Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

Здравствуйте, меня зовут Эна, и мы регулярно проводим профилирование экспрессии генов в лаборатории. И мы используем этот метод для мониторинга дифференциальных регулируемых генов между метамфетамином и диким типом. И сегодня у меня есть образцы РНК дикого типа и метамфетамина, и мы все сначала делаем C.

Мы используем методы косвенной маркировки, и преимущество этой методики заключается в предотвращении предвзятости взгляда, которая может возникнуть при прямой маркировке. И для этого у нас есть образцы РНК, и мы выбираем три микрограмма РНК на 13 микролитров от общего объема. И мы добавляем 2,5 микро случайного he в наших парках.

И мы будем инкубировать образец при семи пяти градусах, чтобы иметь природу РНК в течение восьми минут. И теперь мы добавим, мы добавим коктейль обратной транскрипции, который содержит непрерывную смесь AM L-D-L-D-U-T-P, буфер обратной транскриптазы, а также ET TT Big it down И инкубируем образец при температуре 42 градуса в течение четырех часов. Итак, через четыре часа мы просто вынимаем образцы.

И теперь в пробирке у нас есть смесь CDNA и RNA. И что мы хотим сделать, так это сделать гидроксную РНК, добавив гидроксид натрия и ЭДТА, и конечная концентрация гидроксида натрия должна быть сто моляров. А конечная концентрация для e BT должна быть равна пяти молярам.

А теперь будем инкубировать образцы на водяной бане при температуре 65 градусов в течение 10 минут. Итак, инкубация завершена, и мы используем образцы, добавляя pH семи куч в одну воду до конечной концентрации 500 моляров. На этом этапе вы можете сохранить образцы при значении минус 20 или продолжить очистку.

Для очистки CDNA мы используем набор для очистки ПЦР KaiGen. Однако, поскольку буфер Буша и ионный буфер содержат высвобождение, мы этого не делаем, мы готовим наш собственный буфер куста и ионный буфер судьбы, и вы добавляете 300 литров PPI, и мы медленно спускаем этот пруд к вам, переливаем смесь в колонны, и вы будете вращаться в течение одной минуты с максимальной скоростью. буфер, который мы подготовили. Фосфатный буфер для промывки, вы добавите 750 микролитров и около того, и вы добавите еще один For one снова.

Так что мы снова покрутимся, чтобы убедиться, что у нас все спальные места. И мы переложим эти трубки в пустые трубки нарушителя. И я добавлю 30 маркеров фофосфата Е, который представляет собой четыре четыре моляра фосфата калия при pH 8,5.

И здесь вам просто нужно убедиться, что вы складываете все в центр колонны, и вы будете инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты. Так что он снова будет вращаться в течение одной минуты, и я добавлю еще один буфер 30 микронуля, который я инкубирую или в спальне. Итак, я убираю колонку и у нас получается общий объем 60 микро или CDA.

Как только мы очистим CDNA, вы сможете, вы можете хранить его при температуре минус 20 градусов, и мы также можем высушить его, а затем сохранить его, чтобы мы могли высушить CDNA в обратной связи. Итак, теперь в тюбике у нас есть сухой CDA, который я модифицирую. И что мы сделаем, так это подвешиваем сухой образец.

Я буду суспендировать образец в 10 туре 15 ЛАР бикарбоната при pH 9. И я просто буду делать это, двигаясь вверх и вниз на этом этапе, это очень важно для Resus кДНК. Ну а для того, чтобы покупка корпорации реакция работала, эта реакция должна происходить в темной комнате, потому что флуоресцентные метки чувствительны к кристаллу.

Тем не менее, выбирая их из медико-биологических наук, они поставлялись в индивидуальных упаковках. S five имеет фиолетовый колпачок, а сторона три имеет оранжевый колпачок, а также S 5 появляется Сион, когда его подвешивают, а Кэри кажется пурпурным. Итак, что я делаю в темной комнате, так это переношу эти образцы в пробирки с красителем, снова суспендирую краситель и переношу их обратно в пробирку, которая у меня есть.

А затем я инкубирую в темноте два часа, после этого инкубация останавливает реакцию, добавляя 35 re из ста миллимолярных ацетатов натрия при pH 5,2. И после этого мы провели уборку с помощью аналогичной процедуры очистки. Однако на этот раз мы используем буфер для стирки и буфер для элюирования, предоставленный Cajun.

Вы можете описать места, в которые вы помещаете образец и которые должны очищать инструмент. Итак, вы можете использовать свой образец или свою смесь прямо сейчас I To, Итак, это мой образец с научно-фантастической маркировкой, и здесь мы видим OD два 60, который показывает содержание CDA, и OD шесть 50, который показывает включение D для научной фантастики. А вот мой образец этикетки с третьей стороны.

Опять же, скрутите шесть концентраций и пять 50 мер сайта три включения. Так как моя корпорация D работает эффективно, я ненадолго объединим сэмплы. А теперь мы снова напишем пример с использованием обратной связи.

Итак, для создания горки, мы восстановим водный баланс, поместив горку на воду, и это увеличит количество пятен. И затем, чтобы защитить это, мы просто высушиваем при температуре в сто градусов по Цельсию, а затем проводим УФ-гибридизацию или УФ-сшивание пятен в предметное стекло, а затем инкубируем в буфере с предварительным верхом, который у нас есть. Поэтому я кладу горку лицевой стороной вниз, но она еще не касается воды.

И мы будем ждать так минут пять. I, Итак, эта коробка выглядит больше, они должны быть более блестящими, чем до того, как вы положите, и вы просто высохнете, поставив предметное стекло на сто градусов, и вы заметите конденсацию. И мы свяжемся с вами.

Так что для увлажнения я просто окуну горку в довоенную воду. И это должно быть действительно быстро, потому что цель здесь заключается в том, что вы хотите избавиться от всех пятен или всех олигон на месте, которое не связано. И если вы будете медлить в этом процессе, вы просто получите хвосты на своих местах.

Так что просто убедитесь, что вы действительно делаете это быстро, и убедитесь, что вы не вынимаете свой рейс из воды и не делаете это в течение 30 секунд и просто немедленно фукаете при комнатной температуре в течение пяти минут и 700 часов в воздух Получите это, мы помещаем это слайд в буфер довоенной трубной станции, который у нас был. И медленно проталкиваем слайд в банку, и мы будем инкубировать его при температуре 42 градуса в течение не менее 45 минут. Итак, у нас есть наш высушенный образец для гибридизации. Итак, сначала мы подвешиваем Ресус в воде.

На этом шаге мы просто приостанавливаем действие, двигаясь вверх и вниз, и, возможно, не подвергаем образец слишком белому или белому. А затем вы добавляете ДНК чьей-то спермы 1,5 и концентрацию 10 миллиграмм на мил. И вы добавите 1,2 маркетолога TRNA.

Концентрация составляет 12,5 мг на единицу, мы добавляем тРНК и ДНК сперматозоидов для блокирования неспецифических гидро. И прибавляем 5,35 маркера ноль три XSSC, что дает итоговую концентрацию трех x. И напоследок добавляем 3,5 микролитра 1% SDS.

Теперь мы будем кипятить смесь в течение пяти минут, и мы будем вращать на максимальной скорости в течение пяти минут, и она будет готова к этому. Прошел час с тех пор, как мы инкубировали нашу горку, и сейчас у меня есть вода и изопропанол. Поэтому я сначала взбалтываю предметное стекло в воде, чтобы избавиться от SDS, а затем промою ваш dza propanol и сразу поставлю его в стандартный калибр.

И здесь просто будьте осторожны, чтобы не подвергать свет слишком сильному воздействию воздуха, чтобы предотвратить высыхание. Поэтому я иду прямо от буфера вредной станции в воду И мы моем горку. Пару минут, только следите за тем, чтобы движение было только вверх и вниз, а не в сторону.

А также следите за тем, чтобы горка не находилась над водой и мы сразу переведем ее в изопропанол. И он просто остается здесь снова на пару минут. И не могла бы ваша страница Пожалуйста, ответить на вашу страницу при комнатной температуре в течение пяти минут?

700 Р.Охлаждаемый. Таким образом, наша горка также готова к гибридизации, и лучше, если вы будете хранить ее в слайд-боксе, чтобы защитить ее от автобуса. Поэтому для уборочной станции мы будем использовать подъемник или слип.

На покровном слипе есть белые полосы, и они обеспечат некоторый подъем, и они предоставят некоторое пространство для нашего образца, чтобы пройти между покровным слипом и слайдом. И я очищаю его этанолом, а потом кладу проволоку вниз И просто убеждаюсь, что там нет тестовой частицы. Итак, сначала мы возьмем слайд нашего шаблона, на котором у нас отмечена область печати, а поверх него мы поместим слайд, который мы подготовили, и убедимся, что они идеально выровнены.

Убедитесь, что они идеально совпадают. И нужно убедиться, что полоски находятся сбоку, что мы собираемся облицовывать ее вниз. Так что это действительно трудно увидеть, но убедитесь, что вы можете это увидеть.

А полоски должны быть по бокам горок. И мы будем загружать наш образец с боков. Я беру небольшое количество пробы, поэтому сначала беру 15 микролитров и начинаю загрузку с угла крышки.

И я медленно втягиваю его и просто двигаюсь по краю, чтобы покрыть всю площадь. На этом этапе очень важно не вводить пузыри, и я беру еще 15 миграторов и наношу его на сторону слайдов, чтобы предотвратить высыхание. Итак, наш образец готов, и вы будете инкубировать наши предметные стекла и камеры приоритизации, которые имеют микроканалы для увлажнения предметного стекла во время его гибридизации.

И мы добавим 10 маркетологов из трех XSSC в шесть углов слайда. Было шесть мест на, на камере, извините, на каждом углу I, и с каждой стороны, убедитесь, что вы перекладываете затвор очень аккуратно, чтобы крышка не соскользнула. И когда вы положите предметное стекло правой стороной вверх, вы увидите, что оно будет складываться, оно прилипнет к воде, которую вы положили и наклеили крышку, и убедитесь, что винты затянуты.

Мы будем инкубировать переговорную камеру при температуре 65 градусов по Цельсию, но мы не хотим класть ее прямо на дно. Поэтому мы просто ставим какой-то пластиковый барьер, чтобы предотвратить избыток теплоотдачи. И мы размещаем нашу камеру аккуратно и, чтобы предотвратить смещение, вы также можете добавить какой-либо груз.

И эта инкубация длится всю ночь, обычно от 10 до 12 часов. Поэтому для промывки ломтика мы используем один XSSC с 0,05% SDS. Это будет сделано для снятия крышки.

И это будет первый шаг для стирки. И мы сделаем еще два шага только с 0,06% шести XSC через все SDS, которые у нас есть. Так что мы все закручиваем разговор, берем слайды и кладем их лицевой стороной вниз в контейнер для кошелька.

И мы просто будем трясти его из стороны в сторону, и мы увидим, что чехол будет мягко отваливаться. Хорошо, и, и мы просто переложим в другой буфер для стирки, который содержит XES. Вы можете помолчать минуту.

Перейдем к шести XSSC. И чтобы убедиться, что мы избавились от всех FDS, мы повторим это еще раз. Центрифуга для сушки находилась при комнатной температуре в течение пяти минут при 700 оборотах. Вы храните этот предметный предмет в коробке слайдов, потому что он чувствителен к свету.

Итак, это сканер слайдов, и вы поместите слайд сюда, немного места прямо здесь, поместите слайд лицевой стороной вниз, помеченный в сторону и, и на втором слайде вы просто определите область, которую хотите отсканировать. И вы просто возьмете эту область на наших слайдах. У нас есть, мы используем 16 пинов для печати наших слайдов.

Таким образом, каждый блок соответствует одной кегле, а наши горки содержат более 8 000 точек. И мы представляем геном цвета vi дважды, потому что это около 4000 генов. Таким образом, у нас есть по два пятна на каждое олиго, которое мы используем.

И если увеличить масштаб, вы можете увидеть в этом конкретном эксперименте, мы сравниваем мутантов регулятора транскрипции с диким типом, и мутант будет помечен научной фантастикой, что дает красный цвет. А диким типом был участок три, который дает зеленый цвет. Таким образом, все, что кажется красным, как эти пятна, указывает на то, что обилие транскриптов у мутанта было выше, чем у дикого типа.

Таким образом, они кажутся красными или оттенками красного, а все, что кажется зеленым, указывает на то, что распространенность транскрипта была выше у дикого типа по сравнению с мутантным. И любое пятно, которое кажется желтым, указывает на то, что этот транскрипт в равной степени присутствовал как у мутантного, так и у дикого типа. Поэтому, когда они накладываются, они будут казаться желтыми, как эти но.