выводы
- Улучшенные методы обработки и промывания важны для успеха микрочипов.
- Стандартизированные протоколы могут привести к более надежным данным по экспрессии генов.
- Будущие исследования могут строиться на этих результатах для получения лучших результатов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key challenge in plant genomics: achieving reproducible microarray data despite high-salt spotting buffers that can introduce artifacts. By standardizing pre- and post-hybridization washing steps, the method enhances data consistency and reduces background noise, supporting reliable gene expression profiling in conifer species. This contributes to target validation efforts in forestry biotechnology by enabling clearer detection of differentially expressed genes under experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses in conifer tissues, supporting hypothesis testing in stress or developmental pathways.
- Operational Value: Reduces technical variability from salt artifacts, improving confidence in target identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, low-background microarray slides suitable for reproducible hybridization across experimental groups.
- Operational Value: Establishes a robust slide preparation workflow that enhances assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by providing reliable expression profiles from pine tissues, useful in studying environmental adaptation or wood formation.
- Operational Value: Facilitates cross-study comparability through consistent slide processing, aiding translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology workflow, specifically supporting reliable target profiling in non-model plant systems where genetic tools are limited.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven expression analysis in loblolly pine, clarifying gene responses in root, needle, and stem tissues.
- Screening: Delivers microarray slides with uniform signal quality, enabling reliable comparative screening of gene expression under varying conditions.
- Analytics: Generates clean, normalized signal intensity data compatible with downstream tools like BRB Array Tools and JePPAs for statistical analysis.
- Translational Research: Supports continuity from gene discovery to functional validation by providing trustworthy expression baselines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable slide preparation protocol that can be applied across multiple conifer species and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in gene expression measurements by minimizing salt- and SDS-derived artifacts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across slides and laboratories through defined washing and handling steps.
- Strategic Value: Reduces risk of false positives/negatives in expression profiling, supporting better go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes based on cleaner, more reliable expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling and hybridization techniques.
- Needs access to temperature-controlled water baths, incubators, and centrifuges for slide processing.
- Demands standardized reagents including SDS, SSC, BSA, and isopropanol for washing and dehydration.
- Requires adaptation of humidity control and hybridization timing based on target RNA source and labeling method.
- Practical limitation: High-salt spotting buffer necessitates rigorous pre-washing; incomplete salt removal may persist if steps are shortened.
