Подготовка и трансформация бактерий с помощью высоковольтной электропорации

Начните с пробирки, содержащей бактерии, инокулированные в питательную среду.

Инкубируйте с встряхиванием до тех пор, пока клетки не достигнут активной фазы деления.

Центрифугой соберите клетки и выбросьте надосадочную жидкость.

Многократно промойте клетки ледяным глицерином, чтобы удалить соли, и ресуспендируйте в глицерине для поддержания жизнеспособности клеток.

Приготовьте плазмиду, содержащую ген устойчивости к антибиотикам, в стерильной воде с помощью ЭДТА для предотвращения деградации ДНК.

Смешайте раствор плазмиды с бактериальными клетками.

Подайте короткий импульс высокого напряжения, чтобы временно создать поры в бактериальной мембране.

Это позволяет плазмидной ДНК проникать в цитоплазму.

Немедленно переведите клетки в восстановительную среду и инкубируйте с встряхиванием.

Компоненты среды поддерживают репарацию мембран и экспрессию генов устойчивости к антибиотикам, кодируемых плазмидами.

Распределите клетки на питательный агар, содержащий антибиотик, и инкубируйте до образования колоний.

Выберите одну колонию и выложите ее на свежую тарелку, чтобы очистить трансформеры.

Чтобы начать эксперимент, подготовьте электрокомпетентные клетки топ-10 штамма E. coli .

Переведите одну колонию в