Пассирования правам нервные стволовые клетки

Привет, меня зовут Стив. Я работаю в лаборатории доктора Фланагана на кафедре патологии в Калифорнийском университете в Ирвине. Сегодня я покажу вам, как разделить человеческие нейронные клетки-предшественники.

Этот метод включает в себя кодирование новой колбы раствором человеческого фибронектина, снятие клеток с помощью буфера для диссоциации клеток, затем нейтрализацию буфера для диссоциации клеток с помощью 10% раствора сыворотки, центрирование клеточной суспензии и суспензию клеток в свежей среде, а также перенос клеточной суспензии в новую колбу. В нашей лаборатории мы культивируем человеческие нейронные клетки-предшественники, меняя половину их среды через день, и мы пропускаем их примерно раз в неделю, разделяя одну на две. Когда я прохожу через клетки, я могу пересчитать их, если хочу обменять их на эксперимент по иммунохимии или если я хочу сделать трансфекцию ядерным эффектором.

Важно использовать буфер для диссоциации клеток при упаковке клеток, потому что, во-первых, он не ферментативный, в отличие от трипсина, и гораздо мягче воздействует на клетки. Здравствуйте, мы сейчас в комнате для культивирования тканей, и прежде чем я покажу вам, как выглядит колба с человеческими клетками-предшественниками, сначала я подготовлю культуру ткани. Во-первых, я собираюсь выключить ультрафиолетовый свет и включить свет и поток воздуха.

Далее я собираюсь продезинфицировать вытяжку 70% этанолом, распылив бумажное полотенце и протерев капот. Важно распылять на бумажное полотенце 70% этанола, а не непосредственно на внутреннюю часть вытяжки, потому что распыление 70% этанола может повредить фильтр HEPA, что очень дорого. Далее я собираюсь распылить все реактивы и инструменты.

И, наконец, я собираюсь распылить вакуумные шланги, и все готово. Давайте рассмотрим эти клетки. Таким образом, эти клетки выглядят примерно на 80% сливающимися.

Это человеческие нервные клетки-предшественники, выделенные из человеческих плодов, и мы выращиваем их в колбах с Т-25. Мы делим их примерно каждую неделю, по одному-два. Теперь я готов к прохождению своих клеток.

И сначала я собираюсь принести новую колбу T 25, которую я покрывал в течение четырех часов человеческим фибронектином от BD biosciences. Поэтому я удалил раствор фибронектина. Я собираюсь промыть эту колбу BBS, прежде чем переместить ячейки в колбу.

И теперь я собираюсь вытащить клетки из инкубатора с температурой 37 градусов. Вот они. Теперь я собираюсь удалить раствор для промывки PBS из новой колбы, которая была покрыта человеческим фибронектином.

И я собираюсь добавить два миллилитра старой кондиционированной среды в новую колбу. Так что теперь мне нужно промыть свои клетки PBS, прежде чем я смогу снять его с поверхности. Итак, сначала я собираюсь удалить оставшуюся среду, добавить около двух мил PBS сразу, не смачивая клетки и не пересушивая.

Я собираюсь подождать около двух минут, прежде чем удалить PBS и ввести в продажу буфер диссоциации, чтобы снять продажи с поверхности зенитной артиллерии. Теперь я собираюсь удалить PBS, и снова я попытаюсь сразу добавить буфер для диссоциации клеток, чтобы клетки не высыхали. Итак, я собираюсь добавить 1,5 мил буфера диссоциации клеток.

И в отличие от PBS, я собираюсь добавить его непосредственно на ячейки и постараюсь охватить как можно большую площадь. Итак, я двигаю колбу из стороны в сторону, медленно добавляя этот буфер на ячейки. И я собираюсь подождать около пяти минут, пока клетки начнут отрываться от поверхности.

А колбу при комнатной температуре я оставлю в вытяжке. Как вы можете видеть здесь, клетки сначала начинают округляться вверх, а затем они начинают отрываться от поверхности, и вы можете видеть, как некоторые, некоторые клетки уже плавают. И если вы широко постучите по колбе сбоку, это поможет им оторваться.

Итак, прошло пять минут, и, как вы можете видеть, раствор стал очень плотным с клетками, которые оторвались от поверхности. И теперь я собираюсь нейтрализовать эффект буфера для диссоциации клеток, добавив 4,5 мил среды, содержащей сыворотку. Итак, я собираюсь использовать 10% инактивированную при нагревании фетальную бычью сыворотку в среде D-M-E-M-F 12, и я собираюсь добавить ее прямо на поверхность колбы, чтобы убедиться, что в ней не осталось прикрепленных клеток.

И я собираюсь, и я собираюсь аккуратно пипетировать вверх и вниз, чтобы удалить все оставшиеся клетки. А затем я собираюсь перенести раствор ячейки в коническую трубку диаметром 15 мил. И я собираюсь вращать его со скоростью тысяча оборотов в минуту в течение одной минуты.

Итак, ячейки вращаются, и у нас есть прекрасная палитра для ячеек. Я собираюсь удалить сыворотку очень, очень осторожно, не пытаясь потревожить палитру. А затем я собираюсь снова подвесить поддон в четырех миллионах носителей.

Поэтому я попробую ресуспендировать гранулу так, чтобы не осталось клеточных комков, чтобы раствор стал однородным и не содержал, не содержал комков. И поскольку я делаю разделение на один-два, я собираюсь взять две из четырех мельниц и перенести их в новую колбу, которая уже содержит два мила кондиционированной среды. И, наконец, я собираюсь пометить колбу с указанием типа ячейки, номера прохода и даты.

Это взгляд на камеры, которые мы прошли полчаса назад. И, как вы можете видеть, большинство из них прикрепились к поверхности и начали отрабатывать процессы. Вот и все, ребята.

И теперь я готов считать.