Подготовка и трансформация бактерий с помощью высоковольтной электропорации

Начните с пробирки, содержащей бактерии, инокулированные в питательную среду.

Инкубируйте с встряхиванием до тех пор, пока клетки не достигнут активной фазы деления.

Центрифугой соберите клетки и выбросьте надосадочную жидкость.

Многократно промойте клетки ледяным глицерином, чтобы удалить соли, и ресуспендируйте в глицерине для поддержания жизнеспособности клеток.

Приготовьте плазмиду, содержащую ген устойчивости к антибиотикам, в стерильной воде с помощью ЭДТА для предотвращения деградации ДНК.

Смешайте раствор плазмиды с бактериальными клетками.

Подайте короткий импульс высокого напряжения, чтобы временно создать поры в бактериальной мембране.

Это позволяет плазмидной ДНК проникать в цитоплазму.

Немедленно переведите клетки в восстановительную среду и инкубируйте с встряхиванием.

Компоненты среды поддерживают репарацию мембран и экспрессию генов устойчивости к антибиотикам, кодируемых плазмидами.

Распределите клетки на питательный агар, содержащий антибиотик, и инкубируйте до образования колоний.

Выберите одну колонию и выложите ее на свежую тарелку, чтобы очистить трансформеры.

Чтобы начать эксперимент, подготовьте электрокомпетентные клетки топ-10 штамма E. coli .

Переведите одну колонию в один миллилитр LB среды. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 180 об/мин. Разведите предкультуру от одного до 500 в 25 миллилитрах свежей среды LB и инкубируйте культуру при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока она не достигнет логарифмической фазы 0,6 OD. Центрифугируйте суспензию элемента при 5 000 об/мин в течение 20 минут.

После центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 25 миллилитров 10% объема на объем, ледяную, стерильную глицериновую воду, и повторите этот шаг четыре раза, каждый раз сохраняя объем ресуспензии до тех пор, пока не будет достигнуто 1,5 миллилитров.

Далее суспендируйте гранулу в 10% глицерине и разделите клеточную суспензию на 50 микролитров аликвот. Храните аликвоты при температуре минус 80 градусов Цельсия до шести месяцев. Чтобы продолжить эксперимент, растворите нужную плазмиду в стерильной воде с добавлением 0,5 миллимолярной ЭДТА, и разморозьте аликвоту электрокомпетентных клеток на льду.

Добавьте от 2,5 до 5 нанограммов вектора и перемешайте размороженные клетки. Распределите ячейки в кювету диаметром 0,1 сантиметра. Подайте на ячейки импульс мощностью 1,8 киловольта и немедленно переведите электропорированные ячейки в один миллилитр среды SOC.

Инкубируйте клетки во время встряхивания в течение часа, переложите 100 микролитров аликвот в чашки Петри, содержащие LB-агар и антибиотик, и инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Очистите трансформанты, нанеся полосы на отдельные колонии на чашки Петри.