Сотовые Электромуфтовая Визуализированные с флуоресцентной микроскопии
1 июля 2010 г.
В этом видео мы продемонстрирована высокая эффективность электромуфтовой клеток В пробирке С помощью модифицированного метода с помощью соблюдения электропорации и последующего обнаружения плавленого визуализации клеток с флуоресцентной микроскопии.
Электротермоядерный синтез включает в себя подачу коротких высоковольтных электрических импульсов на клетки в тесном контексте. В этом видео мы демонстрируем электрослияние клеток in vitro с помощью модифицированного метода Adherence.Method. Эксперименты проводились на клетках меланомы мышей, BF one.
Для проведения эксперимента выполните следующие действия. Выращивайте клетки в двух отдельных колбах для культур до 80% конфлюенции. Отдельно добавьте по 2,1 микролитра каждого стокового раствора.
10 миллимолярных C-M-F-D-A или CMRA соответственно на три миллилитра буфера Кребса Гесса в центрифужной пробирке. Дважды промойте ячейки буфером Кребса Гесса, а затем введите в колбы загрузочные растворы. Нагрузочные решения содержат примерно семь микромоляров C-M-F-D-A или CMRA соответственно.
Инкубируйте клетки в течение 30 минут в контролируемой атмосфере. Во время этой первой инкубации участки свободно проходят через клеточные мембраны в цитозоль, где они превращаются в продукты реакции мембранного ИМП. После такой первой инкубации промойте и затем инкубируйте клетки с питательной средой еще два часа.
Клетки наблюдаются с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного охлаждаемой ПЗС-камерой в программном обеспечении для сбора данных. Установите длину волны возбуждения равной 548 нанометрам и выберите подходящее изображение угрозы флуоресценции полосового фильтра ячеек, загруженных CMRA, для ячеек, загруженных C-M-F-D-A. Установите длину волны возбуждения на 492 нанометра и выберите полосовой фильтр для зеленого флуоресцентного изображения трипсиновых глаз, а также подсчитайте клетки в обеих колбах и смешайте красные и зеленые клетки вместе в соотношении один к одному, отрегулируйте концентрацию клеток до 5 миллионов клеток на миллилитр.
Поместите каплю клеточной суспензии объемом 20 микролитров в середину каждой лунки. В 24-луночной многолуночной пластине инкубируют клетки в контролируемой атмосфере в течение 20 минут, чтобы клетки могли слегка прикрепиться к поверхности лунки монослоем и установить клеточные контакты между собой. Поместите мультилунку с клетками на предметный столик микроскопа.
Расположите электроды на дне лунки и подключите их к генератору импульсов Для достижения оптимального электроядерного синтеза и поддержания жизнеспособности ячейки следует использовать соответствующие параметры электрических импульсов. Эти параметры зависят от клеточной линии и должны быть определены в предварительных экспериментах. Удалите питательную среду и промойте клетки одним миллилитром ISO omu potassium phosphate buffer в дозе 350 микролитров гипо калий-фосфатного буфера Миллера, чтобы вызвать отек клеток.
Оставьте клетки в гиперосмальном буфере на две минуты перед применением электрических импульсов. Электрические импульсы следует применять, когда ячейки близки к их максимальному объему. То есть до того, как они начнут нормативный объем.
Снижение в нашем эксперименте. Была применена последовательность из восьми прямоугольных импульсов длительностью 100 микросекунд с частотой в один герц. После пульсовой доставки.
Оставьте клетки в покое на 10 минут после 10 минут. Выход диффузии определяется с помощью контраста лица и флуоресцентного микроскопа. E получают три изображения, контраст лица, красную и зеленую флуоресценцию в пяти случайно выбранных полях зрения.
В каждом из них необходимо создать трехканальные изображения из каждого триплета изображений в программном обеспечении image J для улучшения визуального качества изображений для предварительной обработки, которые могут быть применены к исходным изображениям, улучшения фона, вычитания и контраста с наборами параметров по умолчанию. Наконец, изображения трех каналов компонуются с помощью плагина J RGB to gray image. На таком изображении можно увидеть покоящиеся цитоплазму вместе с клеточными мембранами.
Таким образом, немногие клетки могут быть легко идентифицированы в трехканальном подсчете изображений всех трех типов клеток: красных, зеленых и двойных флуоресцентных. Определите процент двойных флуоресцентных клеток, разделив количество двойных флуоресцентных клеток на количество всех клеток на каждом изображении. Выход термоядерного синтеза определяется как процент двойных флуоресцентных клеток, умноженный на два.
Так как половина ячеек представления не обнаруживается при просмотре ячеек одного цвета.
Обзор
В этом видео показано эффективное электрослияние клеток in vitro с использованием модифицированного метода адгезии в сочетании с электропорацией. Процесс включает обнаружение слившихся клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Техники слияние клеток
- Методы электропорации
- Применение флуоресцентной микроскопии
Бэкграунд
- Электрослияние - это техника, применяющая электрические импульсы для стимулирования слияния клеток.
- Метод может повысить эффективность создания гибридных клеток.
- Флуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать слившиеся клетки.
- Понимание слияния клеток имеет важное значение для различных биологических приложений.
Цель исследования
- Продемонстрировать надежный метод электрослияния клеток.
- Визуализировать и количественно оценить эффективность слияния клеток.
- Предоставить протокол, который может быть воспроизведен в других лабораториях.
Используемые методы
- Культивировались и подготовились к слиянию клетки меланомы мыши.
- Для маркировки клеток перед слиянием использовались флуоресцентные красители.
- Применялись электрические импульсы для индукции слияния клеток.
- Для анализа результатов слияния использовалась флуоресцентная микроскопия.
Основные результаты
- Успешное слияние клеток было достигнуто, что было показано флуоресценцией.
- Процент двойно флуоресцентных клеток был рассчитан для определения дохода слияния.
- Были определены оптимальные параметры электрического импульса для жизнеспособности клеток.
- Визуальное качество изображений было улучшено с помощью техник обработки изображений.
Выводы
- Модифицированный метод адгезии эффективен для электрослияния клеток.
- Флуоресцентная микроскопия является ценным инструментом для оценки эффективности слияния.
- Этот протокол может быть адаптирован для различных типов клеток в исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
