Методы Patch Clamp Емкость записи из Чашечка

Здравствуйте, меня зовут Кен Парадизо. Я работаю на Линг Ган Ву в Национальном институте неврологических расстройств и программы по лечению инсульта, который расположен в NIH в кампусе Бетесда. Я собираюсь показать вам технику проведения пресинаптической записи Patch clamping.

Итак, чтобы подготовить мозговую ткань, мы удаляем мозг у крысы. Мы помещаем мозг внутрь этого раствора, который будет ледяным раствором с низким содержанием кальция, и он будет пузыриться карбогеном, чтобы обеспечить постоянное снабжение мозга кислородом. И он также должен быть ледяным, чтобы свести к минимуму DA и свести к минимуму количество повреждений.

Таким образом, мозг теперь будет находиться в этом растворе. Мы вынимаем его, разрезаем соответствующим образом, чтобы его можно было положить на блок, устанавливаем на блок с помощью коррелята Sano или сумасшедшего клея, но затем заполняем камеру ледяным раствором с низким содержанием кальция, пузырчат его, помещаем на вибратор, а затем нарезаем ломтики толщиной от 180 до 190 микрон с частотой лезвия 70 герц и скоростью вперед от 0,01 до 0,02 миллиметра на дюйм секунда. Это будет от 10 до 20 микрон в секунду.

После того, как каждый ломтик сделан, мы переносим ломтики из ледяного солевого раствора в эту камеру, которая содержит обычный раствор кальция. Это тот же раствор, который мы регистрируем, и он находится при физиологической температуре 37 градусов. Затем мы кладем сюда ломтики для восстановления.

Он остается здесь от получаса до часа перед проведением физиологических экспериментов. Итак, у меня есть мозг, и я собираюсь вытащить его из раствора. Так что это больший мозг для демонстрационных целей.

Это от крысы P 20. Мы его перевернем. Нас интересует ствол мозга.

Итак, вот эта область внизу, и чашечка удержалась, находится примерно в той области, вот там. Итак, что мы собираемся сделать: отрезать остальную часть мозга, изолировать ствол мозга, а затем подготовить ствол мозга для камеры для среза. Итак, мы собираемся отрезать остальную часть мозга, просто изолировав ствол мозга.

Я собираюсь перевернуть его, чтобы показать, где мы находимся. Обычно мы бы так не делали, и опять же, мы можем просто избавиться от всей этой части. Перевернув его обратно, мы изолировали ствол мозга и просто делаем еще один разрез прямо там.

Ладно, вот и все. Это ствол мозга. Calyx of held находится примерно там и там.

Это ствол мозга. Опять же, мы немного отодвинем его назад. Мы отрежем одну сторону мозжечка, и это позволит стволу мозга сидеть боком вот так.

Мы добавляем немного акрилового клея Sano и, держа его в горизонтальном положении, быстро заполняем холодным льдом, холодным раствором с низким содержанием кальция. Подключите кислородную линию как можно скорее. Теперь мы поднимаем его и переносим на вибрато.

Мы быстро вводим его, чтобы добраться до начала мозга, а затем, как только мы доходим до начала мозга, мы снижаем скорость до 0,01 миллиметра в секунду. Так что это 10 микро в секунду. Так что он движется невероятно медленными темпами.

Первая часть мозга – это часть, в которой находится горный велосипед, который является медиальным Нилсом трапециевидного тела. И это та часть, которая содержит, итак, как только я помещаю ее в переводную пипетку, я стараюсь поднести ее как можно ближе к кончику пипетки. И вот срез мозга, и я довольно быстро переношу его в эту камеру, которая содержит стандартный раствор для записи, который имеет нормальный уровень кальция и более высокую температуру.

И это позволит срезам восстановиться после процедур нарезки, к которым они готовы в результате физиологических экспериментов. Итак, с этого момента будет одно и то же, снова и снова. Следующее оборудование - это то, что я буду использовать для зажима пластыря.

У нас есть вертикальный микроскоп с неподвижным столиком. Предметный столик закреплен, как я уже сказал, поэтому микроскоп перемещается под ним с помощью манипулятора. Мы используем парики и микроманипулятор Newman для удержания сцены, головной каскад усилителя, мы используем усилитель EPC 10 patch clamp от heca.

И что я также должен был упомянуть, так это то, что мы используем DIC с инфракрасным светом. Итак, у нас есть ИК-камера, и все, что мы видим, будет видно на экране, когда мы ищем CAE. Усилитель патч-зажима управляется этим программным обеспечением, которое называется Pulse, которое также от Heca, и будет управлять усилителем и всем физиологическим экспериментом.

Результаты появятся на этом экране. Caly have hold — это большая пресинаптическая клемма, и поскольку она большая, она позволяет нам физически подключаться к терминалу. Так что мы можем делать пресинаптические записи, и это своего рода уникальная вещь, особенно в ЦНС.

Таким образом, это позволяет нам измерить кальциевые каналы, активированные пресинаптическим путем. Кроме того, мы можем измерить потенциальную активность действия, если хотим стимулировать нерв, ведущий к чашечке. В этой лаборатории мы измеряем процесс, называемый экзоцитозом, который представляет собой слияние везикул, содержащих нейромедиатор, с мембраной.

В этих везикулах сливаются с мембраной в процессе, называемом экзоцитозом, они добавляют мембрану к синаптическому окончанию, и мы можем измерить это как изменение емкости. Мы получим увеличение емкости по мере добавления мембраны к терминалу, так что эксперименты, которые я покажу сегодня, являются измерениями емкости, пресинаптически при удалении мембраны. Так что вы не можете просто продолжать добавлять мембрану, вам, конечно, придется удалить некоторую часть.

Этот процесс называется эндоцитозом или захватом мембраны. Мы также можем измерить это, и это будет измеряться как снижение уровня емкости, и мы покажем примеры этого позже. Теперь это позволяет нам контролировать активность кальциевых каналов, а также контролировать некоторые белки, участвующие в экзоцитозе и эндоцитозе, и изучать их.

Мы можем вводить такие вещи, как пептиды, чтобы блокировать белки, которые участвуют в экзо или эндоцитозе. Мы также можем использовать токсины, которые делают то же самое. Мы также можем регулировать количество кальция, поступающего в терминаль, так что мы можем действительно изучить процесс экзоцитоза, высвобождение нейромедиатора, а также поглощение мембраны, которое следует за этим событием.

Это трубка, содержащая наше решение для внутриклеточной записи. Мы готовим его заранее, а затем замораживаем и обычно можем использовать от нескольких недель до месяца, прежде чем нам придется делать новый раствор. Опять же, мы думали непосредственно перед тем, как делать наши записи, и вы всегда будете получать определенное количество частиц пыли или другого мусора, которые попадут в вашу трубку.

Вы можете сделать одно из двух. Вы можете либо вынуть раствор и отфильтровать его, либо покрутить его в течение минуты или двух, а затем вытащить раствор, оставив нижнюю часть, в которой будет мусор и другие материалы. Так что я предпочитаю крутить его, и я сделаю это прямо сейчас.

Итак, это трубка, содержащая наш внутриклеточный раствор. Он оттаял. Мы собираемся раскрутить его в течение двух-трех минут в маленькой крошечной центрифуге, и этого должно быть достаточно, чтобы удалить любые крупные частицы пыли из раствора.

Итак, теперь я просто снимаю верхушку, раствор, который мы только что раскрутили, стараясь не перемешать его, перекладываю его в чистую пробирку, и я удаляю около 90% его. Я стараюсь больше этого не делать, получаю этот последний кусочек. Так что на этом я остановлюсь.

Я сразу же положил его на лед, чтобы он оставался приятным и холодным во время эксперимента. Это очень важно. Вот это, это одна из наших пипеток.

Мы используем это для внутриклеточных записей. Это толстостенное кварцевое стекло с отверстием, внешний диаметр два миллиметра, внутренний диаметр 1,16 миллиметра. Во-первых, мы заполняем пипетку.

Итак, мы применяем всасывание, помещаем пипетку в записывающий раствор и применяем всасывание, чтобы попытаться заполнить самый-самый кончик пипетки, который в противном случае не заполнится никаким другим способом. Как только мы это сделаем, мы возьмем капиллярную трубку и заполним оставшуюся часть электрода, заняв заднюю часть пипетки. Это стандартная техника физиологии и буквально щелкать ею.

Вы рискуете сломать конец пипетки, но если вы этого не сделаете, у вас также будут пузырьки воздуха. Итак, теперь мы поместили его на держатель для пипетки, который подключен к нашему головному каскаду усилителя патч-установки. Там есть проволока из хлорида серебра.

Провод хлорида серебра вступает в контакт с внутриклеточным раствором, и это позволяет нам измерять электрическую активность в пресинаптическом терминале. Итак, что мы делаем, так это находим срез, в котором много CAE. Мы хотим иметь высокую плотность CAE.

Итак, мы ищем медиальное ядро трапециевидного тела, которое является MNTB, и именно там находится окончание, которое формирует поддерживаемую чашечку, или которое является приложением calyx. Итак, что мы делаем, так это начинаем сканировать срез. Так, например, у нас есть чашечка, которая находится немного глубоко от поверхности, и на нее не так много лап, которую можно было бы наклеить, поэтому мы просто продолжаем сканировать по всему нам.

Итак, это чашечка, которую мы ищем. Я сделал две отметки на экране, где будет находиться пипетка. И вы можете видеть, что есть кусочек чашечки, который я собираюсь использовать после пипетки, которая будет опускаться.

Я собираюсь приложить положительное давление, чтобы он прижимался к чашечке, а затем я собираюсь ослабить положительное давление. Затем чашечка будет прижиматься к пипетке, и в этот момент я применяю очень мягкое всасывание и пытаюсь всасывать и давить на мембрану или заставить мембрану прилегать к кончику пипетки. Ладно, снизился позитивный нагрузка.

И теперь я собираюсь применить отсасывание. Итак, здесь мы за, мы применяем пятимилливольтный импульс, или, на самом деле, четырехмилливольтный импульс. Ладно, вот и все. Хорошо.

Теперь опускаем мембранный потенциал минус 80, отменяем быструю переходную стрелу. Теперь мы перейдем ко всей камере. Я собираюсь применять мягкое отсасывание и пытаться пойти оптом.

Эти зарядные переходные процессы указывают на то, что он, что пипетка и ячейка теперь непрерывны, что у него есть оптовая запись. Это еще один прекрасный снимок. Итак, более светлый красный цвет там был следом емкости, и вы можете видеть, что произошел внезапный скачок, а затем он уменьшился.

Хорошо, я только что показал вам основные методы получения записей с пресинаптического терминала, поддерживаемого чашечкой. Я показал вам, как получить срезы, содержащие медиальное ядро трапециевидного тела. Именно там вы найдете чашечки, которые держались.

И я показал вам техники просмотра срезов. Вы пройдетесь по каждому из срезов, ища срез, на котором находится наибольшее количество кали на поверхности. Затем вы будете искать самую большую калиновую мембрану, которую сможете найти, и наклеить на нее зажимную пластинку.

И я также показал вам техники записи патч-клэмпа, и они являются стандартными техниками записи патч-клэмпа.